不同毒力钩端螺旋体引起的细胞因子表达的差异

目的 通过比较不同毒力钩端螺旋体引起豚鼠细胞因子表达的差异,探讨钩端螺旋体病的炎症反应及其发病机制.方法 豚鼠腹腔内分别注射致病性钩端螺旋体赖型有毒株Lai株,赖型无毒株IPAV株,以及非致病性钩端螺旋体Patoc型Patoc 1株,观察豚鼠各脏器的病理改变;EnVision二步法检测钩端螺旋体在各脏器中的分布;应用Real-time RT-PCR法检测豚鼠血液中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12、MCP-1 mRNA的表达.结果 钩端螺旋体IPAV株和Patoc 1株不能引起豚鼠组织病变,但是在感染早期引起细胞因子的高表达;而Lai株可以引起典型的钩端螺旋体病病变,但是在感染早期引起细胞因子较低表达.结论 致病性钩端螺旋体赖型毒力株Lai株引起的细胞因子的表达明显低于非致病钩端螺旋体Patoc型Patoc 1株和赖型无毒株IPAV株,可能与钩端螺旋体病炎症反应轻微有关,有利于钩端螺旋体逃避宿主的免疫反应,在体内繁殖扩散.     

大鼠耐力训练增加血红素加氧酶1诱导的血管舒张

目的 观察大鼠急性耐力训练运动后血管收缩及舒张功能的变化并探讨其机制.方法 健康雄性SD大鼠在运动平板上进行跑步适应性训练2周后,进行一周耐力训练.训练方式为平板跑,运动5 d/周,耐力训练时平均运动距离2000～2300 m/d.同年龄安静饲养动物为对照.运动结束时取降主动脉在体外检测血管对80 mmol/L高钾溶液与1 μmol/L苯肾上腺素的收缩反应,以及血管对乙酰胆碱的舒张反应.阻断一氧化氮合酶(NOS)及血红素加氧酶1(HO-1)后再次观察血管对乙酰胆碱的舒张反应.部分主动脉环进行免疫组织化学检测血管内皮HO-1.同年龄静止饲养大鼠作为对照.结果 大鼠经1周耐力运动训练后,主动脉对高钾溶液的收缩反应未见明显变化,对苯肾上腺素引起的收缩反应显著减弱,对乙酰胆碱的舒张反应显著增强(P＜0.01).NOS阻断剂预孵后,正常不运动对照大鼠血管内皮依赖性舒张被阻断达(97.7±3.3)%,经过耐力训练的大鼠血管被阻断(78.8±2.1)%(与对照组比较,P＜0.01),耐力训练组尚存的内皮依赖性舒张可被HO-1阻断剂protoporphyrin Ⅸ Zinc(Ⅱ)进一步阻断.免疫组化结果显示主动脉血管HO-1显著增加.结论 急性耐力运动训练后血管内皮依赖性舒张功能增强,该作用可能与运动诱导的血管内皮中HO-1增加有关.     

钩端螺旋体对血管内皮细胞单层的侵袭性研究

目的 比较不同毒力的钩端螺旋体(钩体)对血管内皮细胞单层的侵袭能力和通透性改变的影响.方法 利用Transwell小室和EAhy926细胞构建完整血管内皮细胞单层模型,分别加入钩体有毒株56606v株、减毒株56606a株、腐生型Patoc I株、伤寒沙门菌14028菌株和大肠埃希菌DH5α菌株,作用2、4、8 h后在暗视野显微镜下计数到达Transwell下室细菌的数量,并检测内皮细胞单层对荧光颗粒的通透性改变.56606v株和56606a株分别与EAhy926细胞共同孵育24 h,流式细胞术Annexin v和PI染色检测内皮细胞凋亡率.透射电镜下观察钩体穿透内皮细胞单层过程中的形态特征.结果 感染后2 h,56606v和14028菌株开始在下室出现,而56606a株和Patoc I株到4 h后才出现.随时间的延长,下室的细菌数目持续增加;感染8 h后,56606v株到达下室的数量最多,且明显多于56606a株和Patoc I株(P＜0.05).不同毒力的钩体均未引起内皮细胞单层通透性明显改变;流式细胞术检测表明,钩体56606v株和56606a株均未引起内皮细胞凋亡;电镜观察显示,钩体穿透内皮细胞单层主要是通过穿透内皮细胞胞体而非细胞间紧密连接处.结论 有毒株钩体对内皮细胞单层的穿透能力明显强于减毒株和腐生型钩体;不同毒力的钩体对内皮细胞单层通透性及内皮细胞凋亡无明显影响.     

鼻息肉黏膜上皮钠通道蛋白表达的研究

目的 比较鼻息肉与正常中鼻甲黏膜上皮钠通道(epithelial sodium channels,ENaC)蛋白的表达,探讨鼻黏膜ENaC蛋白依赖的Na+吸收机制及液体转运机制.方法 12例Ⅱ型2期慢性鼻-鼻窦炎(chronic rhinosinusitis,CRS)患者为鼻息肉(nasal polyp,NP)组,5例行鼻中隔矫正术和上颌窦囊肿摘除术患者的中鼻甲黏膜(ethmoid cornu mucosa,ECM)为对照组,内镜下取新鲜组织制成冰冻切片后行免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜下记录荧光相对表达量;反转录-实时聚合酶链反应(Rtreal-time PCR)法检测两组ENaC-α、β、γ mRNA的表达.结果 NP组ENaC蛋白免疫荧光相对表达量(x±s)为35.79±5.47,高于ECM组(22.17±5.43),差异具有统计学意义(t=4.69,P<0.01);NP组ENaC-α、β、γ mRNA表达(分别为2.06±0.42、1.97±0.32、1.96±0.54)均大于ECM组(分别为1.01±0.10、0.98±0.08、0.97±0.06),差异具有统计学意义(t值分别为5.482、6.659、4.036,P值均<0.01);ENaC三个亚基mRNA的表达在NP组与ECM组均为α>β>γ;NP组ENaC蛋白的相对表达量与ENaC-α、β、γ mRNA的表达呈止相关(r值分别为0.907、0.948、0.919,P值均<0.01).结论 ENaC蛋白及ENaC-α、β、γ mRNA在鼻息肉黏膜中的表达上调,且二者具有同步性,ENaC蛋白表达上调可能足造成黏膜下水肿,最终导致鼻息肉形成的重要原因之一.     

DRAM基因真核表达载体的构建及其表达对HepG2细胞的作用

目的:构建DRAM全长cDNA的真核表达载体pEGFP-DRAM,观察DRAM在人肝细胞HepG2中的作用.方法:应用RT-PCR技术扩增获得DRAM全长cNDA,克隆扩增产物,经酶切、DNA测序鉴定正确后,构成pEGFP-DRAM的真核表达重组质粒.用脂质体将重组质粒转染入HepG2细胞,在激光共聚焦显微镜(LSCM)下观察DRAM的表达情况,用流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期和死亡细胞,MTS法检测细胞增殖能力,Western blot鉴定细胞表达蛋白质的水平,并在透射电子显微镜下观察自噬体.结果:构建完成的真核表达重组质粒pEGFP-DRAM,经DNA测序证实与GenBank中的人DRAM cDNA序列一致.LSCM下可观察到转染DRAM的细胞中有绿色荧光蛋白的表达.流式细胞分析仪检测显示,转染DRAM的HepG2死亡细胞明显增高(P<0.05);G1期细胞百分数则明显减少(P<0.05);MTS法检测结果显示转染DRAM的HepG2细胞增殖力明显增高(P<0.05);Westem blot检测到DRAM蛋白表达明显增高;转染pEGFP-N1的HepG2细胞超微结构基本正常,转染DRAg的一些细胞中可见自噬体.结论:本研究成功构建了表达DRAM的真核质粒,并在HepG2细胞中表达,DRAM在肿瘤细胞存在双向效应,既可诱导HepG2细胞发生自噬性死亡,又可促进HepG2细胞增殖.     

脂联素基因-3971A/G多态性与脑梗死关系的研究

目的探讨脑梗死患者(CI)与脂联素基因-3971A/G多态性的关系。方法运用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,对126名对照者和150例CI患者的脂联素基因启动子3971多态性进行检测。结果对照组和CI组的基因型频率分别为67.20%、26.40%、6.40%;82.00%、16.67%、1.33%,经分析发现两组间差异有统计学意义(P0.05)。两组的等位基因频率分别为80.40%、19.60%;90.33%、9.67%,经分析发现两组间差异有统计学意义(P0.05)。CI组的脂联素基因-3971位各型的TG、血糖、收缩压均明显高于对照组(P0.05),而TC、HDL-Cn、onHDL-C、LDL-C、舒张压在两组间无统计学意义(P0.05)。经过多元逐步Logistic回归分析显示TG的OR值为1.414,95%CI(1.059-1.888);血糖的OR值为1.034,95%CI(1.018-1.051);收缩压的OR值为1.339,95%CI(1.098-1.633);GG型的OR值为2.289,95%CI(1.243-4.215)。结论脂联素基因-3971A/G多态性的GG型可能是CI发病的一个独立危险因子。     

健康人群外周血各类血细胞CD55/CD59的表达

目的了解健康人群外周血细胞CD55/CD59表达情况。方法用流式细胞仪检测健康人红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞膜上CD55/CD59表达。结果80名健康人外周血不同类型的血细胞膜上CD55/CD59表达不同。正常红细胞CD55/CD59双阳性的红细胞中位数为85.100%,阵发性血红蛋白尿症(PNH)细胞<0.200%;正常中性粒细胞双阳性细胞中位数为99.900%,PNH细胞<0.100%;单核细胞双阳性细胞的中位数为93.000%,PNH细胞<2.900%。淋巴细胞双阳性细胞中位数为72.600%,PNH细胞<18.000%。正常淋巴细胞中所含的PNH细胞比例明显高于其他细胞(P<0.01),且主要为T淋巴细胞。结论健康人的外周血各种血细胞CD55/CD59表达不同,分析结果有助于对PNH等干细胞疾病的诊断和发病机制进行探讨。     

问号钩体趋化相关基因特征分析

目的 预测问号钩体黄疸出血群赖型赖株的趋化信号传导途径，并深入分析趋化相关基因。方法 使用ProtParam tool，NCBI／Blastp进行蛋白参数分析和结构域分析，使用Clustalw软件进行多序列对比，与大肠埃希菌K-12趋化相关基因进行比较。结果 问号钩体趋化相关基因共30个，分为MCPs和che两组基因，功能与大肠埃希菌趋化相关基因相似，并预测出问号钩体趋化信号传导途径。结论 问号钩体趋化相关基因较大肠埃希菌、苍白密螺旋体和伯氏疏螺旋体多，提示其趋化传导途径更为复杂，适应宿主的能力也更强，可能是钩体的重要毒力因子之一。     

豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬钩端螺旋体的机制研究

目的 研究豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬钩端螺旋体毒力株的机制,探讨天然免疫在钩端螺旋体病发病机制中的作用。方法 提取豚鼠腹腔巨噬细胞,感染1 h前分别加入细胞微丝阻断剂cytochalasin D、微管阻断剂colchicine和PI3K信号通路阻断剂LY294002,同时设立不含阻断剂的对照组,1 h后检测细胞活性。与致病性问号钩体赖型Lai株共同孵育3 h后,激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞吞噬钩体的形态学特征,流式细胞术检测各组吞噬率。结果 对照组巨噬细胞对钩体的吞噬率为（38.98±0.91）%;cytochalasin D组、colchicine组和LY294002组的吞噬率分别为（23.99±1.40）%、（40.81±0.91）%和（39.64±3.56）%;cytochalasin D组吞噬率明显低于对照组（P<0.05）;colchicine组和LY294002组与对照组比较差异无统计学意义（均P>0.05）。结论 微丝参与了豚鼠腹腔巨噬细胞吞噬毒力钩体的过程,微管在吞噬过程中不起关键作用,微丝的变化不依赖PI3K信号通路。     

hVEGF基因工程生物膜对大鼠全层皮肤缺损创面中Fn和整合素α5表达的研究

目的探讨将含人血管内皮细胞生长因子（hVEGF）重组质粒的成纤维细胞种植的基因工程生物膜覆盖于大鼠全层皮肤缺损创面,在创面愈合过程中对细胞外基质中纤维连接蛋白（Fn）及其受体整合素α5表达的影响。方法通过建立hVEGF基因工程生物膜覆盖大鼠全层皮肤缺损创面的动物模型,采用免疫组化方法并结合图像分析,分别观察并测定实验组和对照组大鼠创面愈合3、7、14、29d时创面中Fn和整合素α5表达的平均光密度值,判断其在创面中表达的强弱。结果在术后3、7、14d时,实验组中Fn表达显著高于对照组（P〈0．05）;在术后14、29d时,实验组中整合素α5表达显著高于对照组（P〈0．05）。结论将hVEGF基因工程生物膜覆盖于大鼠全层皮肤缺损创面,在创面愈合的早、中期促进Fn的表达;在创面愈合中、晚期,上调整合素α5的合成与分泌,从而有利于创面愈合。