肝细胞生长因子对转化生长因子诱导肾小管上皮细胞转分化的影响

目的应用转化生长因子β1(TGF-β1)诱导肾小管上皮细胞肌纤维母细胞转分化,研究肝细胞生长因子(HGF)对肾小管上皮细胞的表型重塑的作用和机制。方法在正常大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E细胞株)培养液中分别加入TGF-β1及HGF,应用倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞形态变化;免疫组织化学方法检测肌纤维母细胞特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;ELISA法分析测定培养细胞上清液中纤维连结蛋白(FN)的含量;RT-PCR检测结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达。结果1TGF-β1诱导肾小管上皮细胞从原有典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞样形态;α-SMA的表达、上清液FN含量、细胞CTGFmRNA表达明显增加(P<0.05)。2单纯HGF对细胞形态学、α-SMA的表达及FN含量与空白对照组无明显影响;不同浓度HGF组的CTGFmRNA表达较空白对照组均增加(P<0.05)。3HGF能抑制TGF-β1诱导的NRK52E细胞形态学改变;α-SMA的表达、FN水平均比诱导组TGF-β1明显下降(P<0.05);HGF抑制了TGF-β1诱导的CT-GFmRNA表达(P<0.05)。结论HGF能够负性调控TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞肌纤维母细胞转分化作用,减少FN分泌;HGF对TEMT的负性调节作用可能是通过减少CTGF表达来实现的。     

人骨髓间充质干细胞分泌的外泌体调控恶性胶质瘤相关巨噬细胞的极化

  目的  探究人骨髓间充质干细胞分泌的外泌体对肿瘤相关巨噬细胞极化的影响，并初步探讨其对胶质瘤发生发展的影响。  方法  利用试剂盒提取人骨髓间充质干细胞分泌的外泌体，通过扫描电镜及Western blot 鉴定外泌体。将胶质瘤细胞分为SHG449:SHG449细胞不做特殊处理；SHG449+M0组:SHG449细胞与M0型巨噬细胞共培养；SHG449+M0+exosome组:SHG449细胞与M0型巨噬细胞共培养后，加入标记有PKH-67的外泌体使其进入M0型巨噬细胞。  结果  （1）人骨髓间充质干细胞分泌的外泌体成功提取，且进入M0型巨噬细胞；（2）外泌体进入胶质瘤细胞SHG449诱导极化的巨噬细胞后细胞形态转化，且M2型巨噬细胞活化标志物Arginase、CD206以及CCL22，TGF-β表达下降（Arginase:P < 0.01，CD206:P < 0.05， CCL22:P < 0.05，TGF-β:P < 0.01），M1型活化标志物iNOS，CD68以及IL-1β，TNF-α表达上升（iNOS:P < 0.01，CD68:P < 0.01，L-1β:P < 0.000 1，TNF-α:P < 0.001）；（3）被外泌体诱导极化的巨噬细胞导致胶质瘤细胞增殖能力下降（P < 0.05），凋亡能力上升（P < 0.000 1）。  结论  人骨髓间质细胞分泌的外泌体可抑制肿瘤相关巨噬细胞向M2表型转化，并诱导其向M1表型转化，调节肿瘤免疫微环境，从而达到抑癌的作用。     

霉酚酸酯对糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

目的探讨霉酚酸酯(MMF)对糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响及其可能机制。方法雄性SD大鼠28只,随机选取8只作为正常对照组(N组),其余20只注射链脲佐菌素(STZ)制作糖尿病模型,并随机分为糖尿病组(DM组)、霉酚酸酯组(M组)。12周后测量大鼠血糖、体质量、肾质量/体质量、24 h尿蛋白定量、血肌酐(SCr),观察肾小管间质病理形态学变化,应用免疫组化技术和Western blot检测肾组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及转化生长因子β1(TGF-β1)的表达。结果 DM组血糖、肾质量/体质量、24 h尿蛋白定量、血SCr、肾小管-间质损伤指数(TII)均明显高于N组(P<0.01),M组除血糖、体质量外(P>0.05),其余指标均明显低于DM组(P<0.01);免疫组化结果显示,DM组肾小管上皮细胞胞浆中α-SMA、TGF-β1表达均明显高于N组(P<0.01),M组明显低于DM组(P<0.01);Western blot结果显示,DM组肾组织α-SMA、TGF-β1表达较N组分别增加3.4倍与1.1倍,M组肾组织α-SMA、TGF-β1表达较DM组分别下降55%与40%。结论 MMF能下调糖尿病大鼠肾小管上皮细胞α-SMA、TGF-β1的表达,抑制肾小管上皮细胞转分化,起到肾脏保护作用。     

Basigin/CD147参与马兜铃酸损伤人肾小管上皮细胞的体外实验

目的:探讨马兜铃酸(AA)对人肾小管上皮细胞损伤机制及细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(Basigin/CD147)在损伤过程中发挥的作用。方法:不同浓度AA(10、20、40μg/ml)作用于人近端肾小管上皮细胞(HK-2)不同时间(24、48 h)后,MTT比色法检测细胞增殖变化;Basigin/CD147干扰质粒转染HK-2,选取AA最适浓度(20μg/ml),ELISA法检测不同时间段(24、48 h)细胞上清液中转化生长因子-β1(TGF-β1)含量;实时定量(Real-time)PCR法检测Basigin/CD147 mRNA表达;Western印迹检测Basigin/CD147、TGF-β1和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达。结果:AA 48 h组TGF-β1含量显著高于空白组(P0.05),siRNA+AA 48 h组TGF-β1低于48 h AA组(P0.05);AA48 h组Basigin/CD147 mRNA含量显著高于空白组(P0.05),siRNA+AA 48 h组Basigin/CD147 mRNA显著低于48 h AA组(P0.05);AA 48 h组Basigin/CD147、α-SMA、TGF-β1蛋白表达明显高于空白组(P0.05),siRNA+AA 48 h组Basigin/CD147、α-SMA、TGF-β1蛋白表达均显著低于48 h AA组(P0.01)。结论:Basigin/CD147参与介导AA所致HK-2细胞损伤过程,干扰Basigin/CD147表达可能抑制AA引起的细胞纤维化;Basigin/CD147蛋白表达调控异常可能是引起马兜铃酸肾病的重要发病机制之一。     

间歇性高糖对大鼠肾小管上皮细胞NRK-52EA转分化的影响

目的:探讨间歇性高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞株NRK-52EA转分化干预作用。方法:NRK-52E细胞分为空白组、正常葡萄糖组、高糖组、间歇性高糖组,分别作用72 h后,Western blot检测转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶-2(MMP-2)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及甲状旁腺素相关肽(PTHrP)的表达;CM2H2DCFDA试剂盒检测活性氧(ROS)含量。结果:高糖组及间歇性高糖组NRK-52E细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表达均上调;间歇性高糖组TGF-β1、MMP2以及α-SMA表达水平较高糖组高(P均<0.05),其ROS含量也显著高于高糖组(P<0.01)。结论:间歇性高糖能通过氧化应激诱导肾小管导管上皮细胞表达TGF-β1、MMP2,并促进NRK-52EA细胞转分化为α-SMA细胞。     

白藜芦醇通过巨噬细胞源性外泌体调节肝星状细胞活化对肝纤维化的影响

目的：探讨白藜芦醇（RSV）通过调节巨噬细胞影响肝星状细胞活化的机制。方法：以超速离心法提取空白组（NC-E组）和RSV处理（RSV-E）组外泌体并进行鉴定。将NC-E组及RSV-E组外泌体与转化生长因子-β1(TGF-β1)活化的肝星状细胞JS-1共培养，分为对照组、TGF-β1活化组（TGF-β1组）、NC-E+TGF-β1活化组（NC-E+TGF-β1组）和RSV-E+TGF-β1活化组（RSV-E+TGF-β1组）。采用免疫荧光法、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、western blotting检测肌动蛋白A(α-SMA)和Ⅰ型胶原a1链（Col1a1）纤维化指标表达。Western blotting检测Beclin1和LC3 Ⅰ/Ⅱ自噬相关指标表达。结果：与对照组相比，TGF-β1组α-SMA、Col1a1、Beclin1和LC3 Ⅰ/Ⅱ表达水平升高（P<0.05）；与TGF-β1组相比，RSV-E+TGF-β1组α-SMA、Col1a1、Beclin1和LC3 Ⅰ/Ⅱ表达水平下降（P<0.05）,NC-E+TGF-β1组与TGF-β1组差异无统计学意义（P...     

反义α肌动蛋白基因腺病毒载体对TGF-β1刺激的肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 观察大鼠血管平滑肌α肌动蛋白基因反义腺病毒载体(pAdanti-α-SMA)转染对转化生长因子β1(TGF-β1)所诱导的肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化(TEMT)的影响.方法 pAdanti-α-SMA载体构建并鉴定,转染肾小管上皮细胞(TEC)后免疫荧光染色和Western blot检测α-SMA水平.实验分为5组,A组:正常肾小管上皮细胞(TEC,对照组);B组:TEC 2 μl pAdanti-α-SMA;C组:TEC 1 μg天然TGF-β1;D组:TEC 1 μg天然TGF-β1 2 μl pAdanti-α-SMA;E组:TEC 1 μg天然TGF-β1 10 μl pAdanti-α-SMA.结果 成功构建pAdanti-α-SMA,pAdanti-α-SMA转染TEC后抑制了TGF-β1诱导的TEC 的α-SMA水平并呈剂量依赖性.结论 pAdanti-α-SMA可有效地抑制肾小管上皮细胞的肌成纤维细胞转分化.     

氯沙坦抑制高糖及间歇性高糖诱导NRK-52E细胞的转分化作用

目的 探讨氯沙坦对高糖及间歇性高糖诱导大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E转分化的抑制作用。方法 实验分为空白组(0 mmol/L葡萄糖)、正常葡萄糖组(5 mmol/L葡萄糖)、高糖干预组(25 mmol/L葡萄糖)、间歇性高糖干预组(5 mmol/L葡萄糖/25 mmol/L葡萄糖交替)、氯沙坦干预组(10 μmol/L氯沙坦)、氯沙坦高糖干预组(10 μmol/L氯沙坦预处理后再高糖培养)、氯沙坦间歇性高糖干预组(10 μmol/L氯沙坦预处理后再间歇性高糖培养), 根据分组对NRK-52E细胞施加相应因素作用72 h后, 蛋白免疫印迹法检测转分化标志物转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶2(MMP-2)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及甲状旁腺素相关肽(PTHrP)在细胞中的表达, CM2H2DCFDA试剂盒检测细胞ROS含量。结果 高糖干预及间歇性高糖干预组TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP-2、α-SMA和PTHrP表达上调, ROS含量明显上升, 间歇性高糖作用更显著。应用氯沙坦干预后可以部分下调高糖或间歇性高糖诱导的TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP-2、α-SMA以及PTHrP表达, 降低细胞ROS含量。结论 氯沙坦可抑制高糖及间歇性高糖诱导的NRK-52E细胞转分化作用。     

晚期糖基化终产物对高糖诱导NRK-52E细胞的转分化作用

目的：探讨晚期糖基化终产物（AGEs）对高糖诱导大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E的转分化干预作用。方法：大鼠肾小管导管上皮细胞株设空白组（不给葡萄糖）、高糖组（25mmol/L葡萄糖）、AGEs干预组（100mg/LAGEs）、高糖AGEs干预组（100mg/LAGEs＋25mmol/L葡萄糖）,培养72h后,用Westernbolt检测转化因子β1（TGF-β1）、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶2（MMP2）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及甲状旁腺素相关肽（PTHrP）在NRK-52E细胞的表达,活性氧（ROS）含量应用CM2H2DCFDA试剂盒检测。结果：高浓度葡萄糖上调TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表达,AGEs显著上调高浓度葡萄糖状态下TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA和PTHrP表达,提高ROS含量。结论：AGEs可以促进高浓度葡萄糖诱导肾小管导管上皮细胞转分化。     

衰老表型肝细胞外泌体对脂多糖致炎软骨细胞的影响及白芍的干预效应

目的  研究衰老表型的肝细胞外泌体对脂多糖(LPS)刺激软骨细胞的影响及白芍的干预效应。方法  提取小鼠肝原代细胞,CCK-8法筛选白芍水煎液干预肝细胞的最佳浓度。随后,肝细胞随机分为空白组、衰老组和白芍组,0.3 mmol·L-1过氧化氢诱导肝细胞衰老,检测肝细胞p16、p21、p53的基因和蛋白表达,观察肝细胞衰老及白芍的干预效应。分别提取各组肝细胞上清中的外泌体,通过电镜、粒径分析、四旋蛋白CD9、CD63、CD81鉴定外泌体。培养小鼠软骨细胞,LPS刺激以模拟KOA炎症环境,检测细胞上清液中TNF-α和IL-1β含量以验证造模成功。PHK67染色标记肝细胞外泌体并观察软骨细胞的摄入情况。将收集的各组肝细胞外泌体用于干预LPS致炎软骨细胞,检测软骨细胞基质降解合成标记物MMP3、MMP13、SOX9、ADAMTS5的基因和蛋白表达水平。结果  经CCK-8法筛选,100 μg·mL-1为白芍水煎液干预肝细胞的最佳浓度。过氧化氢干预后,衰老组中细胞衰老标记物p16、p21、p53的基因和蛋白表达均高于正常组(P < 0.05),而在白芍组则较衰老组降低(P < 0.05)。各组肝细胞所收集外泌体均呈现双层膜结构,形态大小无差异,粒径富集均满足40~120 nm区间,代表性粒径富集于116.8 nm,丰度98%,外泌体标记物四旋蛋白CD9、CD63、CD81均为阳性表达。软骨细胞上清液中,促炎因子TNF-α、IL-1β的含量均在LPS刺激后较刺激前升高(P < 0.01),PHK67染色试剂确认软骨细胞对各组肝细胞外泌体的摄入。衰老组肝细胞外泌体的干预下,软骨细胞基质降解合成标记物MMP3、MMP13、SOX9、ADAMTS5的基因和蛋白表达水平均较空白组肝细胞外泌体干预升高(P < 0.05),而白芍组肝细胞外泌体干预则较衰老组肝细胞外泌体干预降低(P < 0.05)。结论  衰老表型肝细胞外泌体可加剧LPS致炎软骨细胞的退变进程,白芍水煎剂对此环节存在良性干预。      

银杏叶提取物对TGF β1诱导α-SMA和Ⅰ型胶原表达的抑制作用

目的探讨银杏叶提取物(EGb)对转化生长因子(TGF-β1)诱导肾纤维化相关细胞因子及细胞外基质表达的影响。方法体外培养的人肾小管上皮细胞(HKC)分为正常对照组(无药物处理)、单纯TGF-β1(8 ng/mL)处理组和TGF-β1(8 ng/mL)与不同浓度EGb(25、50、100、150 mg/L)共刺激组。各组HKC经不同处理72 h后,细胞免疫组化ABC法检测α-SMA表达,实时定量PCR和Western blotting法检测I型胶原表达。结果与正常对照组比较,单纯TGF-β1处理组HKC中α-SMA和Ⅰ型胶原表达明显上调;与单纯TGF-β1处理组比较,TGF-β1与不同浓度EGb共刺激组HKC中α-SMA和I型胶原表达呈剂量依赖性减少。结论银杏叶提取物可抑制TGF-β1诱导的HKC中α-SMA和I型胶原表达,其机制可能与银杏叶提取物抑制肾小管上皮细胞转分化发生有关。     

绞股蓝总皂苷调节THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇平衡的作用机制

[目的]通过体外实验研究绞股蓝总皂苷调节THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇平衡的作用机制。[方法]采用体外培养人THP-1巨噬细胞,以氧化低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)诱导THP-1巨噬细胞泡沫化为模型,用绞股蓝总皂苷进行干预。通过油红O染色观察细胞内脂质堆积情况和酶比色法定量检测细胞内总胆固醇(TC)和胆固醇酯(CE)的变化,并利用RT-PCR方法检测CD36、ABCA1、LXR-α、PPAR-α受体mRNA表达。[结果]与ox-LDL诱导组相比,绞股蓝总皂苷组(GPS组)巨噬细胞的油红O染色阳性细胞数和细胞内脂质含量均显著减少,同时CD36受体mRNA表达明显降低,而ABCA1、LXR-α、PPAR-α受体mRNA表达明显升高。[结论]绞股蓝总皂苷可抑制ox-LDL诱导的THP-1巨噬细胞泡沫化,降低细胞内脂质积累,促进细胞内的脂质向细胞外转运,有利于防止泡沫细胞的形成及动脉粥样硬化的进程。该作用可能与绞股蓝总皂苷下调巨噬细胞CD36受体表达,上调巨噬细胞ABCA1、LXR-α、PPAR-α受体表达从而减弱巨噬细胞对ox-LDL的摄取和促进...     

子痫前期蜕膜巨噬细胞源性外泌体来源miR-146a-5p通过靶向HIF1α抑制滋养细胞的活力和侵袭能力

目的：探究蜕膜巨噬细胞源性外泌体miR-146a-5p对子痫前期滋养细胞的作用及其分子机制。方法：收集子痫前期（preeclampsia,PE）患者和正常妊娠女性蜕膜组织，使用密度梯度法与流式细胞术分选获得巨噬细胞，提取蜕膜巨噬细胞源性外泌体；为了鉴定外泌体，采用透射电镜观察结构，western blot验证外泌体CD63蛋白表达；采用CCK-8检测外泌体对滋养细胞活力的影响；Transwell实验检测滋养细胞迁移变化；qPCR检测外泌体中miR-146a-5p的表达；western blot检测滋养细胞中HIF1α蛋白表达；双荧光素酶报告基因检测miR-146a-5p与HIF1α是否存在结合位点。结果：巨噬细胞外泌体呈现直径约30～130 nm的中间凹陷“饼状”结构形态，CD63高表达，符合外泌体特征。与正常组相比，PE组蜕膜巨噬细胞源性外泌体显著降低滋养细胞增殖与迁移（P<0.001）。PE组蜕膜巨噬细胞源性外泌体中miR-146a-5p表达量显著下降，蜕膜巨噬细胞源性外泌体处理滋养细胞后滋养细胞中HIF1α蛋白表达显著升高，miR-146a-5p和HIF1α之间存在靶向结合...     

马兜铃酸Ⅰ诱导人肾小管上皮细胞转分化机制的初步探讨

目的:探讨马兜铃酸Ⅰ(aristolochic acid Ⅰ,AAI)诱导体外培养的人肾小管上皮细胞株(HK-2)转分化的可能机制.方法:将HK-2细胞分为对照组和AAI组,两组细胞分别培养24h、48h、72h.应用倒置相差显微镜观察HK-2细胞形态学变化;免疫组织化学方法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle acfin,α-SMA)的表达;ELISA法定量检测上清液中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表达;逆转录-聚合酶反应(RT-PCR)检测结缔组织生长因子(connection tissue growth factor,CTGF)mRNA的水平变化.结果:20μg/ml的AAI可诱导HK-2细胞肥大、拉长呈梭形,TGF-β1分泌增加,CTGFmRNA合成增加,α-SMA表达增强.这些作用呈一定的时间依赖性.结论:AAⅠ可诱导肾小管上皮细胞转分化,可能与TGF-β1分泌增多有关,而TGF-β1可能通过下游CTGF发挥生物学效应.     

发酵红参总皂苷对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞间充质转化的抑制作用及其机制

目的 探讨发酵红参总皂苷（FRGTS）对高糖诱导下肾小管上皮细胞发生上皮细胞-间充质转化（EMT）的抑制作用,并阐明其作用机制。 方法 将大鼠肾小管上皮NRK-52E细胞分为正常对照组（5.5 mmol·L^－1 D-葡萄糖）、高糖组（30.0 mmol·L^－1 D-葡萄糖）、沉默信息调节因子1（SIRT1）抑制剂EX527组（30.0 mmol·L^－1 D-葡萄糖＋10.0 μmol·L^－1.EX527）、FRGTS组（30.0 mmol·L^－1 D-葡萄糖＋25 mg·L^－1FRGTS）和EX527+FRGTS组（30.0 mmol·L^－1 D-葡萄糖＋10 μmol·L^－1 EX527＋25 mg·L^－1FRGTS）。采用免疫荧光法检测各组细胞中E-钙黏蛋白（E-cadherin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白表达水平,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞中E-cadherin、α-SMA和SIRT1 mRNA表达水平,ELISA法检测培养上清液中Ⅰ型胶原（ColⅠ）水平,Western blotting 法检测各组细胞中SIRT1、转化生长因子β1（TGF-β1）和Smad3 蛋白表达水平。 结果 高糖培养48 h后,与正常对照组比较,高糖组NRK-52E细胞中E-cadherin 蛋白表达水平和mRNA表达水平降低（P<0.01）,α-SMA 蛋白表达水平和mRNA表达水平升高（P<0.01）,NRK-52E细胞上清液中ColⅠ水平升高（P<0.01）,SIRT1 mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）,TGF-β1和Smad3蛋白表达水平升高（P<0.01）;与高糖组比较,FRGTS组NRK-52E细胞中E-cadherin mRNA表达水平升高（P<0.01）,α-SMA mRNA表达水平降低（P<0.05）,NRK-52E细胞上清液中ColⅠ水平降低（P<0.05）,SIRT1 mRNA和蛋白表达水平均升高（P<0.05或P<0.01）,TGF-β1和Smad3蛋白表达水平降低（P<0.05或P<0.01）;与FRGTS组比较,EX527+FRGTS组NRK-52E细胞中E-cadherin mRNA表达水平明显降低（P<0.01）,α-SMA mRNA表达水平明显升高（P<0.05）,NRK-52E细胞上清液中ColⅠ水平升高（P<0.05）,SIRT1 mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.01）,TGF-β1和Smad3蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。 结论 FRGTS可通过上调SIRT1表达,进而抑制TGF-β1/Smad信号通路,有效抑制肾小管上皮细胞发生EMT。     

糖肾方含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖作用及对TGF-β1、HO-1干预作用的研究

[目的]探讨糖肾方含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖作用及对转化生长因子（TGF）-β1、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、血红素氯合酶-1（HO-1）干预作用。[方法]制备小鼠含药血清;培养肾小管上皮细胞分为：空白对照组、高糖组（30 mmol/L葡萄糖）、空白血清组（30 mmol/L葡萄糖+10%空白血清）、糖肾方低剂量血清组（30 mmol/L葡萄糖+10%低剂量含药血清）、糖肾方高剂量血清组（30 mmol/L葡萄糖+10%高剂量含药血清）。使用4-甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测糖肾方含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖的影响。运用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测肾小管上皮细胞中TGF-β1、HO-1和α-SMA蛋白的表达。[结果]高糖诱导下,肾小管上皮细胞呈成纤维细胞样的长梭形,细胞核呈梭形改变。MTT检测：与空白组比较,高糖组光度值明显增高（P<0.05）;与高糖组比较,高低剂量含药血清组在培养24 h后吸光度值均有下降,吸光度差异有统计学意义（P<0.05）,且高剂量组光度值下降强于低剂量组（P<0.05）。Western blotting及RT-PCR测定实验结果显示：与空白对照组细胞对比,高糖组中TGF-β1、α-SMA含量增加;经过含药血清干预后,高糖诱导的HK-2细胞TGF-β1、α-SMA含量降低,差别有统计学意义（P<0.05）;糖肾方高、低剂量组血清比较,在降低TGF-β1方面,高剂量组效果较好（P<0.05）,在降低α-SMA方面没有统计学差异（P>0.05）。HO-1在高糖诱导后含量稍升高,与空白对照组对比,差异有统计学意义（P<0.05）;在经过糖肾方含药血清干预后,含量升高,与高糖组对比,差异有统计学意义（P<0.05）,糖肾方高低剂量组血清比较,升高HO-1含量方面没有统计学差异（P>0.05）。[结论]糖肾方通过抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖和干预TGF-β1、α-SMA、HO-1相关分子的表达,可以抑制细胞外基质成分沉积,减少氧化应激反应,减轻细胞损伤,逆转上皮-间质转分化,从而抑制肾间质纤维化,延缓糖尿病肾病病情进展。     

shRNA干扰β-catenin对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化的作用

目的构建特异性针对β-catenin基因的shRNA干扰载体,转染TGF-β1诱导的人近端肾小管上皮细胞株HKCs,研究其对肾小管上皮细胞转分化的影响。方法将构建的shRNA-β-catenin干扰载体转染TGF-β1诱导的HKC细胞,RT-PCR、Western blot检测β-catenin的mRNA及蛋白表达水平,筛选抑制效果最佳载体;RT-PCR、细胞免疫荧光、Western blot检测肾小管上皮细胞转分化相关蛋白E-cadherin、α-SMA的mRNA及蛋白表达水平。结果经酶切和测序鉴定,成功构建的shRNA-β-catenin表达载体转染HKC细胞,β-catenin在mRNA及蛋白表达水平均低于转染空白载体组(P<0.05),并筛选shRNA-β-catenin-1进入实验组;转染shRNA-β-catenin-1组细胞β-catenin在mRNA及蛋白表达水平均低于TGF-β1诱导组和空载体组(P<0.05),且β-catenin转核显著减弱(P<0.05);E-cadherin的mRNA及蛋白表达水平较TGF-β1诱导组和空载体组显著上调(P<0.05)、α-SMA的mRNA及蛋白表达水平较TGF-β1诱导组和空载体组显著下调(P<0.05)。结论运用shRNA-β-catenin干扰载体转染TGF-β1诱导的HKC细胞,能够抑制肾小管上皮细胞-间充质转分化。     

干扰素-γ对肾小管上皮细胞转分化的作用

目的 应用转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导肾小管上皮细胞肌纤维母细胞转分化(TEMT),研究干扰素-γ(IFN-γ)对肾小管上皮细胞的表型重塑的作用和机制.方法 将正常大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)分为空白组、诱导组(TGF-β13 ng/mL)、药物组(IFN-γ1000 IU/mL)及阻断组(TGF-β13 ng/mL IFN-γ200、400、600、1000、2000、3000 U/mL),培养72 h后,观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及结缔组织生长因子(CTGF)的表达;测量α-SMA阳性细胞百分数和平均荧光强度(MCF),α-SMA mRNA,CTGF mRNA的表达;并测定上清液中胶原Ⅲ的含量.结果 ①诱导组细胞转分化为肌成纤维细胞样细胞,α-SMA阳性细胞百分数及MCF均明显增加(P<0.05);α-SMA mRNA和CTGF mRNA表达也明显增加(P<0.05);胶原Ⅲ含量升高(P<0.05).②药物组的细胞形态、α-SMA mRNA、CTGF mRNA表达及胶原Ⅲ含量等与空白组的差异无统计学意义(P>0.05);⑨阻断组IFN-Υ明显抑制了TGF-β1诱导的转分化,且呈剂量依赖;并抑制胶原Ⅲ合成P<0.05.结论 IFN-Υ能够负性调控TGF-β1诱导的TEMT,减少胶原Ⅲ分泌;IFN-Υ对TEMT的负性词节作用可能是通过减少CTGF表达来实现的.     

NLRP3炎症小体在高糖诱导小鼠肾小管上皮细胞EMT中的作用

目的:观察NLRP3炎症小体在高糖诱导小鼠肾小管上皮细胞上皮间质转化(EMT)中的作用.方法:以小鼠肾小管上皮细胞为研究对象,高糖处理24 h后,采用real-time PCR法检测细胞表型标志分子(E钙粘素和α-SMA)和NLRP3炎症小体mRNA的表达,ELISA法检测细胞上清液中IL-1β含量.采用NLRP3炎症小体特异性抑制剂MCC950探讨NLRP3炎症小体在高糖诱导小鼠肾小管上皮细胞ETM中的作用.结果:高糖处理24 h可降低小鼠肾小管上皮细胞E钙粘素mRNA表达,上调α-SMA mRNA表达;同时上调NLRP3、pro-IL-1β和pro-caspase-1 mRNA表达,以及IL-1β分泌;抑制NLRP3炎症小体可部分逆转高糖诱导的小鼠肾小管上皮细胞EMT.结论:高糖应激可能通过激活NLRP3炎症小体促进IL-1β分泌诱导肾小管上皮细胞发生EMT.     

基于SIRT1/TGF-β_1/Smad通路研究三七皂苷对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞EMT的影响

[目的]研究三七皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)对高糖诱导后肾小管上皮细胞发生上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的修复作用及其相关机制。[方法]培养肾小管上皮细胞株NRK-52E细胞,分为正常对照组、高糖组、白藜芦醇(resveratrol,RSV)组、PNS组、沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)抑制剂EX527组和EX527+PNS组。药物干预48h后收集细胞;采用免疫组化检测α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、E-钙黏着蛋白(E-cadherin,E-cad)的蛋白表达;Real-time RT-PCR检测SIRT1、α-SMA、E-cad、转化生长因子-β_1(transforming growth factor-β_1,TGF-β_1)、Smad3、Smad4的基因表达,Western blot检测SIRT1、α-SMA、E-cad、TGF-β_1的蛋白表达。[结果]与正常对照组比较,高糖诱导后的NRK-52E细胞出现明显的EMT表现,即α-SMA蛋白表达增多(P0.05),E-cad蛋白表达减少(P0.01)。与高糖组比较,PNS组α-SMA蛋白表达减少(P0.05),E-cad和SIRT1蛋白表达增加(P0.01,P0.01),TGF-β_1、Smad3、Smad4基因表达降低(P0.01,P0.05)。EX527干预后,PNS作用受到抑制。[结论]PNS对肾小管上皮细胞具有保护作用,其机制可能是通过激活SIRT1抑制TGF-β_1/Smad通路,从而阻止高糖诱导的EMT的发生。