α1-抗胰蛋白酶真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的 构建鼠α1-抗胰蛋白酶(AAT)的真核表达载体,观察其在NIH 3T3细胞中的表达及定位情况.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到AAT编码序列.然后将该编码序列克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,随后转染NIH 3T3细胞,在荧光显微镜下观察结果.结果 重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定证明构建正确.转染实验发现,该质粒能够在NIH 3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞质中.结论 成功构建带HA标签的AAT真核表达载体.该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位,为下一步深入研究AAT在细胞内的相关生物学功能提供了一个重要工具.     

组蛋白变异体macroH2A1真核表达载体构建及其细胞内定位的研究

目的构建带有血凝素(HA)标签的小鼠组蛋白变异体macroH2A1(mH2A1)的真核表达载体,并观察其在人胚肾293T细胞中的表达定位情况。方法提取内毒素休克的BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过逆转录-聚合酶链反应获得内毒素休克小鼠肝脏组织的cDNA,以cDNA为模板使用PCR方法扩增得到mH2A1编码序列,并将其酶切后连接至带有HA标记的载体pcDNA3-HA上;对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。随后将重组质粒瞬时转染293T细胞,利用荧光显微镜观察。结果 PCR、双酶切和测序鉴定表明pcDNA3-mH2A1-HA真核表达质粒构建正确;经转染实验发现,该质粒能够在293T细胞中表达,表达产物主要定位在细胞核中。结论 mH2A1真核表达载体pcDNA3-mH2A1-HA的成功构建及明确其在哺乳动物细胞中的具体核定位,为进一步研究mH2A1作用细胞的信号通路提供了一个重要的工具。     

Galectin-3重组真核表达载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的:构建半乳糖凝集素-3(Gal-3)的真核表达载体,在NIH/3T3细胞中表达,并检测其表达?方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肿瘤细胞克隆Gal-3基因,插入真核表达载体pEGFP-N1中,通过酶切和测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pEGFP-Gal-3瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光和Western blot方法检测Gal-3表达,MTT法检测Gal-3对NIH/3T3细胞增殖的影响?结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建含Gal-3的重组真核表达载体pEGFP-Gal-3?以重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,检测到Gal-3蛋白表达,并证实Gal-3蛋白促进NIH/3T3细胞增殖?结论:成功构建的pEGFP-Gal-3真核表达载体在小鼠NIH/3T3细胞中成功表达,并促进NIH/3T3细胞增殖?     

人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达.方法 以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因.序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况.结果 PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1, 经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和 850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank 序列号NM_000209)序列一致.证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1 中.Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达.结论 成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达.     

小鼠T-bet基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠T—bet基因重组真核表达载体pcDNA3一T—bet,为T—bet基因治疗研究提供有效的生物表达系统。方法采用内切酶切从质粒T—bet/GFP—RV中获得约1.7 kb的小鼠T—betcDNA片段,以单酶切非定向克隆方式与真核表达质粒pcDNA3连接,构建真核表达载体pcDNA3-T-bet。结果经PCR筛选阳性重组子,双酶切鉴定T—bet基因重组方向,并测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变。结论本实验成功构建了小鼠T—bet基因真核表达载体pcDNA3-T-bet。     

SV40T抗原真核表达载体的构建及表达

目的:构建SV40T抗原的特异性真核表达载体,并导入胃癌细胞株SGC7901进行表达鉴定.方法:扩增小鼠H /K ATPase β亚基启动子,与pMT18-T载体相连,并将其亚克隆至真核表达载体 pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)/HK; 从含有SV40T基因的pLITAg质粒酶切回收SV40T基因,与pcDNA3.1(-)/HK相连,构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV,同时构建非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,进行酶切及测序鉴定.用脂质体转染的方法将构建的载体导入胃癌细胞株SGC7901,PCR扩增基因组DNA,RT-PCR检测SV40T mRNA的表达.结果:限制性内切酶分析与测序结果显示,真核表达载体pcDNA3.1/HKSK构建成功;转染该载体的SGC7901细胞可检测到SV40T基因DNA的存在,且有SV40T mRNA的表达.结论:特异性表达SV40T基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV构建成功.     

白蛋白融合蛋白表达载体的构建及其在细胞中的表达和定位

目的：构建白蛋白-血凝素（Alb-HA）融合蛋白的真核表达载体,观察Alb在NIH3T3细胞中表达和定位。方法：采用两步克隆法将HA和Alb的编码序列以融合表达的形式克隆到载体pcDNA3上,随后转染NIH3T3细胞在荧光显微镜下观察Alb的表达和分布。结果：重组质粒经酶切、聚合酶链反应（PCR）和测序鉴定证明构建正确,并在NIH3T3细胞中大量表达,免疫荧光标记后在荧光显微镜下观察,Alb-HA融合蛋白分布于细胞质内。结论：成功构建Alb-HA融合蛋白表达载体并表达于NIH3T3细胞中,为下一步深入研究Alb的细胞内功能奠定了基础。     

人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况。结果PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank序列号NM_000209)序列一致。证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1中。Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达。结论成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达。     

重组人釉原蛋白真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的构建含人釉原蛋白(hAm)基因的重组真核表达质粒并转染哺乳动物细胞NIH3T3,建立稳定表达重组hAm的细胞株,为临床应用奠定基础。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ将hAm基因插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A,构建含hAm基因的重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm,双酶切和测序鉴定。通过LipofectamineTM2000介导重组质粒转染NIH3T3细胞,利用G418筛选出阳性克隆,建立稳定表达人釉原蛋白的细胞株,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting验证蛋白表达。结果重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。重组质粒转染NIH3T3细胞后建立的稳定转染细胞株经SDS-PAGE电泳及Western blotting检测显示有相对分子质量为28 000的hAm表达,与预测一致。结论成功构建含hAm基因的重组真核表达系统,并获得稳定表达重组hAm的细胞株NIH3T3-hAm细胞株。     

大鼠干扰素诱导蛋白-10的体外表达和鉴定

目的 构建大鼠干扰素诱导蛋白-10(IP-10)真核表达载体,在NIH3T3细胞中表达重组载体pcDNA3.1(+)-IP-10,并对其表达产物进行鉴定.方法 通过PCR扩增IP-10基因片段,通过酶切和连接反应,构建IP-10的真核表达载体pcDNA3.1(+)-IP-10,重组载体经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定等证实构建成功后,用PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞,免疫荧光技术检测pcDNA3.1(+)-IP-10在NIH3T3细胞的表达情况.转染的Nm3T3细胞通过G418筛选出稳定表达的细胞克隆,Western Blotting鉴定IP-10蛋白在细胞培养上清的表达情况.结果 酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,IP-10基因被成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),免疫荧光技术检测证实重组载体可在NIH3T3细胞表达.Western Blotting结果显示细胞培养上清有IP-10蛋白表达.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-IP-10,为进一步研究其对Th1型自身免疫性疾病的治疗效果奠定基础.     

Smad2/3/4真核表达质粒的构建及重组蛋白表达

目的:构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内表达。方法:以pcDNA3.1-Smad2/3和pGEX2T-Smad4质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Smad2/3/4全长编码基因,亚克隆至含有pcDNA3.1myc-HisA 标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293 中,提取细胞蛋白进行 Western blotting 检测。结果：Smad2/3/4 全长基因序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1myc-HisA中,酶切鉴定片段为1 401、1 275和1 656 bp。Western blotting检测到融合蛋白pcDNA3.1myc-HisA- Smad2/3/4的表达。结论:成功构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,同时鉴定其融合蛋白的表达。     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3/GRA1的构建及序列测定

目的 :构建弓形虫致密颗粒抗原 1 (GRA1 )真核表达质粒 ,为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法 :采用PCR扩增出编码GRA1目的基因 ,用EcoRⅠ /XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切 ,将GRA1定向克隆到pcDNA3EcoRⅠ /XhoⅠ位点 ;对重组质粒进行PCR ,双酶切初步鉴定后做序列测定。结果 :特异扩增出预计的GRA1片段 ,大小为 5 73bp ;扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中 ,经PCR ,双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框。结论 :成功构建弓形虫GRA1真核表达质粒。     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3／GRA1的构建及序列测定

目的：构建弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)真核表达质粒，为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法：采用PCR扩增出编码GRAl目的基因，用EcoR Ⅰ／XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切，将GRA1定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ／XhoⅠ位点；对重组质粒进行PCR，双酶切初步鉴定后做序列测定。结果：特异扩增出预计的GRAl片段，大小为573bp；扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中，经PCR，双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框。结论：成功构建弓形虫GRAl真核表达质粒。     

The Effect of HBx Gene on the Apoptosis of Hepatic Cells

To study the effect of HBx gene on the apoptosis of the cell lines (L02, HepG2) and the interaction between HBx and X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP), the apoptosis of pcDNA3.1-HBx transiently transfected cell lines (L02, HepG2) was detected by flow cytometry and the mRNA expression of XIAP was assayed by real-time RT-PCR. Our study showed (1) the mor- phology of L02/pcDNA3.1-HBx was changed and the appearance of the cells mimicked that of HepG2 cells; (2) HBx gene could be detected in L02/pcDNA3.1-HBx and HepG2/ pcDNA3.1-HBx; (3) the apoptosis rate of L02/pcDNA 3.1-HBx was higher than that of L02 cells (P<0.01) and the apoptosis rate of HepG2/pcDNA3.1-HBx was lower than that of HepG2 cells (P<0.05); (4) the XIAP expression in L02 was about 3 times that in L02/pcDNA3.1-HBx cells (P<0.01), and the expression of XIAP in HepG2/pcDNA3.1-HBx was about 4 times that in HepG2 (P<0.01). It is concluded that HBx gene may promote the apoptosis of normal hepatocytes and inhibit the apoptosis of cells of he- patic carcinoma by regulating the expression of XIAP.     

部分骨钙素启动子控制荧光素酶基因真核载体的构建及表达

目的 构建部分骨钙素启动子控制荧光素酶报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc，转染细胞后检测报告基因对rhBMP-2的反应，以期用于rhBMP活性的定量测定。方法 用PCR方法扩增骨钙素部分启动子147bp，克隆入pGEM-3zf(-)中，经酶切鉴定和序列分析正确后，亚克隆人能稳定高效表达荧光素酶的真核表达载体pcDNA3-Luc中，构建真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc，然后分别将pcDNA3-Luc和pcDNA3-OCP-Luc转染细胞，并检测其对rhBMP-2的反应。结果 成功构建了部分骨钙素启动子控制荧光素酶报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc；转染细胞后其报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc；转染细胞后其报告基因的基础活性较pcDNA3-Luc大为降低，而且报告基因的表达与rhBMP-2剂量在一定范围内成线性正相关。结论 真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc的报告基因表达具有特异性，可代替直接测定骨钙素用于rhBMP-2活性的定量测定研究。     

人真核表达质粒载体pcDNA3/HA-moesin的构建及其在内皮细胞中的表达

目的：构建人膜突蛋白（moesin）的真核表达质粒pcDNA3/HA-moesin,并检测其在内皮细胞中的表达。方法：采用RT-PCR法从人脐静脉内皮细胞株（HUVECs）中克隆得到moesin cDNA全长序列,经双酶切后连接到真核表达载体pcDNA/HA中,挑选出的阳性克隆经双酶切和测序鉴定后,经脂质体转染法转入HUVECs中,采用Realtime PCR及Western blot等方法检测目的基因mRNA及蛋白的表达。结果：pcDNA3/HA-moesin质粒经双酶切鉴定和DNA测序证实,目的基因moesin的序列完全正确,真核表达质粒构建成功。Realtime PCR检测显示,转染pcDNA3/HA-moesin组的moesin mRNA表达水平明显高于未转染组和转染pcDNA3/HA空载体组,后2组间无明显差异。Western blot结果显示转染pcDNA3/HA-moesin组有HA-moesin蛋白表达,而未转染组和转染pcDNA3/HA空载体组未检测到HA-moesin表达。结论：成功构建pcDNA3/HA-moesin真核表达载体,在体外转染HUVECs后可使moesin mRNA表达增加,并成功表达HA-moesin,为进一步鉴定内皮细胞中晚期糖基化终产物（AGEs）引起的moesin的磷酸化位点奠定了实验基础。     

大鼠细胞色素P450—2J3基因的克隆及其在293细胞中的表达

目的克隆大鼠CYP2 J3基因并构建pcDNA 3.1( )-CYP2 J3真核表达载体,检测其在293细胞中的表达。方法提取大鼠肝脏组织总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和重叠延伸聚合酶链反应(OE-PCR)扩增大鼠CYP2 J3基因,克隆入真核表达载体pcDNA 3.1( )。脂质体转染293细胞,用W estern b lotting鉴定其在293细胞表达。结果运用RT-PCR和OE-PCR获得CYP2 J3基因开放读码框架(ORF)全长序列,经酶切鉴定正确。测序结果与基因Gen Bank提交序列完全一致并成功构建真核表达载体pcDNA 3.1( )-CYP2 J3。W estern b lotting结果显示,转染pcD-NA 3.1( )-CYP2 J3后的293细胞能稳定有效表达CYP2 J3蛋白。结论大鼠CYP2 J3基因的成功克隆以及pcDNA3.1( )-CYP2 J3载体的成功构建,为CYP2 J3基因的功能研究和相关疾病的研究提供了可行的工具。     

血管内皮细胞生长因子在哺乳动物细胞的表达

目的：本实验试图构建具有生物学活性的ＶＥＧＦ真核表达载体,为ＶＥＧＦ基因治疗提供载体。方法：将已获得的ｈＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ克隆到ＧＳＴ融合表达载体,构建原核表达质粒,转染大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定表达产物。在此基础上构建真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ ／ｈＶＥＧＦ１６５,脂质体介导转染ＣＨＯ－Ｋ１细胞,Ｇ－４１８筛选,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ,Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ ｂｌｏｔ分别检测其在细胞内的转录和表达情况,３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测表达蛋白的活性。结果：实验组的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ出现特异性条带,而对照组在相应部位未出现条带。实验组的大鼠心肌血管内皮细胞３Ｈ－ＴｄＲ掺入率明显高于对照组（Ｐ＜ ０．００１）。结论：本实验所构建的ＶＥＧＦ真核表达质粒能够在真核细胞内获得表达,其表达产物具有血管内皮细胞增殖刺激活性。     

人重组Oct3/4真核表达载体构建及在卵巢癌细胞中的表达研究

目的 构建人Oct3/4真核表达载体并转染人卵巢癌细胞株(SKOV3),观察Oct3/4在SKOV3稳定细胞株中的表达.方法 采用RT-PCR技术扩增获得目的 基因Oct3/4 cDNA产物,利用pcDNA3.1载体质粒构建人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,酶切及DNA测序鉴定.利用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒转染SKOV3,以空载体转染细胞和未转染细胞作为转染对照组和阴性对照组.经G418(neomycin)筛选获得SKOV3稳定转染细胞株,Western blotting分析检测细胞Oct3/4蛋白的相对表达水平.结果 PCR扩增产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定目的 基因条带大小约1 000 bp,与理论预期值一致.构建完成人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,DNA测序结果与GenBank数据库进行比对序列一致.Western blotting检测显示,转染pcDNA3.1-Oct3/4组稳定转染细胞中Oct3/4蛋白相对表达量(10.225±0.987)显著高于转染对照组(1.713±0.896)和阴性对照组(校正值为1)(P＜0.01).结论 成功构建人重组0ct3/4真核表达载体并转染SKOV3,稳定转染细胞株中Oct3/4蛋白呈稳定过量表达.实验为进一步研究Oct3/4基因在卵巢癌发生、发展及耐药机制中的作用奠定了基础.     

人重组Oct3／4真核表达载体构建及在卵巢癌细胞中的表达研究

目的 构建人Oct3/4真核表达载体并转染人卵巢癌细胞株（SKOV3）,观察Oct3/4在SKOV3稳定细胞株中的表达.方法 采用RT-PCR技术扩增获得目的 基因Oct3/4 cDNA产物,利用pcDNA3.1载体质粒构建人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,酶切及DNA测序鉴定.利用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒转染SKOV3,以空载体转染细胞和未转染细胞作为转染对照组和阴性对照组.经G418（neomycin）筛选获得SKOV3稳定转染细胞株,Western blotting分析检测细胞Oct3/4蛋白的相对表达水平.结果 PCR扩增产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定目的 基因条带大小约1 000 bp,与理论预期值一致.构建完成人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,DNA测序结果与GenBank数据库进行比对序列一致.Western blotting检测显示,转染pcDNA3.1-Oct3/4组稳定转染细胞中Oct3/4蛋白相对表达量（10.225±0.987）显著高于转染对照组（1.713±0.896）和阴性对照组（校正值为1）（P＜0.01）.结论 成功构建人重组0ct3/4真核表达载体并转染SKOV3,稳定转染细胞株中Oct3/4蛋白呈稳定过量表达.实验为进一步研究Oct3/4基因在卵巢癌发生、发展及耐药机制中的作用奠定了基础.