CH50多肽对IFN-γ基因转染癌细胞体内生长及免疫刺激作用的影响

探讨重组FN多肽CH50对IFN-γ基因转染癌细胞体内生长及免疫刺激作用的影响。将小鼠IFN-γ基因转染黑色素瘤B16/Fl细胞,测定其表达产物与CH50协同刺激巨噬细胞产生NO的作用、转染细胞接种小鼠并注射CH50时对脾细胞的免疫刺激作用及瘤细胞的体内生长特性。结果表明,转染细胞表达产物可与CH50协同作用刺激巨噬细胞产生NO。转染细胞表达IFN-γ水平较低,仍可在体内形成肿瘤,注射CH50能够抑制其形成肿瘤。基因转染细胞和CH50能够促进脾细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。研究表明,CH50不仅可以提高肿瘤疫苗的安全性,也可以提高肿瘤疫苗刺激机体免疫系统的作用。并提示,表达CH50和IFN-γ双因子的肿瘤疫苗可为提高肿瘤疫苗治疗肿瘤的效果开辟新的途径。     

结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6 的构建、鉴定及免疫效应评价

目的构建结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6并探讨其诱导的免疫效应。方法将扩增自结核杆菌基因组的ESAT-6基因
装入pVAX1载体构建pVAX1/ESAT-6重组质粒;经酶切、测序鉴定后,利用阳离子聚合物介导将重组质粒pVAX1/ESAT-6转染
Hela细胞,分别以RT-PCR法检测ESAT-6 mRNA的表达、间接免疫荧光法检测ESAT-6蛋白表达。重组质粒经体内电转染免疫
小鼠后,采用ELISA法测定小鼠血清中IFN-γ及抗ESAT-6 特异性抗体IgG 的水平;流式细胞术检测小鼠淋巴细胞增殖水平;
ELISPOT检测产生IFN-γ的淋巴细胞频数。结果构建的重组质粒pVAX1/ESAT-6经双酶切于3000 bp和300 bp处各见1条带,
测序结果显示插入序列与ESAT-6基因序列无差异。重组质粒转染Hela细胞后,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳于约300 bp处
见目的条带,间接免疫荧光检测显示特异性绿色荧光。重组质粒免疫小鼠后,血清中抗ESAT-6特异性抗体IgG水平较对照组
（空质粒组和生理盐水对照组）明显升高;血清中IFN-γ水平、小鼠脾淋巴细胞增殖水平及产生IFN-γ的淋巴细胞数明显均高于对
照组（空质粒组和生理盐水对照组）。结论成功构建了结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6,该疫苗可有效诱导小鼠产生特异性细
胞免疫和体液免疫效应。
     

蝉拟青霉多糖活性组分的筛选

目的:筛选出蝉拟青霉多糖中的活性组分.方法:体外培养小鼠黑色素瘤细胞B16,观察各多糖组分及其刺激脾细胞上清液对B16细胞的抑制作用.结果:经蝉拟青霉多糖组分PcPSA和PcPSB刺激的脾细胞上清液具有抑制B16细胞的作用.结论:经体外培养的B16细胞的抑制试验筛选出2个活性多糖组分PcPSA和PcPSB.     

卡介苗热休克蛋白70对肿瘤细胞裂解物免疫原性的影响

的：观察卡介苗热休克蛋白70（BCGHSP70）对肿瘤细胞裂解物（TCL）免疫原性的影响,为TCL相关肿瘤疫苗的制备提供依据。方法：应用冻融法制备B16黑色素瘤细胞裂解物B16TCL,将BCGHSP70与B16TCL在体外混合制备BCGHSP70-B16TCL。将C57BL/6小鼠随机分为BCGHSP70-B16TCL组、PBS组、BCGHSP70组和B16TCL组,分别于第1和14天皮下免疫BCGHSP70-B16TCL、PBS、BCGHSP70和B16TCL。于末次免疫后第7天处死小鼠,MTT法观察不同免疫组小鼠脾淋巴细胞在B16TCL体外刺激后的增殖情况,计算刺激指数（SI）。结果：应用冻融法能够使B16细胞完全裂解,所制备的B16TCL中含有丰富的蛋白成分。与PBS组、BCGHSP70组和B16TCL组比较,BCGHSP70-B16TCL组免疫小鼠脾脏明显增大;BCGHSP70-B16TCL免疫组SI高于PBS免疫组（P=0.00）、 B16TCL免疫组（P=0.01）和BCGHSP70免疫组（P=0.00）。结论：BCGHSP70　能够增强B16TCL的免疫原性,提示BCGHSP70可能作为有效的免疫佐剂用于TCL相关肿瘤疫苗的研究。     

双功能分子白介素-2-粒细胞-巨噬细胞集落生长因子促进树突状细胞在肿瘤免疫抑制环境中的活化效应

目的将本室构建与制备的双功能分子白介素-2-粒细胞-巨噬细胞集落生长因子（IL2-GMCSF）蛋白作用于肿瘤条件培养
基（TCM）环境中的树突状细胞系（DC）,检测其对DC细胞的活化,探讨其用于活化DC、进行抗肿瘤免疫治疗的可能性。方法
制备小鼠黑色素瘤B16F10 细胞系的TCM,用以培养DC2.4 细胞,同时分别添加IL2-GMCSF、GM-CSF、IL-2、或IL-2 与
GM-CSF组合使用。24 h后,检测DC2.4细胞的吞噬与增殖活性、细胞成熟表型、细胞因子分泌与信号通路活化。结果DC2.4
细胞具有未成熟DC的特征,在TCM培养条件下吞噬能力增强、但增殖活性显著受抑,TCM对DC成熟表型表面标志的表达有
一定促进作用,并促进单核与DC来源的趋化因子（MDC）,但抑制DC的IL-12 分泌。与之相反,IL2-GMCSF 主要借助其
GM-CSF 活性,促进DC2.4 细胞的吞噬与增殖活性,并促进DC 进一步成熟,且高表达IL-12 与MDC。与GM-CSF 相比,
IL2-GMCSF可诱导更高的炎性NF-κB通路活化水平,而抑制调节性STAT3 通路的活化。结论与GM-CSF单独作用相比,
IL2-GMCSF可更好地促进肿瘤免疫抑制环境中的DC活化,有望成为有效的临床抗肿瘤治疗手段。
     

人参皂苷Rg3体外抗HSV-1活性与免疫调节效应

目的：研究人参皂苷Rg3体外对单纯疱疹病毒1型 (HSV-1)的抑制作用与免疫调节效应。方法：采用结晶紫染色法观察Rg3对HSV-1致细胞病变效应的抑制作用。用MTT比色法检测Rg3对Vero细胞和小鼠脾细胞增殖的影响。以Rg3诱导小鼠脾细胞,用鼠脾T淋巴母细胞增殖分析法测定上清中IL-2活性,细胞病变抑制法测定IFN-γ活性。结果：浓度在1.56～25 m g•L^-1的Rg3对HSV-1致细胞病变效应抑制作用显著高于病毒对照组 (P<0.05);浓度小于25 mg•L^-1的Rg3对传代Vero细胞及小鼠脾细胞的增殖作用与细胞对照组比较差异无显著性 (P>0.05); 3.13~6.25 mg•L^-1的Rg3体外诱生IL-2和IFN-γ分泌水平显著高于对照组( P<0.05)。结论：一定浓度的Rg3具有体外抗HSV-1活性,对传代Vero细胞及小鼠脾细胞无毒性,可显著促进IL-2和IFN-γ分泌,参与免疫调节效应。     

芥菜籽对小鼠变应性接触性皮炎的抑制作用

摘要：目的研究芥菜籽对小鼠变应性接触性皮炎(ACD)的抑制作用,探讨其可能的作用机制。方法将18只BALB/c小鼠随机
分为模型组、芥菜籽组、正常组,模型组和正常组喂养普通饲料,芥菜籽组喂养含5%芥菜籽饲料。3 周后,以2.4-二硝基氟苯
(DNFB)诱导小鼠ACD模型,耳部激发24 h后,观察芥菜籽对小鼠耳肿胀度,组织病理改变,皮损处朗格汉斯细胞（LC）浸润、局
部促炎细胞因子及血清IFN-γ等因子的水平。结果芥菜籽能抑制ACD 小鼠的耳肿胀度、降低皮损处LC浸润、降低IL-1β、
TNF-α、IL-6等炎症因子的表达（P<0.05）,但对血清IFN-γ、IL-4、IL-17水平没有影响（P>0.05）。结论芥菜籽对小鼠ACD有抑
制作用,可能与其抑制LC的迁移及降低炎症因子有关。
     

HLA-A＊0201/K^b及MAGE-3基因共转染B16细胞的制备及其在MAGE-3肿瘤疫苗评价中的作用

目的用HLA-A2.1转基因鼠制备荷瘤模型以评价肿瘤疫苗的免疫效果，制备共表达HLA-A0201/Kb嵌合基因和MAGE-3的B16黑色素瘤细胞。方法采用基因共转染的方法，将HLA-A0201/Kb和MAGE-3转染到B16黑色素瘤细胞（B16-HLA-MAGE-3），利用RT-PCR、细胞流式和western blot的方法检测了HLA-A0201/Kb和MAGE-3在B16黑色素瘤中的表达；通过测定CTL活性和体内抑瘤实验证实肿瘤抗原MAGE-3可以在B16-HLA-MAGE-3中得到有效加工处理和递呈。结果RT-PCR、细胞流式和western blot的方法检测到HLA-A0201/Kb和MAGE-3在B16-HLA-MAGE-3黑色素瘤中的表达；LDH的方法观察到MAGE-3疫苗免疫小鼠脾细胞对B16-HLA-MAGE-3细胞的特异性CTL反应，抑瘤实验也证实，B16-HLA-MAGE-3细胞在免疫小鼠体内生长明显受到抑制。结论MAGE-3基因在B16-HLA-MAGE-3黑色素瘤细胞中得到表达，并被有效的加工处理、提呈给特异性CD8＋T细胞；B16-HLA-MAGE-3细胞可以用来制备荷瘤模型，且该方法适合利用转基因小鼠用于人表位疫苗的体内评价。     

体外途径制备T细胞疫苗抑制异种免疫应答的作用

目的 探讨体外途径制备T细胞疫苗抑制异种免疫应答的作用. 方法 分别用体内抗原刺激法和体外抗原刺激法制备Balb/c小鼠针对Wistar大鼠的特异性T细胞疫苗,再分别用T细胞疫苗免疫Balb/c小鼠(1×105/次,腹腔注射),于免疫前和免疫后3 d,7 d,14 d获取小鼠的脾脏,分离小鼠脾淋巴细胞作为反应细胞,以Wistar大鼠脾细胞作为刺激细胞(体外灭活后)进行单向混合淋巴细胞反应(MLR),通过混合淋巴细胞反应比较体内抗原刺激法和体外抗原刺激法制备T细胞疫苗对异种免疫应答的抑制作用. 结果 经体外途径和体内途径制备的T细胞疫苗免疫小鼠,均可以显著抑制免疫小鼠脾淋巴细胞针对Wistar大鼠脾细胞的免疫应答,通过分析MLR的OD值可知,其作用效果与体内途径制备的TCV无显著差异(P＞0.05),TCV抑制效果于免疫后14 d达到最强. 结论体外方法制备的T细胞疫苗可以对异种免疫应答发挥显著抑制作用,体外方法制备的T细胞疫苗能达到体内抗原刺激途径制备的T细胞疫苗的免疫效果.     

异种黑色素细胞疫苗诱导小鼠抗恶性黑色素瘤免疫反应的机理研究

目的　研究异种黑色素细胞疫苗诱导小鼠抗恶性黑色素瘤免疫反应的机理。方法　制备异种黑色素细胞疫苗 ,免疫小鼠。采用间接 EL ISA法检测小鼠抗肿瘤抗体滴度及抗体亚型 ,纯化免疫球蛋白及进行体外抗肿瘤增殖 ,采用 Western blot法分析交叉抗原蛋白质。接种恶性黑色素瘤 ,观察肿瘤生长 ,采用免疫细胞去除法分析NK细胞及 T细胞亚群对疫苗抑瘤效应的影响。结果　异种疫苗免疫后 2周小鼠体内出现抗自身肿瘤抗体 ,产生的抗体以 Ig G为主 ,抗体认别的猪眼黑色素细胞及恶性黑色素瘤细胞交叉抗原为相对分子质量达 180× 10 3的蛋白质 ,纯化的免疫球蛋白在体外能抑制恶性黑色素瘤细胞增殖。异种疫苗诱导特异性保护性免疫反应使 90 %小鼠恶性黑色素瘤生长受到抑制 ,去除 NK细胞不影响疫苗抑瘤效应 ,去除 CD4 + T细胞使疫苗抑瘤效应消失 ,去除CD8+ T细胞 70 %小鼠恶性黑色素瘤生长仍受到抑制。结论　异种黑色素细胞疫苗诱导特异性体液免疫及细胞免疫反应 ,抑制恶性黑色素瘤的生长 ,CD4 + T细胞在这一过程中发挥了关键性作用。     

灵芝酸A对人骨肉瘤细胞增殖、凋亡和迁移的影响

目的探讨灵芝酸A对骨肉瘤细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法体外培养人骨肉瘤HOS和mg-63细胞与0.1、0.25 和
0.5 mmol/L的灵芝酸A孵育,采用CCK8检测HOS和MG-63细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Transwell检测细胞的迁移
和侵袭。Western blot 检测细胞中p-STAT3、STAT3、p-p38、p38和NF-ΚB1蛋白的表达变化。结果灵芝酸A能够显著抑制人类
骨肉瘤HOS和MG-63细胞的增殖,促进细胞凋亡以及抑制细胞迁移,并且这种效应存在剂量依赖性。与0.5 mmol/L 灵芝酸A
孵育能够显著降低HOS和MG-63细胞中STAT3的磷酸化水平,增加p38磷酸化水平,同时增加NF-κB1的表达水平。结论灵
芝酸A能够杀死人类骨肉瘤HOS和MG-63细胞,可以作为抗骨肉瘤的药物进行开发。
     

口服人α干扰素转化双歧杆菌促进小鼠淋巴细胞的增殖和成熟

目的探讨人α干扰素（IFN-α）基因转化双歧杆菌口服后对小鼠免疫功能的调节作用。方法构建含人IFN-α基因的大肠杆
菌-双歧杆菌穿梭表达载体pBADX-hIFNα2b,电转化获得IFN-α基因转化双歧杆菌,收集L-阿拉伯糖诱导hIFN-α2b表达后的菌
体制备成活菌悬液,灌胃Balb/C小鼠。实验组（IFN）小鼠用0.2% L-阿拉伯糖诱导表达后的hIFN-α2b转化双歧杆菌处理,每只
按0.1 ml 1010/ml活菌灌胃;阴性对照组（NC）用等量等体积空载体pBADX转化双歧杆菌活菌灌胃;空白对照组（BC）用等体积
生理盐水灌胃。隔天灌胃1次,连续处理2周。流式细胞术检测小鼠胸腺、脾脏和血液中淋巴细胞亚群和比例,流式试剂盒检测
IFN-γ、IL-4 等免疫因子的含量。结果与NS组和BC组相比,IFN组小鼠胸腺CD3+CD8+、CD4+CD8+细胞的比例显著升高（P<
0.01）;脾脏CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD4+CD8+细胞的比例均显著升高（P<0.01）;血液中只有CD3+CD8+细胞的比例显著升高
（P<0.01）。血液中IFN 组IFN-γ的含量比BC组和NS组显著升高（P<0.01）;此外,NS组IFN-γ的含量比BC组显著升高（P<
0.05）;三组小鼠中血液hIFN-α2b和IL-4的浓度无显著性差异（P>0.05）。结论口服hIFN-α转化的双歧杆菌促进小鼠胸腺和脾
脏淋巴细胞增殖和成熟,增高血液Th1类细胞因子水平。
     

高强度聚焦超声抑制小鼠黑色素瘤细胞B16-F10在体内的转移

目的在黑色素瘤的小鼠模型上,探讨高强度聚焦超声（HIFU）处理对黑色素瘤细胞体内转移的影响。方法皮下注射小
鼠黑色素瘤细胞B16-F10以构建小鼠黑色素瘤皮下移植瘤模型;待肿瘤最长径长至7~10 mm时进行HIFU处理,并设置实验对
照组（荷瘤鼠辐照HIFU但保持治疗头功率源开关关闭,即假照组）;治疗后每3 d测量肿瘤长径和短径,共观察3周,绘制肿瘤曲
线,统计生存率和转移率,并通过实时荧光定量PCR测定血液中黑色素瘤细胞3个标志物的相对表达量以监测血液中循环黑色
素瘤细胞的数量,它们分别是黑色素瘤相关抗原A3（MAGE-A3）、T细胞1识别的黑色素瘤抗原（MART1）以及同源转化成对框
基因转录因子PAX3);在HIFU治疗后14 d,通过尾静脉注射再次移植B16-F10细胞,观测其肺转移率。结果（1）各自的中位生
存时间及95 %可信区间（CI）：假照组分别为19.00 d和17.14~20.86 d,HIFU组则分别为26.00d和24.76~27.25 d,生存率差异显
著（P<0.01）;从治疗后第20天起,两组小鼠的肿瘤体积差异明显,从HIFU处理后第20天开始,包括处理后第23、26天,辐照组
小鼠肿瘤体积明显小于假照组（P<0.05）;（2）实时荧光定量PCR结果显示HIFU组小鼠在治疗后第7天的MAGE-A3、MART1
和PAX3三个指标都明显低于假照组（P<0.05）,在治疗后第14天其MAGE-A3的表达量仍然明显低于假照组（P<0.05）;（3）在
HIFU治疗后14 d通过尾静脉再次移植相同肿瘤细胞,HIFU组肺转移灶的数量明显低于假照组（P<0.05）,肿瘤转移抑制率为
42.4%。结论HIFU处理能够抑制黑色素瘤细胞在体内转移的发生,其机制可能涉及减少肿瘤细胞从原发灶的脱落和瘤细胞在
肺部的定植能力。
     

腺病毒介导靶向NF-κB基因的shRNA对体外食蟹猴子宫内膜细胞增殖活性的影响

目的合成高特异性靶向NF-κB基因的shRNA腺病毒载体,观察其对体外培养的食蟹猴子宫内膜细胞的增殖活动是否具
有直接的抑制效应。方法设计携带有NF-κB-p65基因及空载基因的shRNA腺病毒载体,体外培养食蟹猴子宫内膜细胞,分成
实验组及对照组,实验组转染携带NF-κB-p65 shRNA的腺病毒,对照组转染携带空载基因的腺病毒,共培养后观察有关细胞增
殖活性如凋亡蛋白及细胞周期的改变情况。结果腺病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,经包装产生的病毒滴度为
1.58×1011 U/ml。NF-κB-p65-shRNA腺病毒感染食蟹猴子宫内膜细胞后,实验组子宫内膜细胞凋亡蛋白的表达水平明显高于阴
性对照组（P<0.05）;实验组凋亡细胞较对照组明显增多,进入细胞分裂期细胞数明显少于对照组（P<0.05）。结论携带NF-κB
基因的腺病毒体外感染食蟹猴子宫内膜细胞后可加速子宫内膜细胞的凋亡,并抑制子宫内膜细胞的增殖,为后期该基因在食蟹
猴子宫内膜异位症模型上的研究提供理论基础。
     

卡博替尼阻断小鼠体内产单核细胞李斯特菌感染的实验研究

目的探讨c-Met受体酪氨酸激酶抑制剂卡博替尼作为抗产单核细胞李斯特菌（Listeria monocytogenes, LM）感染新型药物
的可能性。方法6周龄C57BL/6小鼠随机分为卡博替尼组、氨苄青霉素（Amp）组、卡博替尼和氨苄青霉素联合用药组和PBS
对照组。腹腔注射LM菌液后,再分别灌胃给予卡博替尼20 μg/g、腹腔注射氨苄青霉素20 μg/g、卡博替尼和氨苄青霉素联合用
药、以及腹腔注射等量PBS,比较4组小鼠的生存曲线、血液和脑组织细菌载量、血清IL-10和脑脊液中NF-κB p65含量、脑组织
中依文思蓝（EB）含量以及脑组织病理变化。结果卡博替尼组比对照组小鼠生存率增高、血液和脑组织的细菌载量明显减少
（P<0.05,P<0.001）;血清IL-10和NF-κB p65含量显著降低（P<0.05,P<0.01）;脑组织EB量降低（P<0.001）,脑组织病理变化减
轻。联合用药组比卡博替尼单独用药组小鼠血液和脑细菌载量（P均<0.001）、血清IL-10和NF-κB p65含量（P<0.01,P<0.001）、
脑组织EB量均明显减少（P<0.001）。结论酪氨酸激酶抑制剂卡博替尼对LM感染具有阻断作用,为研发新型抗胞内感染药物
提供重要理论依据。
     

沙利度胺对双膦酸盐相关颌骨坏死的影响

目的研究沙利度胺对双膦酸盐相关颌骨坏死的影响。方法36只大鼠随机分成A、B、C组,分别接受生理盐水、唑来膦
酸、唑来膦酸+沙利度胺治疗。用药3周后,拔除大鼠左上颌第1磨牙。拔牙后4、8周,收获标本,评价颌骨坏死、微血管生成及细
胞凋亡情况。结果拔牙后4、8周,大鼠上颌骨拔牙创处均无死骨裸露,但B组、C组部分标本可见一些小的瘘管。组织学检查
显示,A组标本未见死骨,而B组、C组在拔牙窝周围可见小块死骨。B组、C组拔牙窝周围区域空骨陷窝百分比和死骨面积显著
多于A组（P<0.01）,而骨陷窝密度则显著下降。B组、C组微血管密度较A组也显著降低,在4 周时分别下降了和25.87%和
55.27 %（P<0.01）,在8 周时分别下降了45.62% 和72.84%（P<0.01）;凋亡细胞数则在4 周时分别增长了54.80%和87.89%（P<
0.01）,在8周分别增长了208.08% 和250.58%（P<0.01）。结论沙利度胺加重了唑来膦酸诱发的早期阶段的颌骨坏死;沙利度
胺和唑来膦酸对颌骨坏死的作用与微血管生成抑制有关。
     

IFN-γ增强人γδT细胞杀伤骨肉瘤细胞的研究

目的研究干扰素-γ（IFN-γ）增强骨肉瘤患者γδ T细胞对骨肉瘤杀伤作用的影响。方法以唑来磷酸法扩增骨肉瘤患者外
周血γδ T细胞。分别使用实时荧光定量聚合酶链反应和流式细胞术检测IFN-γ处理前后骨肉瘤细胞Fas的表达情况;LDH法检
测骨肉瘤患者γδ T细胞对骨肉瘤细胞的杀伤活性。结果IFN-γ对骨肉瘤细胞Fas的表达明显提高（P<0.01）,骨肉瘤患者γδ T细
胞对骨肉瘤细胞的杀伤作用显著增强（P<0.01）。抗人FasL抗体对γδ T细胞杀伤OS细胞作用影响较小（P>0.05）;但能显著阻断
γδ T细胞杀伤IFN-γ预处理OS细胞的作用,差异均有统计学意义（P<0.01）。结论IFN-γ可增强骨肉瘤患者γδ T细胞的抗骨肉
瘤作用。
     

β-榄香烯联合DC/DRibble疫苗促进脾细胞增殖及活化研究

目的:通过观察β-榄香烯联合DC/DRibble疫苗对小鼠脾细胞增殖和IFN-γ分泌水平的影响,探讨β-榄香烯抗肿瘤的免疫机制。方法:制备Balb/c小鼠脾脏来源的树突状细胞(dentritic cell,DC)并鉴定其表型,以Balb/c小鼠来源的肝癌细胞株BNL1MEA.7R.1(BNL)为靶细胞,募集富含肿瘤"信息"的抗原载体—自噬小体(Drips in blebs,DRibble),制备DC/DRibble疫苗。用CCK-8法检测β-榄香烯联合DC/DRibble疫苗对脾细胞的增殖作用,用ELISA法检测培养上清液中IFN-γ的水平。结果:β-榄香烯在合适浓度下联合DC/DRibble疫苗能促进脾细胞增殖并刺激效应性淋巴细胞产生高水平的IFN-γ。结论:β-榄香烯可能通过增强DC抗原递呈功能以发挥抗肿瘤作用。