RNAi沉默中期因子基因表达对胃癌细胞黏附和侵袭力的影响

目的:探讨中期因子(midkine,MK)基因小干扰RNA对胃癌细胞生物学行为的影响.方法:培养人胃癌BGC-823、HGC-27、MGC-803及SGC-7901细胞株,以荧光实时定量PCR方法检测中期因子基因mRNA表达;筛选出中期因子表达最高者.采用中期因子基因小干扰RNA转染胃癌细胞株,分别以荧光实时定量PCR和免疫荧光方法观察中期因子基因mRNA和蛋白水平,然后以四唑蓝(MTT)比色法检测细胞黏附性,以Boyden方法检测癌细胞侵袭力.结果:4株胃癌细胞中,中期因子均有不同程度的表达,以胃癌BGC-823细胞最高;以MK siRNA转染胃癌BGC-823细胞后,癌细胞中期因子基因mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性;转染组细胞黏附数量明显下降,细胞侵袭力明显下降.结论:中期因子基因在胃癌细胞黏附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染胃癌细胞,可抑制胃癌细胞黏附和侵袭能力.     

siRNA抑制Ki-67表达对乳腺癌MCF-7／ADR细胞阿霉素耐药性的研究

目的采用Ki-67RNA表达载体干扰沉默Ki-67基因,检测其对乳腺癌MCF-7／ADR细胞株耐-67mRNA及蛋白表达的影响,观察沉默艇-67基因前后乳腺癌细胞株对阿霉素敏感性改变。方法体外合成靶向艇-67siRNA表达载体,应用脂质体法瞬时转染尉-67高表达的乳腺癌细胞株MCF-7／ADR,应用RT-PCR和Western印迹法检测转染后Ki-67mRNA及蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖活性及转染前后细胞对阿霉素敏感性的变化。结果Ki-67siRNA载体转染后24h可显著抑制乳腺癌MCF-7／ADR细胞株的Ki-67mRNA和蛋白表达及细胞的增殖活性。Ki-67siRNA组阿霉素IC50值为（6．3±0．9）μg/ml。结论si—Ki-67能够有效抑制Ki-67基因的表达,降低乳腺癌细胞的增殖能力,沉默Ki-67表达能部分逆转阿霉素耐药现象。     

钙信号对乳腺癌细胞HIF-1α表达及侵袭转移能力的影响

目的：探讨低氧条件下钙信号对乳腺癌细胞HIF-1α表达及其侵袭转移能力的影响．方法：在培养基中加入150μmol/L CoCl2模拟化学缺氧;将实验分成对照组、CoCl2组、CoCl2和钙通道阻滞剂维拉帕米（verapamil,VPL）组．用逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）检测各组中HIF-1α的mRNA水平;蛋白印迹实验和免疫细胞化学检测乳腺癌细胞MCF-7和MDA—MB-231中HIF-1α蛋白的表达;Millicell小室人工重组基底膜侵袭迁移实验检测各实验组中细胞侵袭迁移能力的改变．结果：两株细胞各实验组都存在HIF-1α的mRNA转录和蛋白的表达,CoCl2组HIF-1α mRNA水平和蛋白水平较对照组显著增高（P〈0．01）,加VPL干预后,HIF-1α mRNA水平和蛋白水平都大大降低（P〈0．01）,MCF-7和MDA—MB-231间有显著差异（P〈0．01）;两株细胞的侵袭迁移能力VPL＋CoCl2组较CoCl2组明显降低（P〈0．05）,MDA—MB-231更明显（P〈0．01）．结论：阻断钙信号转导途径可以使HIF-1α的表达下调,进而抑制乳腺癌细胞的侵袭转移能力．     

靶向干扰CDK2AP1对乳腺癌MCF-7细胞体外迁移和侵袭的影响

目的：探讨靶向干扰细胞周期调节蛋白依赖性激酶2-关联蛋白-1（CDK2AP1）对乳腺癌MCF-7细胞体外迁移和侵袭的影响。方法构建重组慢病毒 pGCLV- CDK2AP1- shRNA及重组空病毒pGCLV- GFP,分别稳定转染乳腺癌细胞系MCF-7,获得乳腺癌细胞株 MCF-7/RNAi- NC 和 MCF-7/RNAi- CDK2AP1。采用定量 PCR 法检测两组 MCF-7细胞株的CDK2AP1mRNA表达,xCELLigence/RT- CIM实时细胞电子分析系统检测细胞迁移能力,Transwel 实验检测细胞的侵袭能力。结果成功构建乳腺癌细胞株MCF-7/RNAi- NC和MCF-7/RNAi- CDK2AP1,相比MCF-7/RNAi- NC细胞组,MCF-7/RNAi- CDK2AP1细胞组的CDK2AP1mRNA表达受到明显抑制,其细胞迁移和侵袭能力均显著下降（P＜0.05）。结论乳腺癌细胞MCF-7中CDK2AP1低表达能有效抑制细胞的体外迁移和侵袭能力。     

SHP-1对人乳腺癌MCF-7细胞侵袭的影响及机制初步探讨

目的探讨SHP-1对人乳腺癌细胞株MCF-7侵袭能力的影响。方法 MCF-7细胞株分别瞬时转染SHP-1的特异性siRNA干扰序列;然后分别通过RT-PCR和Western-blot检测MCF-7细胞干扰前后SHP-1基因和蛋白表达变化,并通过RT-PCR检测干扰前后MMP-9基因变化;通过Transwell小室实验检测干扰SHP-1对细胞侵袭能力的影响。结果 RT-PCR和Western-blot证实SHP-1在人乳腺癌细胞株MCF-7中有表达以及SHP-1SiRNA的干扰效率;干扰SHP-1后,MMP-9的表达量上调;Transwell小室实验证实,与MCF-7阴性干扰对照及空白对照细胞相比,siRNA组的侵袭能力显著增强(P<0.001)。结论乳腺癌MCF-7中SHP-1的表达水平高低和该细胞侵袭能力高低呈负相关,其侵袭可能和MMP-9的表达呈正相关。     

BRG1对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响及其分子机制探讨

目的探讨沉默BRG1基因对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响及其分子机制。方法体外化学合成BRG1小干扰RNA（siRNA）和Control siRNA（si—Ctr1）,脂质体介导转染乳腺癌MDA—MB-231和BT-549细胞,Transwell迁移实验和侵袭实验观察沉默BRG1基因对2种乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响,明胶酶谱实验检测基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）变化,Westernblot检测基质金属蛋白酶组织抑制因子-2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2,TIMP-2）及MMP-2蛋白表达。结果转染BRG1 siRNA可以有效减少乳腺癌MDA—MB-231和BT-549细胞BRG1的表达,细胞迁移和侵袭能力下降。BRG1沉默后TIMP-2表达升高,MMP-2表达下降且酶活性降低。结论BRG1沉默后通过上调TIMP-2抑制MMP-2的表达,破坏TIMP-2／MMP-2平衡,最终抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭能力。     

恢复野生型PTEN基因表达对炎性乳腺癌MDA-MB-468体外生物学行为的影响

目的研究野生型PTEN基因转染对人炎性乳腺癌MDA—MB-468细胞体外生物学行为的影响及机制。方法应用基因重组技术构建重组质粒pcDNA3．1-PTEN，用脂质体转染乳腺癌细胞株MDA—MB-468，用RT—PCR、免疫组化及免疫印迹方法分析目的基因及其蛋白表达，并用免疫印迹方法检测转染后，在表皮生长因子的诱导下，磷酸化蛋白激酶B（PKB／Akt）的表达，四甲基唑蓝（MTT）法分析细胞增殖。Annexin V—FITC和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果RT—PCR、免疫组化及免疫印迹显示pcDNA3．1-PTEN转染组有PTEN mRNA及其蛋白表达，且显示转染组在表皮生长因子的诱导下，p-Akt蛋白表达下调。MTT检测表明pcDNA3．1-PTEN转染组活细胞数较其它各组均低（P〈0．01），流式细胞分析其凋亡率达21．68％。结论野生型PTEN基因依赖其磷酸酶活性可诱导乳腺癌MDA—MB-468细胞凋亡。     

Hsa_circ_0001946/miR-7/KLF4轴调控乳腺癌进展的研究

目的探讨环状RNAhsa_circ_0001946在乳腺癌组织中的表达情况及hsa_circ_0001946/miR-7/Kruppel样因子4（KLF4）轴调控乳腺癌细胞发生侵袭和转移的机制。方法收集2018年6月至2019年8月在温州医科大学附属第三医院切除的乳腺癌组织标本及其癌旁正常乳腺组织标本91例。采用实时荧光定量PCR法检测乳腺癌及其癌旁正常组织中hsa_circ_0001946、miR-7、KLF4mRNA表达情况及乳腺癌细胞株MCF-7中hsa_circ_0001946、miR-7、KLF4、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）mRNA表达情况;采用细胞侵袭实验分析乳腺癌MCF-7细胞株的侵袭能力;采用Westernblot法检测乳腺癌细胞株MCF-7中E-cadherin及N-cadherin蛋白表达情况。结果与癌旁正常乳腺组织比较,乳腺癌组织中hsa_circ_0001946和KLF4mRNA表达水平均升高,miR-7表达水平下降（均P＜0.05）。与正常乳腺组织、乳腺导管原位癌组织比较,乳腺浸润性导管癌组织中hsa_circ_0001946mRNA表达水平升高（均P＜0.05）。分析82例乳腺浸润性导管癌患者发现,有淋巴结转移者hsa_circ_0001946mRNA表达水平高于无淋巴结转移者（P＜0.05）。Pearson相关显示,乳腺癌组织中hsa_circ_0001946mRNA的表达与miR-7的表达呈负相关（r=-0.418,P＜0.05）,miR-7的表达与KLF4mRNAmRNA的表达呈负相关（r=-0.340,P＜0.05）。与阴性对照组相比,转染sh-hsa_circ_0001946组MCF-7细胞中miR-7表达升高,KLF4mRNA表达下降（均P＜0.05）;与阴性对照组相比,转染miR-7mimics组MCF-7细胞中KLF4mRNA表达下降（P＜0.05）;与阴性对照组相比,转染sh-hsa_circ_0001946组侵袭细胞数减少（P＜0.05）;与阴性对照组相比,转染KLF4siRNA组MCF-7细胞中E-cadherinmRNA及蛋白表达水平均升高,N-cadherinmRNA及蛋白表达水平均下降（均P＜0.05）。结论Hsa_circ_0001946在乳腺癌细胞中表达升高,可通过miR-7/KLF4调控轴使癌细胞发生上皮-间质转化,促进癌细胞的侵袭和转移。     

siRNA抑制Ki-67表达对乳腺癌MCF-7/ADR细胞阿霉素耐药性的研究

目的采用Ki-67 RNA表达载体干扰沉默Ki-67基因,检测其对乳腺癌MCF-7/ADR细胞株Ki-67 mRNA及蛋白表达的影响,观察沉默Ki-67基因前后乳腺癌细胞株对阿霉素敏感性改变。方法体外合成靶向Ki-67siRNA表达载体,应用脂质体法瞬时转染Ki-67高表达的乳腺癌细胞株MCF-7/ADR,应用RT-PCR和Western印迹法检测转染后Ki-67mRNA及蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖活性及转染前后细胞对阿霉素敏感性的变化。结果 Ki-67siRNA载体转染24h后可显著抑制乳腺癌MCF-7/ADR细胞株的Ki-67 mRNA、蛋白表达及增殖活性。Ki-67 siRNA组阿霉素IC₅₀值为（6.3±0.9）μg/ml。结论 Si-Ki-67能够有效抑制Ki-67基因的表达,降低乳腺癌细胞的增殖能力。沉默Ki-67表达能部分逆转阿霉素耐药现象。     

体外siRNA抑制乳腺癌细胞株端粒逆转录酶基因的表达

目的:筛选能高效抑制乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-453端粒逆转录酶(hTERT)基因表达的RNA干扰靶点,为乳腺癌的基因治疗提供依据.方法:构建针对hTERT基因的三种siRNA(siRNA-hTERT1,siRNA-hTERT2和siRNA-hTERT3),分别转导入乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-453.同时以无同源性的siRNA-hTERT4作阴性对照,含GFP基因的载体作阳性对照.应用实时聚合酶链反应(real-time PCR)和Western Blot技术检测siRNA处理前后hTERT基因表达变化;MTT法检测细胞生长率;流式细胞术分析基因沉默对细胞凋亡的影响.结果:与阴性对照组相比,siRNA-hTERT1,siRNA-hTERT2和siRNA-hTERT3三个实验组siRNA转染细胞后,hTERT的mRNA表达量下调至21%～40%,蛋白表达下降至50%,而三个实验组间差异无统计学意义(P>0.05).转染48 h后,MCF-7细胞抑制率分别为(57±4.3)%,(61±4.3)%,(65±6.0)%;MDA-MB-453细胞抑制率分别为(45±5.1)%,(45±4.1)%,(50±4.0)%.流式细胞仪检测结果显示,细胞凋亡率有所增加,MCF-7细胞为(18.90±0.11)%,(27.30-I-0.18)%,(27.00 4-0.16)%;MDA-MB-453细胞为(12.25 4-0.17)%,(17.80±0.19)%,(20.60 4-0.21)%.结论:经siRNA-hTERTl,siRNA-hTERT2,siRNA-hTERT3处理均可明显抑制MCF-7和MDA.MB-453乳腺癌细胞的增殖及hTERT基因的表达,能够明显促进细胞的凋亡.     

核糖核酸酶抑制因子与人乳腺癌细胞恶性增殖的相关性研究

目的:探讨核糖核酸酶抑制因子(ribonuclesae inhibitor,RI)的表达与人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、SKBR-3恶性增殖之间的关系。方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期分布,RT-PCR检测RI基因表达水平,细胞免疫化学技术检测RI蛋白表达情况。结果:人乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖速度、S期所占比例均小于人乳腺癌细胞MDA-MB-231、SKBR-3(P<0.05~P<0.01),且MCF-7细胞中RI基因表达水平、蛋白表达水平明显高于MDA-MB-231、SKBR-3细胞(P<0.01)。结论:RI与人乳腺癌细胞恶性增殖生长有一定的相关性。     

siRNA干扰整合素β4的表达对MDA-MB-231乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响

目的采用RNA干扰（Small interference RNA,siRNA）技术抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞中整合素β4（integrinβ4）基因表达,观察其对细胞侵袭和迁移能力的影响。方法选用MDA-MB-231乳腺癌细胞为研究对象,应用siRNA技术沉默癌细胞Integrinβ4 mRNA的表达,Real-time PCR和Western blotting方法分别检测未转染Integrinβ4 siRNA的乳腺癌细胞组（简称空白对照组）及转染Integrinβ4 siRNA的乳腺癌细胞组（简称Integrinβ4 RNA干扰组）的Integrinβ4 mRNA和蛋白表达水平;Transwell实验检测两组细胞的侵袭及迁移能力。结果与空白对照组相比,Integrinβ4 RNA干扰组Integrinβ4的mRNA及蛋白表达水平分别降低了86%（P〈0.01）和89%（P〈0.01）,细胞侵袭和迁移能力下降（P〈0.05）。结论应用siRNA干扰技术抑制Integrinβ4表达可使MDA-MB-231细胞迁移及侵袭能力降低,提示Integrinβ4在乳腺癌侵袭转移中发挥重要作用。     

非分泌型CXCL16在乳腺癌细胞系中的表达及对其生物学特性的影响

目的 通过检测非分泌型CXCL16在不同侵袭性乳腺癌细胞系(SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435S)及正常乳腺上皮细胞MCF-10A的表达,探讨非分泌型CXCL16表达对乳腺癌细胞生物学特性的影响。 方法 采用RT-PCR检测CXCL16 mRNA在MCF-10A、SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435S细胞系的表达,将pEGFP-CXCL16真核表达质粒转染到低表达CXCL16的MDA-MB-231细胞,通过实时荧光定量PCR和Western blot验证CXCL16过表达,采用体外迁移、侵袭实验及甲基四唑蓝(MTT)法分别检测过表达CXCL16对MDA-MB-231细胞迁移、侵袭和增殖活性的影响。 结果 CXCL16 mRNA在高侵袭性的MDA-MB-231细胞低表达,在低侵袭性的MCF-7细胞高表达,过表达CXCL16使得MDA-MB-231细胞的迁移、侵袭减弱,而增殖未受到影响。 结论 非分泌型CXCL16表达与乳腺癌细胞系的侵袭性相关,其表达可以抑制乳腺癌细胞的体外迁移、侵袭。     

富含亮氨酸重复序列蛋白 1 通过上调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白表达促进乳腺癌细胞迁移和侵袭

目的: 探究富含亮氨酸重复序列蛋白1（leucine-rich repeat protein 1, LRR1）在乳腺癌细胞中的表达及对其生物学功能的影响。方法: 培养人乳腺癌 MDA-MB-231、HCC70 细胞株和正常乳腺上皮MCF-10A细胞;采用蛋白免疫印迹法检测LRR1表达。将人乳腺癌 MDA-MB-231、HCC70 细胞株分为干扰对照组、LRR1干扰组、LRR1过表达组和空载体对照组,分别转染LRR1 对照、干扰、过表达、空载体序列;采用 Transwell 实验检测乳腺癌细胞迁移和侵袭能力;采用蛋白免疫印迹法检测细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, m-TOR）表达。结果: 与正常人乳腺上皮 MCF 10A 细胞相比,乳腺癌MDA-MB-231和HCC70细胞中LRR1表达水平显著增加（P均<0.01）。在人乳腺癌 MDA-MB-231、HCC70 细胞中,与干扰对照组相比,LRR1干扰组细胞迁移和侵袭数显著降低（P均<0.01）, m-TOR表达水平明显降低（P<0.01）;与空载体对照组相比,过表达 LRR1组细胞迁移和侵袭数显著增加（P均<0.01）,m-TOR 蛋白表达水平明显增加（P均<0.01）。结论: LRR1在乳腺癌细胞中呈高表达,并可促进其迁移和侵袭。     

RNA沉默Pin1表达对乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

目的应用RNA干扰技术沉默Pinl表达后,观察其对乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法采用脂质体介导法将Pinl干扰片段PinlsiRNA和对照片段controlsiRNA转染入乳腺癌细胞系MDA—MB一23l后,利用RT—PCR和Westernblot法检测Pinl基因在mRNA和蛋白水平的表达情况,并应用MTT法、Transwell法和AnnexinV—FITC／PI试剂盒及流式细胞仪技术分析检测Pinl对MDA—MB一23l细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。结果Pinl在乳腺癌细胞系中高表达。与未处理组及转染对照片段controlsiRNA组相比,沉默Pinl表达后,PinlmRNA（P〈0．05）和蛋白（P〈0．05）表达均明显下降,细胞生长增殖能力[P〉0．05（第1天）,P〈0．01（第2—4天）]减弱,细胞侵袭数目（6．61±0．53,P〈0．05）减少,细胞凋亡率（31．5％±3．06％,P〈0．05）显著增加。结论沉默Pinl表达后可抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭,促进乳腺癌细胞凋亡。     

ER-α36基因沉默对ER阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的作用及其影响

目的：探讨ER-α36基因与人雌激素受体（ ER）阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的内在联系。观察其对ER阴性乳腺癌细胞的影响。为探索ER阴性乳腺癌的基因治疗提供新的途径。方法利用RNAi技术,构建靶向ER-α36基因的短发夹状RNA（shRNA）重组质粒,脂质体法将pRNAT-U6.1/Neo-ER-α36导入雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,利用RT-PCR法检测MDA-MB-231细胞ER-α36基因表达的抑制情况;MTT法检测雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖情况。结果①PCR、酶切鉴定、DNA测序证实小干扰质粒构建成功,无碱基突变;②ER-α36-siRNA表达载体转染ER阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231可有效抑制ER-α36 mRNA表达（抑制效率＝86.3％）,P＜0.01;③MTT实验结果表明ER-α36沉默可有效抑制ER阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖,提示ER-α36参与MAPK/ERK信号转导通路调节细胞增殖。结论 ER-α36参与MAPK/ERK信号转导途径,与ER阴性乳腺癌的发生、发展关系密切。RNAi有效沉默ER-α36基因是ER阴性乳腺癌基因治疗的有效手段。ER-α36可能成为ER阴性乳腺癌基因治疗的新靶点。     

乳腺癌BAG-1基因表达与表皮生长因子受体表达的相关性

目的 探讨乳腺癌BAG-1基因表达与表皮生长因子受体（EGFR）表达的相关性。方法 培养乳腺癌细胞株,采用实时聚合酶链反应技术检测EGFR（＋）和EGFR（-）细胞株中BAG-1 m RNA的表达情况,West blot法检测其蛋白水平。分析BAG-1基因表达与EGFR表达的相关性。结果 MDA-MB-231、T47D细胞株EGFR m RNA和EGFR蛋白阳性表达,MCF-7、SLBP3细胞株EGFR m RNA和EGFR蛋白阴性表达。T47D细胞株BAG-1 m RNA的表达水平最高[（29.6±0.4）×10-4],其次为MDA-MB-231细胞株[（6.9±0.3）×10-4],两者的表达水平均显著高于MCF-7细胞株[（4.3±0.5）×10-4]、SKBR3细胞株[（0.3±0.1）×10-4],差异的有高度统计学意义（P〈0.01）。结论 BAG-1表达与EGFR存在相关性,可作为乳腺癌靶向治疗的潜在靶点。