脂质体介导入β—神经生长因子基因转染培养肌母细胞的表达研究

目的：了解含β－神经生长因子（β－NGF）基因的表达质粒PSVCEP NGF－CAT在培养肌母细胞中的表达及Lipofect AMINE阳离子脂质体介导的转染效率，方法：将表达质粒PSVCEP NGF－CAT经LipofectAMINE转染至培养成的肌母细胞中，用免疫细胞化学方法检测基因在肌母细胞内的表达。结果：培养肌母细胞在转染6小时吞噬脂质体最显著，转染48小时后约40％的肌母细胞胞质内有β-NGF基因表达。结论：含β-NGF基因在表达质粒PSVCEP NGF－CAT可以在培养肌母细胞中表达，脂质体转染的方法简便，有效。     

骨髓基质干细胞转染后神经生长因子及其受体p75的表达

目的：为应用神经生长因子（ NGF）修饰的骨髓基质干细胞（ BMSC）进行耳蜗移植治疗老年性耳聋的实验研究提供支持。方法采用脂质体LipofectamineTM 2000方法进行骨髓基质干细胞转染,共分为4组：A组：脂质体包裹的重组质粒转染组;B组：脂质体转染组;C组：脂质体包裹的空质粒转染组;D组：用含10％胎牛血清的DMEM F12培养液培养。免疫组化检测各组转染后神经生长因子和神经生长因子受体p75的表达。结果各转染组细胞均有NGF、受体p75表达,且均以胞浆表达为主;图像分析显示,重组质粒组NGF表达的平均光密度值明显高于其余3组,重组质粒组受体p75表达的平均光密度值明显低于其余3组。结论采用脂质体Lipofectami-neTM 2000转染方法能成功将含有NGF的重组质粒转染至BMSC,为我们进一步应用NGF修饰的BMSC进行耳蜗移植治疗老年性耳聋的实验研究提供理论基础。     

重组人神经生长因子β基因腺病毒的构建与鉴定

目的 构建表达人神经生长因子β基因片段的重组腺病毒Ad CMV-h NGF-β。方法 以健康人白细胞中DNA为模板,扩增h NGF-β基因片段,导入p GEM-T-Easy质粒,获得重组质粒p GEM-T/h NGF-β。经酶切鉴定后与复制缺陷型腺病毒穿梭质粒p ACCMV-p Lp A构建重组腺病毒穿梭质粒p ACCMV-h NGF-β。酶切鉴定后再与辅助包装质粒PJM17共转染293细胞,经同源重组后,构建复制缺陷型重组腺病毒Ad CMV-h NGF-β。对Ad CMV-h NGF-β进行基因鉴定,并测定滴度及在He La细胞中的表达。结果 顺利克隆出h NGF-β基因片段,构建的重组质粒p GEM-T/h NGF-β和重组腺病毒穿梭质粒p ACCMVh NGF-β,经酶切鉴定实际结果与理论推导符合。构建的复制缺陷型重组腺病毒Ad CMV-h NGF-β滴度为1.2×1012pfu/ml,并能在He La细胞中表达。结论 以h NGF-β基因片段为基础成功构建了重组腺病毒Ad CMV-h NGF-β,测试表明该重组病毒具有高滴度活性和良好的感染人类细胞、表达目的蛋白的能力。     

脂质体介导TGF-β1质粒DNA转染家兔角膜上皮细胞的实验研究

为证实TGF-β1质粒DNA能否由脂质体携带进入家兔角膜上皮细胞，用多聚阳离子脂质体携带重组的人TGF-β1质粒转染体外培养的家兔角膜上皮细胞，在转染12h后，表达2d时，用免疫组化方法（SABC）检测TGF-β1质粒DNA的表达情况，结果显示：外源TGF-β1质粒DNA在家兔角膜上皮细胞可以获得表达，基因转染率为23.37%。提示：脂质体作为角膜上皮细胞基因类药物介入的基础研究和应用研究的介导体具有广阔的应用前景。     

人类14-3-3β真核表达系统的构建

目的:构建人类14-3-3β基因真核表达载体并观察其转染的ECV-304细胞中14-3-3β的表达.方法:用基因重组技术将人类14-3-3βcDNA的开放阅读框克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导转染ECV-304细胞,Western-blot检测其在细胞内的表达.结果:酶切鉴定及测序分析表明重组pcDNA3.1-14-3-3β表达质粒克隆成功,经Westem-blot检测14-3-3β蛋白在ECV-304细胞中获得表达.结论:以脂质体介导pcDNA3.1-14-3-3β质粒转染真核细胞为进一步研究14-3-3β基因的功能奠定了实验基础.     

转染人转化生长因子-β3基因对瘢痕成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响

目的 观察转染人转化生长因子-β3(hTGF-β3)基因对瘢痕成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响。方法 通过脂质体介导的方法，将人表皮细胞生长因子基因真核表达质粒(pBK-CMV)-TGF-β3质粒转染体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞，采用RT—PCR法检测TGF-β3mRNA的表达，放射免疫(RIA)法测定细胞培养上清液中Ⅰ型和Ⅲ型前胶原的浓度。结果 构建的TGF-β3质粒可成功转染成纤维细胞，并增强Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达，下调Ⅰ／Ⅲ型胶原比值。结论 转染hTGF-β3基因可调节瘢痕成纤维细胞的生物学活性。     

JAB1、LPS对糖皮质激素受体转录激活活性的影响

目的体外观察JAB1基因转染对糖皮质激素受体转录活性的调控作用. 方法采用体外培养COS-7细胞,脂质体法共转染含全长人JAB1基因质粒pCDNA3.1-JAB1、pCMV-hGRα及含CAT报告基因质粒pMAMneo-CAT,设置不同剂量梯度的pCDNA3.1-JAB1质粒,转染36h后用ELISA方法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)活性来观察JAB1基因转染对GR转录激活活性的影响.结果随着pCDNA3.1-JAB1质粒剂量的增加,CAT浓度也逐渐上升,表明GR的转录激活活性也逐渐增加.LPS能显著地降低CAT浓度,但共转染pCDNA3.1-JAB1质粒可反转CAT活性的降低.结论 JAB1能增强GR的转录激活活性,LPS能抑制GR的转录激活能力.     

GDNF基因转染诱导神经干细胞向神经元分化的作用

目的探索转染GDNF基因到大鼠神经干细胞(neural stemcell,NSC)的方法,并研究其诱导大鼠神经干细胞向神经元和多巴胺能神经元分化的作用。方法体外扩增GDNF基因,并构建带有绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体PcDNA3-GDNF-GFP质粒。悬浮培养大鼠胚胎神经干细胞,脂质体介导PcDNA3-GDNF-GFP质粒转染神经干细胞,荧光显微镜观察转染及表达情况;免疫细胞化学鉴定β-微管蛋白Ⅲ(β-Tubulin III)和酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH),以确定神经干细胞的分化为神经元和多巴胺能神经元情况。结果转染后72 h,荧光蛋白大量表达。脂质体介导PcDNA3-GDNF-GFP质粒转染神经干细胞后,神经干细胞分化为神经元和多巴胺神经元的比例明显增高。结论脂质体介导GDNF基因转染神经干细胞的方法简单、有效,是一较为理想的基因转染方法。GDNF基因能明显促进神经干细胞分化为神经元和多巴胺神经元的比例。     

人β3肾上腺素受体真核表达质粒pcDNA3.1(+)-β3-AR的构建及表达

目的构建人β3肾上腺素受体(β3-AR)的真核表达质粒pcDNA3.1( )-β3-AR,并通过脂质体介导转染HEK293细胞使之表达该受体蛋白。方法以pENTR_ADRB3-Stop质粒为模板,采用PCR法扩增出人β3-AR cDNA,将其插入真核表达载体pcDNA3.1( )中,构建成真核表达质粒pcDNA3.1( )-β3-AR。将该质粒转染HEK293真核细胞,通过RT-PCR检测β3-AR mRNA在HEK293细胞内的表达,通过免疫荧光法检测β3-AR蛋白在HEK293细胞中的表达。结果酶切和DNA测序鉴定均证实重组质粒含有人β3-AR编码区全长。在转染重组质粒pcDNA3.1( )-β3-AR的HEK293细胞中检测到了β3-AR基因的转录和翻译产物。结论通过基因工程方法成功构建了β3-AR的真核表达质粒pcDNA3.1( )-β-AR,为进一步建立β-AR的稳定表达细胞株,用于筛选高效、高选择性β-AR激动剂奠定了基础。     

人β-NGF基因在CHO细胞中表达的活性检测

目的 检测人β-NGF基因转染CHO细胞后培养上清中所表达的β-NGF的生物学活性。方法 采用脂质体介导的真核细胞转染，运用MTT法进行检测分析。结果 转染β-NGF基因的CHO细胞可分泌能促进PC12细胞生长的活性β-NGF。结论 转染β-NGF基因的CHO细胞所分泌的β-NGF接近自然合成的蛋白。具有较高的生物学活性。为NGF的生物制药奠定了实验基础。     

HBV X基因转染L02细胞及其蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响

目的探讨脂质体和电穿孔法在HBV X基因转染L02细胞中的差别及X基因蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响。方法构建HBV X基因重组表达质粒,通过电穿孔和脂质体法转染人正常肝细胞L02细胞,以绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)表达水平评价转染效率,流式细胞技术检测L02细胞HBV X蛋白的表达水平。RT-PCR、流式细胞技术及western-blot分析L02细胞、转染空载体以及转染HBV X基因重组表达质粒的L02细胞CⅡTA和HLA-DR的表达差别。结果采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000的转染效率为(6.4±3.5)%,显著低于电穿孔法(41.46±5.8)%,P<0.01。脂质体法转染的L02细胞HBV X蛋白表达水平为(5.1±3.9)%,显著低于电穿孔方法(37.5±4.1)%表达,P<0.01。转染了HBV X基因重组表达质粒的L02细胞检测到CⅡTA和HLA-DR mRNA和蛋白表达,而L02细胞本身及转染空载体的L02细胞未检测到CⅡTA和HLA-DR的表达。结论 HBV X基因真核表达载体pHBx-IRES2-EGFP通过电穿孔法转染L02细胞较脂质体法有明显较高的转染效率和更高的目的基因的表达,HBV X基因诱导了L02细胞中CⅡTA和HLA-DR的表达。     

阳离子脂质体Lipofectin介导的β-半乳糖苷酶基因在HepG2及GRC细胞株中的表达

目的：研究阳离子脂质体Lipofectin介导的β-半乳糖苷酶基因在不同肿瘤细胞株中的表达。方法：质粒pDCβ-在大肠杆菌DH5a中扩增后用碱裂解法提取，并经Sepharose 2B凝胶过滤柱层析，以Lipofectin分别转染人肝癌细胞株HepG2、人肾癌细胞株GRC，然后用X-gal细胞化学染色法检测β-半乳糖苷酶活性。结果：β-半乳糖苷酶活性在HepG2、GRC中均有表达。结论：阳离子脂质体Lipofectin是有效的细胞基因转染剂。     

Transfection of HBV X gene into human liver cell line L02 and its effect on CⅡTAand HLA-DR expression

目的 探讨脂质体和电穿孔法在HBV X基因转染L02细胞中的差别及X基因蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响.方法 构建HBV X基因重组表达质粒,通过电穿孔和脂质体法转染人正常肝细胞L02细胞,以绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)表达水平评价转染效率,流式细胞技术检测L02细胞HBV X蛋白的表达水平.RT-PCR、流式细胞技术及western-blot分析L02细胞、转染空载体以及转染HBV X基因重组表达质粒的L02细胞CⅡTA和HLA-DR的表达差别.结果 采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000的转染效率为(6.4±3.5)％,显著低于电穿孔法(41.46±5.8)％,P＜0.01.脂质体法转染的L02细胞HBV X蛋白表达水平为(5.1±3.9)％,显著低于电穿孔方法(37.5±4.1)％表达,P＜0.01.转染了HBV X基因重组表达质粒的L02细胞检测到CⅡTA和HLA-DR mRNA和蛋白表达,而L02细胞本身及转染空载体的L02细胞未检测到CⅡTA和HLA-DR的表达.结论 HBV X基因真核表达载体pHBx-IRES2 -EGFP通过电穿孔法转染L02细胞较脂质体法有明显较高的转染效率和更高的目的基因的表达,HBV X基因诱导了L02细胞中CⅡTA和HLA-DR的表达.     

大鼠β-防御素-2的重组表达及抗菌活性检测

目的 构建大鼠β-防御素-2(rBD2)基因的真核表达载体pCAGG-rBD2,并转染小鼠纤维母细胞(L929),为解决细菌耐药性问题提供进一步的实验基础.方法 以大鼠肺组织总RNA为模板,采用RT-PCIL的方法获得β-防御素-2基因cDNA,将其克隆到pGEM-T Easy载体并构建含有目的 片段的真核表达载体pCAGG-rBD2,经脂质体介导转染L929细胞,通过RT-PCR和Western blotting检测目的 基因表达情况.结果 成功克隆并构建了合有目的 基因rBD2的真核表达载体pCAGG-rBD2,转染pCAGG-rBD2的细胞中检测到了rBD2基因在转录水平和蛋白水平的表达,其细胞培养的上清液对金黄色葡萄球菌具有杀灭作用.结论 防御素在真核表达系统的成功表达,为进一步开发高效能杀灭耐药性致病微生物的多肽类新药提供实验基础和理论依据.     

EGFP-N1/hNGF β逆转录病毒载体的构建及其表达

目的 构建高表达含人神经生长因子β基因(hNGF-β)的逆转录病毒栽体,并检测其在施万细胞中的表达情况.方法 从含有hNGF-β的pAAV-SP质粒中克隆出hNGF-β,连接到pEGFP-N1载体中,形成重组逆转录病毒载体pEGFP-N1-NGFβ.用重组体转染施万细胞,经G418筛选出阳性克隆后,用ELISA法检测NGF的表达量.结果 hNGF-β的RT-PCR产物约750bp,双酶切鉴定重组载体为正确重组子.荧光显微镜下观察证实转染的施万细胞表达EGFP,ELISA检测证实转染的施万细胞分泌hNGF β升高.结论 应用体外连接法成功构建了hNGF-β逆转录病毒载体,而且施万细胞能够高效表达NGF β.     

野生型DNA聚合酶β 在肺腺癌细胞中的表达研究

目的研究人野生型DNA聚合酶β基因编码的蛋白质在肺腺癌A549细胞株内的表达。方法将人重组的携带野生型的DNA聚合酶β基因真核绿色荧光表达载体βEGFP—C3-βolβ用脂质体介导的方法转染A549细胞株，用荧光倒置显微镜观察转染细胞，RT-PCR检测其在核酸水平的表达。结果野生型的DNA聚合酶β基因转染细胞后主要定位于细胞核内，而不舍DNA聚合酶β基因的空质粒转染细胞后则主要表达在胞浆中，RT—PCR证实转染细胞中的野生型的DNA聚合酶β比未转染细胞表达量高。结论野生型的DNA聚合酶β基因在A549细胞中表达，且定位于胞核内，这对进一步研究肺癌的发生发展奠定了基础。     

骨髓间充质干细胞的肌源性诱导分化及转染VEGF基因的表达

目的 体外诱导兔骨髓间充质干细胞向肌源性细胞分化,并观察血管内皮生长因子AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒转染骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)后的表达。方法 将20只兔随机分为对照组和实验组,从骨髓液中分离MSCs,对照组以低糖DMEM培养,实验组加用5-氮胞苷(10 mmol/L)诱导培养,第28天进行肌钙蛋白I免疫组化染色。另构建AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒,通过脂质体转染对照组MSCs,用Northern blotting和Western blotting鉴定血管内皮生长因子(VEGF)的表达,并用ELISA法测定培养上清液中VEGF的浓度。结果 成功分离培养出兔MSCs,实验组经5-氮胞苷诱导后MSCs向肌源性细胞分化,肌钙蛋白I免疫组化染色阳性。成功构建AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒并通过脂质体转染MSCs,Northern blotting示转染的MSCs VEGF165表达信号明显强于未转染细胞,Western blotting 示转染VEGF165基因的MSC表达VEGF,ELISA法测定培养上清液中VEGF的浓度在转染后第3天(1 011 pg/ml)和第5天(1 027 pg/ml)达高峰,此后逐渐下降,但至第13天(349 pg/ml)仍显著高于空白对照(116 pg/ml)和pAdTrackCMV组(125 pg/ml),P<0.01。结论 兔骨髓间充质干细胞可在体外向肌源性细胞分化,转染VEGF基因可表达VEGF,有望将干细胞移植和基因治疗结合以治疗缺血性心脏病。     

三种非病毒载体转染方法的比较

目的：对目前广泛使用的磷酸钙转染法、脂质体转染法以及新兴的壳聚糖转染法这三种非病毒转染载体进行比较。方法：以成肌细胞系C2C12为宿主细胞，含氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因的质粒pcDNA3．1 CAT为靶DNA，采用3种不同的方法转染细胞，酶联免疫吸附测定(ELISA)细胞裂解液中CAT的相对含量。结果：脂质体法转染的细胞裂解液中CAT含量最高，磷酸钙法所转染的细胞裂解液中CAT含量最低。结论：经商品化的转染试剂lipofectamine 2000在此三种转染试剂中具有最高的转染效率。作为一种天然材料，壳聚糖亦有较高的转染效率。     

重组质粒pLMP1-p53mt的构建与表达

目的构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的双基因真核表达质粒,为研究突变型p53基因和EB病毒LMP1基因在鼻咽癌发生中的相互作用奠定基础.方法通过分子克隆技术,构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1-p53mt;培养HeLa细胞,采用脂质体lipofectAMINETM 2000将该质粒转入HeLa细胞中,转染后48h,利用免疫细胞化学法研究突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的表达情况.结果重组质粒限制性内切酶酶切及PCR鉴定结果与预期一致;观察到转染细胞中突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的高效表达.结论成功构建了含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的双基因真核表达质粒.     

重组人转化生长因子-β1荧光质粒的构建及转染软骨细胞的基因表达

目的：探讨重组人转化生长因子（TGF）-β1荧光质粒的构建及经脂质体转染软骨细胞的表达情况.方法：体外酶消化分离法培养兔关节软骨细胞并采用特异性细胞外基质Ⅱ型胶原免疫细胞染色进行鉴定.双酶切法切取TGF-β1的cDNA片段,通过T4 DNA连接酶连接到pEGFP-C1载体上构建pEGFP-C1-TGF-β1表达质粒.用构建的pEGFP-C1-TGF-β1表达质粒经脂质体转染软骨细胞,在12、24 h、2、4、6 d通过荧光显微镜观察细胞内TGF-β1基因的表达,应用荧光定量PCR检测表达水平.结果：成功分离培养软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞染色显示细胞胞质染成棕黄色,胞核基本不着色.pEGFP-C1-TGF-β1真核表达载体质粒成功构建,酶切及测序结果证明表达质粒的DNA序列完全正确.荧光显微镜观察转染后的软骨细胞有绿色荧光蛋白表达,软骨细胞的转染率分别为12 h：（8.22±2.02）%,24 h：（16.54 4±2.91）%,2 d：（14.06±3.67）%,4 d：（14.24±2.62）%,6 d：（12.36±2.28）%.荧光定量PCR检测转染软骨细胞TGF-β1基因拷贝数为16 277±1779,高于未转染软骨细胞的3095±205（P〈0.05）.结论：构建的TGF-β1荧光质粒可以转染软骨细胞并获得表达,为基因治疗骨性关节炎的研究提供基础.