HBV-X突变与TGF-β1致肝细胞肝癌相关性分析

目的：探讨乙肝病毒X区基因（hepatitis B virus X gene,HBV-X）变异情况与慢性乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）感染患者血清中转化生长因子-β1（transforming growth factor beta 1,TGF-β1）表达致肝细胞肝癌间的相关性。方法：收集2015年1月至2016年10月期间重庆医科大学附属第二医院的慢性乙型病毒性肝炎患者血清35例,肝硬化35例,肝癌35例。采用聚合酶链反应方法（polymerase chain reaction,PCR）扩增HBV-X基因序列,并对其产物行DNA测序,将测序结果与已知HBV-X基因序列对比分析变异位点。酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测患者血清中TGF-β1浓度。将结果进行卡方检验、单因素方差分析等方法处理数据。结果：TGF-β1浓度在肝癌组表达明显高于非肝癌组,差异具有统计学意义（P<0.05）。肝病患者血清中常见的突变位点依次为：A1762T/G1764A、T1719C、G1635A、A1605G、C1653T、T1753G,其中A1605G、A1762T/G1764A、T1753G突变率在肝癌组明显高于非肝癌组,差异具有统计学意义（P<0.05）。采用t检验对两者进行分析发现,3个位点突变与不突变组的TGF-β1浓度存在统计学差异。结论：HBV-X基因中的T1753G、A1605G、A1762T/G1764A位点突变可能与TGF-β1表达及肝癌的发生相关,这可能参与了肝癌疾病发展进程。     

液态芯片技术在β地中海贫血基因检测中的应用研究

目的探讨液态芯片技术在检测β地中海贫血基因突变常见类型的应用价值。方法采用液态芯片技术,使用Luminex100多功能悬浮点阵检测仪及Lumi2 nex Data Collector Version1.7数据收集软件检测并通过突变标本与正常标本的荧光强度比值（Mutan/Normal）分析100份正常人标本及68份PCR反向杂交技术确认的β地中海贫血基因突变标本。结果100份正常标本检测结果正常。68份β地贫基因突变检测结果为密码子CD41/42（TCTT）突变37例（54.41%）,IVS2-654（C→T）突变杂合12例（17.65%）,-28（A→G）突变10例（14.71%）,-17（A→T）突变5例（7.35%）,CD71/72（＋A）2例（2.94%）,-29（A→G）突变杂合1例（1.47%）。密码子71/72（＋A）复合IVS2-654（C→T）突变杂合1例,-28（A→G）复合密码子CD41/42-TCTT突变2例,单位点突变β地贫病人为95.59%（65/68）,多位点突变为4.41%（3/68）。7种突变杂合类型与常用方法PCR-RDB检测结果为100%符合率。结论液态芯片技术能准确区分β地贫基因突变杂合复合突变,可提供快速、敏感的临床β地贫基因突变检测技术平台。     

G6PD缺陷症基因型分析：一种新的错义突变

目的对葡萄糖-6磷-酸脱氢酶（G6PD）缺陷症患者进行G6PD基因型分析,分析基因突变类型。方法选取经G6PD活性测定确诊为G6PD缺陷症的49例患者和100名G6PD活性正常的体检者的全血标本,PCR和DNA测序法对G6PD基因外显子2~13进行序列分析。结果 49例G6PD缺陷症患者中,共发现12种错义突变,其中常见的三种为G6PD G1388A（26.5%）、G1376T（28.6%）和A95G（14.3%）,此三类基因型患者G6PD活性仅为正常人群的5%~18%。临床主要表现为新生儿黄疸、进食蚕豆后发生急性溶血性贫血等。其余突变类型包括C1024T（4.1%）、C1225T（2.0%）、C1159T（2.0%）、G487A（4.1%）、G392T（4.1%）、G1160A（6.1%）、G871A/C1311T（4.1%）和C406T/C1311T（2.0%）;在外显子7上发现了一种新的错义突变即G691C,该突变造成G6PD第231位丙氨酸（A la）被脯氨酸（Pro）替代。正常对照标本未发现相同的基因改变。结论 G6PD基因G1388A、G1376T和A95G是G6PD缺陷症患者最常见的三种突变类型。新发现的G691C突变导致A la231Pro,是引起红细胞G6PD活性降低,患者临床出现溶血症状的主要原因。     

SCN1A基因突变阴性热性惊厥患者SCN3A 基因突变的特点

对SCN1A 基因突变阴性的热性惊厥（FS）患者进行3 基因突变筛查,并分析其突变特点。方法应用聚合酶链反应扩增和Sanger 测序方法对38 例入组患者筛查SCN3A 基因突变,采用生物软件分析突变特点。结果2 例错义突变（c.956T>C/p.I319T,c.5179G>A/p.D1727N）;同源性比对分析提示2 例突变均高度保守,在千人基因组计划数据库和100 例正常人中未发现相应的位点改变。结论在SCN1A 基因突变阴性的FS 患者中,发现2 例SCN3A基因突变错义突变,该突变可能具有致病性。     

基因芯片筛查糖尿病线粒体基因突变

目的建立一种快速、准确的高通量检测线粒体DNA突变的基因芯片技术,并探讨这些突变与糖尿病的关系。方法以尼龙膜为介质,通过紫外交联固定28个待测突变位点的野生型和突变型探针,并采用该基因芯片对200例2型糖尿病患者和210名健康对照的线粒体tRNA leu（UUR）基因及ND1基因进行筛查,DNA测序进一步确证突变位点,Mfold和Antheprot软件预测变异型基因及蛋白质二级结构。结果成功研制可检测28个突变位点的线粒体DNA芯片,在糖尿病组检出tRNA leu（UUR）基因13290C突变2例（1．0％）,ND1基因突变23例：G3316A突变6例（3．0％）、13394C突变5例（2．5％）、A4164G突变8例（4．0％）,T4216C突变2例（1．0％）,T3593C（0．5％）和A3606G突变各1例（0．5％）;对照组检出G3316A突变1例（0．5％）、A4164G突变5例（2．4％）。这些突变位点的测序结果与基因芯片检测结果一致。两组间仅13394C突变率差异有统计学意义（P=0．027）。G3316A突变导致丙氨酸→苏氨酸,13394C突变导致酪氨酸→组氨酸,13593C突变导致缬氨酸→丙氨酸,T4216C突变导致酪氨酸→组氨酸,A3606G和A4164G突变分别为亮氨酸和蛋氨酸的无意义突变,前4种突变型的ND1蛋白二级结构不同于野生型。结论线粒体DNA芯片是一种快速可靠的高通量基因突变检测方法,ND1基因13394C突变可能参与了线粒体基因缺陷型糖尿病的发病。     

冠心病并高同型半胱氨酸血症患者甲硫氨酸合成酶基因突变的研究

目的: 研究中国人冠心病并高同型半胱氨酸血症患者甲硫氨酸合成酶(MS)基因突变的情况.方法:应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)以及DNA测序技术,检测60例患者MS基因中与结构和功能密切相关的10个外显子的点突变情况.结果:除已知的31外显子区3个SNP位点比较常见外,还发现了1个新的点突变,3 869位为A/G杂合子(A→G的错义突变可使1 195位氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸),此患者的血浆同型半胱氨酸血水平明显高于正常,为30.93 μmol·L-1.此外发现32内含子1个新的G/T多态性.结论:MS某种基因突变可能是影响MS酶功能及高同型半胱氨酸血症的原因之一.     

宁夏地区乙型肝炎病毒基因BCP区A1762T/G1764A突变与肝细胞癌的相关性

目的 通过分析宁夏地区HBV基因核心启动子A1762T/G1764A双基因突变的特征,探讨其与乙型肝炎相关原发性肝癌的相关性.方法 收集宁夏地区104例慢性乙肝患者和88例乙肝相关肝细胞癌患者的一般病例资料及血清,采用荧光定量PCR法检测两组患者HBV DNA定量值;采用巢式PCR扩增及测序方法检测HBV C启动子A1762T/G1764A（ntA1762A→T和nt1764G→A）双突变情况;采用多因素Logistic回归分析肝细胞癌发生的危险因素.结果 104例慢性乙肝组和88例肝细胞癌组对比发现年龄、e抗原阴性、HBVDNA水平、乙肝肝硬化、HBV A1762/G1764A双位点突变均可能与肝细胞癌的发生有关,多因素Logistic回归分析结果提示年龄＞50岁、e抗原阴性、乙肝肝硬化、HBV A1762T/G1764A双突变与肝细胞癌发生呈正相关,而与HBV DNA＞10^5拷贝/mL呈负相关（P=0.000,OR=0.257）.结论 宁夏地区乙肝病毒基因BCP区A1762T/G1764A基因双突变是肝细胞癌发生的危险因素.     

乳腺癌患者BRCAl基因外显子11突变研究

目的：检测乳腺癌患者（breast and ovarian cancer susceptibility gene1，BRCAl）基因exonll突变情况及突变位置，探讨BRCAl突变与乳腺癌的关系。方法：采取105例乳腺癌标本为实验组，30例非癌乳腺组织为对照组。应用PCR—SSCP技术和DNA直接测序法检测所有标本BRCAl基因外显子11全部序列的突变情况。结果：30例非癌乳腺组织BRCAl基因外显子11未检出突变，105例乳腺癌中有10例发生基因突变，占总例数的9．5％。10例中2例为同义突变：2430T→ C，2630T→G；8例为错义突变：2532T→G，2685T→C（2例），3191C→G，3232A→G，3667A→G（2例），3876C→A。结论：BRCAl基因外显子11突变与乳腺癌的发生关系密切，对其进行检测可能对乳腺癌的患病风险评估及早期诊断具有重要意义。     

TLR4(896A＞G)基因错义突变与重型急性胰腺炎胰腺坏死组织感染的相关性研究

目的 研究Toll样受体4(TLR4) 896A＞G基因错义突变与重型急性胰腺炎(SAP)胰腺坏死组织感染的相关性.方法 采用错配PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)分析方法在SAP伴胰腺组织坏死的病人和健康自愿者人群中检测TLR4(896A＞G)的等位基因频率.结果 ①所有TLR4 (896A＞G)的基因突变均为杂合子;②SAP胰腺组织坏死伴胰腺感染组(50例) TLR4基因错义突变频率为20%,与健康志愿组TLR4基因错义突变频率5.6%相比,TLR4基因错义突变频率明显升高,差异有统计学意义(P=0.019);③在SAP伴感染病人中,TLR4基因错义突变组G-细菌感染率为44.1%(15/34),明显高于无TLR4基因错义突变组18.5%(15/81), 差异有统计学意义(P=0.04).结论 TLR4(896A＞G)基因错义突变与SAP胰腺坏死组织的感染相关联.     

两例先天性凝血因子V缺乏症基因突变的鉴定

目的 探讨先天性凝血因子V（FV）缺乏症的分子发病机制.方法 采用一期法检测血浆FV活性,ELISA法检测血浆FV的抗原含量,PCR法扩增FV基因的25个外显子及其侧翼序列,DNA测序并与Genebank校对确定基因异常.结果 两例患者血浆FV活性和抗原含量均为2%.病例1在FV基因23外显子G 69969 T的纯合突变,导致G 2107 V;病例2由13外显子双杂合突变所致,其中一突变C 45533 T导致R 740 Ter,另一突变位点G 45366 A导致C 684 Y,这是国际上第一个位于13外显子的错义突变位点.分子结构分析表明684 Cys突变Tyr后,不能与603 Cys形成二硫键,影响了A2区β环状结构的形成,导致FV的稳定性降低.结论 FV基因G 69969 T、C 45533 T及G 45366A突变与先天性FV缺乏症有关.     

急诊肝动脉栓塞治疗肝癌自发破裂出血的临床分析

目的评价肝动脉栓塞(TAE)在原发性肝癌自发性破裂出血治疗中的作用。方法采用Seldinger技术,使用碘化油、明胶海绵作为栓塞剂,对16例肝癌破裂出血患者采用急诊肝动脉栓塞止血。结果行TAE术后16例患者出血均得到完全控制。所有患者均无复发出血及急性肝功能衰竭。2例术后15d获二期外科手术切除,14例定期再行1～4次肝动脉化疗栓塞(TACE)治疗,肿瘤均有不同程度的缩小和坏死,1年存活率为28.6%。结论急诊肝动脉栓塞是治疗肝癌破裂出血的有效、安全的方法,同时为肝癌后续治疗提供途径。     

肝动脉化疗栓塞术治疗肝癌破裂出血

目的探讨肝动脉化疗栓塞术在治疗肝癌破裂出血中的疗效。方法回顾性分析1998年3月-2007年2月的12例肝癌破裂出血急诊动脉导管栓塞治疗过程。采用Seldinger技术,使用明胶海绵、碘化油加化疗药物混悬剂作为栓塞剂,对12例肝癌破裂出血患者行肝动脉化疗栓塞术。结果 12例患者急诊栓塞治疗均止血成功,成功率100%.止血治疗后每例患者进行1～ 3次动脉导管化疗栓塞;平均生存期为13个月。结论肝动脉化疗栓塞术是治疗肝癌破裂出血安全有效的手段。     

肝细胞癌中M2巨噬细胞标志物与NF-κB p50相关性研究

目的探讨不同分期肝细胞癌病人组织中M2巨噬细胞及核因子κB（NF-κB）p50的表达情况,并分析其表达的相关性。方法整群收集2012-2015年80例肝细胞肝癌病人和10例肝内胆管结石病人（对照组）的组织标本,采用免疫荧光双染法检测CD163和CD206的表达;收集2015年10月至2016年1月20例接受肝细胞癌手术病人的新鲜组织标本,采用Western blotting法检测不同分期的肝癌组织中CD163、CD206的表达及NF-κB p50的表达。结果肝癌病人石蜡组织切片中CD163和CD206的共定位高于对照组,Ⅲ+Ⅳ期肝癌切片中的共定位高于Ⅰ+Ⅱ期;Western blotting结果表明,肝癌组织中CD163、CD206及NF-κB p50的表达高于癌旁组织（P < 0.05~P < 0.01）,Ⅲ+Ⅳ期肝癌组织中的表达高于Ⅰ+Ⅱ期（P < 0.01）。NF-κB p50与CD163、CD206的表达均呈正相关（r=0.963、0.944,P < 0.01）。结论随着肝癌进展,M2巨噬细胞数量和NF-κB p50的表达均升高,提示两者可能具有协同作用,共同促进肝癌进展。     

GP73在肝癌患者外周血CD4+T淋巴细胞中的异常表达及其相关机制研究

目的 探讨肝癌患者外周血CD4+T淋巴细胞中高尔基体蛋白73(GP73)的异常表达及其对Th1/Th2/Th17亚型分化的影响.方法 选择该院2015年5月至2016年2月住院的肝癌患者50例为研究对象,50例健康志愿者作为对照.采集外周血并分离CD4+T淋巴细胞,采用实时荧光定量PCR检测CD4+T淋巴细胞中GP73表达水平;另将分选的20例健康者CD4+T淋巴细胞分别转染GP73小干扰RNA或过表达载体,实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法(Western blot)检测CD4+T淋巴细胞中GP73及核因子κB(NF-κB)表达水平,ELISA检测上清液中白细胞介素4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素17(IL-17)的分泌水平.结果 肝癌患者外周血CD4+T淋巴细胞中GP73 mRNA的表达与健康者相比明显上调,差异有统计学意义(P<0.05).GP73过表达组NF-κB表达水平明显升高(P<0.05),GP73干扰组NF-κB表达水平明显降低(P<0.05).过表达GP73导致CD4+T淋巴细胞中IL-4、IL-17水平明显升高,IFN-γ水平明显降低(P<0.05);沉默GP73导致CD4+T淋巴细胞IL-4、IL-17水平明显降低,IFN-γ水平明显升高(P<0.05).结论 GP73在肝癌患者的外周血CD4+T淋巴细胞中过表达,而GP73很有可能通过激活N F-κB参与炎症反应,导致患者体内T h1/T h2/T 17失衡,促进肝癌的发生与发展.     

FcγRⅢA多态性与利妥昔单抗治疗弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效观察

目的 探索中国弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)病人FcγRⅢA-158V/F多态性与利妥昔单抗疗效的关系.方法 入组病人均为经病理诊断,CD20(+)的初治弥漫大B细胞淋巴瘤,所有病人均接受利妥昔单抗联合CHOP(环磷酰胺+阿霉素+长春地辛+泼尼松)方案化疗,用PCR方法 检测其Fcγ/RⅢA表型.前瞻性观察6个疗程后初治疗效,分析不同FcγRIIIA表型的缓解率.结果 共入组34例DLBCL病人,其FcγRⅢA表型VV型11例,FF型5例,VF型18例.接受平均6个疗程(4～8疗程)利妥昔单抗联合化疗后,近期缓解率为79%.其中VV型有效9例(32%),FF型3例(60%)有效;VF型15例(83%)有效,差异有统计学意义(P=0.04).结论 DLBCL病人FcγRⅢA表型以VF型最多见,其次为VV型和FF型.表达VV、VF型病人对利妥昔单抗联合化疗的近期疗效明显优于FF型.     

Long-term survival for spontaneous rupture of hepatocellular carcinoma treated with hepatectomy

Objective:To determine the prognostic factors of ruptured hepatocellular carcinoma (HCC) and report the management of patients with spontaneous rupture of HCC in a single center during a 5-year period and to evaluateone-stage hepatectomy.Methods:A series of 4,209 patients with HCC were collected at Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital from April 2002 toNovember 2006,of whom 200 patients (4.8％) with ruptured HCC were studied retrospectively regarding their clinical characteristics and prognostic factors.The one-stage therapeutic approach to manage ruptured HCC consisted of initial management by conservative method,transarterial embolization (rAE) or surgical hepatectomy.Results of various treatments were evaluated and compared in the randomly selected 202 patients with no history of rupture during the same study period.Results:A total of 200 patients with spontaneous rupture of HCC were studied who underwent surgical treatment (n=105),TAE 33 and conservative treatment (ConT 62).A multivariate analysis using the Cox hazard regression model (including all the patients;n=200) identified surgical hepatectomy as the only independent factor determining a relatively long survival period (P<0.0001).On the other hand,in a further analysis of the patients in whom surgical hepatectomy was successfully performed (n=105),which identified a maximum tumor size exceeding 6 cm as significant determinants of a poor 12-month (P=0.036),and a multivariate analysis did not identify as any inverse independent factor determining relatively long-term survival,only a maximum tumor size exceeding 6 cm exhibited a tendency toward being a determinant factor (P=0.083).Conclusion:Considering the high propensity to spontaneous rupture,as long as preoperatively clinical evaluation meet surgery requirements,elective one-stage hepatectomy for patients with ruptured HCC is the first treatment option.Prolonged survival could be achieved in selected patients with hepatic resection,although the survival results were inferior to those of the patients who did not have the complication of rupture.     

bcl 10 gene mutation in hepatocellular carcinoma

Objective To detect the mutation frequency of the bcl 10 gene in the early and advanced st ages of hepatocellular carcinoma (HCC).Methods Genome DNA samples were extracted from 46 cases of fresh HCC tumor tissues and t heir non-tumor adjacent tissues. Polymerase chain reaction-single strand conf ormation polymorphism method was used to detect point mutations of t he three exons of the bcl 10 gene. For each individual exon, six random samples from those showing abnormal DNA bands were sequenced to verify those mutations . The relationship between serum alpha-fetoprotein (AFP) level and bcl 10 muta tion, between the tumor size and bcl 10 mutation was also analyzed.Results Among the 46 samples, 26 cases (56.5%) were found to have mutations in exon 1, 5 out of the 6 cases were shown to have 5744 C→G mutation by sequencing; 25 cas es (54.3%) were found to have mutations in exon 2, 4 out of the 6 cases were sh own to have 11 311 T deletion mutation by sequencing. Twenty-one cases (4 5.7%) were found to have mutations in exon 3, all of the 6 cases selected for sequenc ing were shown to have 14 116 C→T mutation. Statistical analysis showed t hat ne ither serum alpha-fetoprotein level nor the size of hepatocellular carcino ma has a significant relationship with bcl 10 mutation.Conclusion The bcl 10 gene has a high mutation frequency in liver cancer.     

CD147和基质金属蛋白酶-9在肝细胞肝癌中的表达与微血管生成的相关性

目的:探讨细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(CD147)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在肝细胞肝癌组织中的表达与肝细胞肝癌血管生成的关系。方法:采用免疫组织化学法检测63例肝细胞肝癌组织中CD147和MMP-9的表达,光镜下计数(分化抗原105 CD105)标记的微血管密度。结果:63例肝细胞肝癌组织中CD147阳性率为65.1%,MMP-9阳性率73.0%,二者阳性率在肿瘤大小、门静脉癌栓、肿瘤分化和TNM分期间差异均有统计学意义(P<0.05～P<0.01),而在患者的性别、年龄及甲胎蛋白的表达水平间差异无统计学意义(P>0.05)。CD147和MMP-9阳性组微血管密度值均明显高于阴性组(P<0.01)。CD147在肝细胞肝癌中的表达与MMP-9表达呈正相关关系(P<0.01)。结论:肝细胞肝癌组织中CD147表达上调可能通过促进MMP-9的生成参与肝癌微血管的生成,进而有利于肝癌侵袭和转移。     

人肝癌组织中nm23-H1基因突变的检测及意义

目的观察肿瘤转移抑制基因nm23-H1在人原发性肝细胞癌中的突变情况，探讨nm23-H1基因突变与肝癌发生、发展及转移的关系。方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性技术（PCR-SSCP），对16例肝癌组织、12例癌旁组织和4例正常肝组织的nm23-H1基因的第1、2、4外显子突变情况突变进行检测。结果肝癌组织中有1例nm23-H1基因第1外显子纯合缺失；肝癌组织中1例第1外显子、1例第2外显子，癌旁组织中2例第2外显子有单链DNA泳动变位。结论nm23-H1基因突变在肝癌组织中发生率低。     

负载抗原DC联合CIK对肝癌免疫微环境的影响

  目的  探讨负载肝癌抗原树突状细胞（dendritic cell，DC）联合细胞因子诱导杀伤细胞（cytokine-induced killer，CIK）对肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）微环境的影响。  方法  采用手术切除HCC组织制备HCC抗原，采集健康志愿者单个核细胞，诱导并分离出DC，CIK，按是否加入HCC抗原及共培养将细胞分为DC、Ag-Dc、CIK、Ag-DC-CIK四组，流式细胞仪测定各组细胞表型后，ELISA检测IL-6、IL-10及IFN-γ水平；免疫细胞化学SP法检测血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达；RT-PCR检测基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2，MMP-3，MMP-9mRNA表达水平。  结果  负载抗原后DC组CD80及CD86表达阳性率，Ag-DC-CIK组CD3+CD56+、CD8+CD56+双阳性细胞均显著升高（P < 0.05）； Ag-DC-CIK组IL-6及IFN-γ浓度显著低于其余各组；而IL-10浓度最高（P < 0.05）；Ag-DC-CIK组VEGF及MMP-2、MMP-3、MMP-9mRNA表达水平均显著下降（P < 0.05）。  结论  在DC负载自身抗原的基础上，与CIK共培养，可显著增强DC及CIK活性，有效降低HePG2微环境中血管形成，炎症反应及纤维化相关因子表达。