Vaspin对棕榈酸诱导的INS-1细胞自噬水平的影响

目的：研究脂肪细胞因子Vaspin对棕榈酸诱导的INS-1细胞自噬水平的影响。方法：培养INS-1细胞,分为正常组：用普通培养基培养24h;棕榈酸（palmiticacid,PA）组：以0.5mmol/LPA培养24h;PA+Vaspin组：先加入320ng/mLVaspin预培养2h,再以0.5mmol/LPA+320ng/mLVaspin共培养24h;PA+Vaspin+雷帕霉素（rapamycin）组：先以50nmol/LRapamycin预培养2h,再以0.5mmol/LPA+320ng/mLVaspin共培养24h;PA+Vaspin+3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）组：先以1mmol/L3-MA预培养2h,再以0.5mmol/LPA+320ng/mLVaspin共培养24h。葡萄糖（3.3mmol/L和16.7mmol/L）刺激胰岛素分泌实验检测各组胰岛素分泌水平,Westernblot检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）、p-mTOR、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及P62蛋白水平,mRFP-GFP-LC3检测自噬流水平,流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果：与正常组相比,PA组INS-1细胞上清液中胰岛素分泌水平在3.3mmol/L葡萄糖和16.7mmol/L葡萄糖刺激下均降低[（1.02±0.08）ng/mLvs.（0.54±0.06）ng/mL,P=0.000;（1.15±0.13）ng/mLvs.（0.71±0.05）ng/mL,P=0.000）],PA+Vaspin组较PA组升高[（0.76±0.03）ng/mLvs.（0.54±0.06）ng/mL,P=0.001;（0.91±0.04）ng/mLvs.（0.71±0.05）ng/mL,P=0.011）];与正常组相比,PA组INS-1细胞p-mTOR与mTOR蛋白比值低（2.04±0.14vs.1.19±0.09,P=0.000）,PA+Vaspin组p-mTOR与mTOR蛋白比值较PA组高（1.51±0.05vs.1.19±0.09,P=0.005）;同时,PA组自噬相关蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值与正常组相比明显增加（0.81±0.07vs.0.65±0.04,P=0.005;2.35±0.25vs.1.16±0.11,P=0.000）,P62蛋白水平降低（1.04±0.19vs.0.60±0.08,P=0.000）;PA+Vaspin组Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平较PA组低（0.58±0.04vs.0.81±0.07,P=0.001;1.95±0.08vs.2.35±0.25,P=0.007）,P62蛋白增加（0.82±0.03vs.0.60±0.08,P=0.032）;PA组自噬溶酶体数量较正常组多（8.33±1.53vs.0.33±0.58,P=0.000）,Vaspin干预后降低（3.67±1.53vs.8.33±1.53,P=0.001）;同时,PA干预INS-1细胞24h后细胞凋亡明显增加（7.91±0.50vs.22.15±2.05,P=0.000）,PA+Vaspin组较PA组细胞凋亡减少（13.23±1.97vs.22.15±2.05,P=0.000）。结论：Vaspin能够改善棕榈酸诱导的INS-1细胞过度自噬和细胞凋亡,改善胰岛β细胞分泌功能。     

姜黄素通过提高Rab家族蛋白的表达增强N2a/APP695swe细胞的自噬作用

目的：研究姜黄素（curcumin）对N2a/APP695swe细胞中自噬和Rab家族蛋白的影响,并且探讨姜黄素调节N2a/APP695swe细胞自噬的可能机制。方法：采用N2a/WT和N2a/APP695swe细胞,并将其分为4个组：N2a/WT组（WT组）、N2a/APP695swe组（APP组）、DMSO溶剂对照组（DMSO组,5 μmol/L,24 h）、curcumin处理组（curcumin组,5 μmol/L,24 h）。Western blot分别检测各组自噬标志性蛋白LC3BⅡ和底物蛋白SQSTM1的表达,以及Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7、Rab9、Rab24和Rab33B的表达;共聚焦显微镜观察免疫荧光进一步验证各组LC3BⅡ与SQSTM1蛋白的表达情况。结果：Western blot结果表示,curcumin组LC3BⅡ蛋白表达量明显高于APP组和DMSO组（0.54±0.02 vs. 0.29±0.09,0.54±0.02 vs. 0.29±0.09,P=0.000）;同时,curcumin组SQSTM1蛋白表达量则明显低于APP组（0.67±0.01 vs. 1.02±0.02,P=0.000）。共聚焦显微镜观察免疫荧光实验再次验证了LC3B和SQSTM1蛋白的这种表达趋势。Western blot进一步检测发现,与APP组相比,curcumin组Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7和Rab33B的蛋白表达量均明显增加（1.00±0.02 vs. 0.63±0.02,P=0.000;0.94±0.03 vs. 0.79±0.03,P=0.000;0.75±0.00 vs. 0.56±0.01,P=0.000;0.88±0.04 vs. 0.59±0.03,P=0.000）,而Rab9和Rab24的改变差异无统计学意义（1.04±0.02 vs. 1.06±0.02,P=0.578;0.79±0.00 vs. 0.80±0.00,P=0.067）。结论：姜黄素提高N2a/APP695swe细胞的自噬水平,其机制可能与增强Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7和Rab33B的表达有关。     

自噬在低氧诱导人肾小管上皮细胞凋亡中的作用

目的：探讨自噬在低氧诱导人肾小管上皮细胞株（HK-2）凋亡中的作用。方法：培养HK-2细胞,根据培养环境氧浓度不同分为对照组（21%O2）和低氧组（1%O2）;根据低氧培养时间不同,低氧处理细胞进一步分为：低氧6 h亚组、低氧12 h亚组、低氧18 h亚组和低氧24 h亚组。Western blot检测HK-2细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和凋亡相关蛋白活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cleaved-caspase3）表达水平,流式细胞仪检测HK-2细胞凋亡情况;采用低氧诱导稳定表达GFP-LC3的HK-2细胞18 h,在荧光显微镜下观察GFP-LC3自噬小体的变化;进一步采用低氧联合自噬诱导剂雷帕霉素（ra－pamycin,RP）或自噬抑制剂巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1,BAfA1）处理HK-2细胞,细胞分为常氧对照组、常氧+雷帕霉素/或巴弗洛霉素组、低氧对照组、低氧+雷帕霉素/或巴弗洛霉素组。Western blot检测Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和cleaved-caspase3表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果：与对照组（0.161±0.043）相比较,低氧12 h[（0.315±0.060）,P=0.019]、18 h[（0.586±0.063）,P=0.000]、24 h[（0.698±0.085）,P=0.000]亚组HK-2细胞cleaved-caspase3蛋白表达明显增多;低氧12 h、18 h、24 h亚组HK-2细胞凋亡率分别为（23.633±5.346）%、（25.200±4.782）%、（38.567±8.046）%,较对照组（11.800±3.966）%明显增多（P=0.036,P=0.021,P=0.000）。同时,低氧18 h、24 h亚组HK-2细胞表达Beclin1蛋白[（0.557±0.071）,（0.897±0.074）[较对照组（0.249±0.040）明显上调（P=0.001,P=0.000）;低氧6 h、12 h、18 h、24 h亚组细胞表达LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白[（1.795±0.143）,（2.873±0.078）,（3.029±0.089）,（3.735±0.059）]较对照组（1.322±0.191）明显上调（P=0.036,P=0.000,P=0.000,P=0.000）;细胞表达自噬底物P62蛋白[（0.776±0.061）,（0.602±0.119）,（0.419±0.117）,（0.384±0.068）]较对照组（0.957±0.035）明显下调（P=0.028,P=0.001,P=0.000,P=0.000）;低氧组细胞GFP-LC3斑点计数相对值为（40.667±6.028）,较对照组（18.667±5.508）明显增加（P=0.010）。雷帕霉素增加自噬后,低氧诱导的HK-2细胞凋亡（26.433±3.402）及cleaved-caspase3蛋白表达（0.265±0.066）较低氧对照组[（36.133±5.856）,（0.358±0.060）]明显减少（P=0.012,P=0.000）;巴弗洛霉素A1抑制自噬后,低氧诱导的HK-2细胞凋亡增多（49.233±3.412）及cleaved-caspase3蛋白表达（1.242±0.110）较低氧对照组[（25.933±3.650）,（0.659 ± 0.060）]明显增加（P=0.000,P=0.000）。结论：自噬在低氧诱导的HK-2细胞凋亡中起保护作用。     

APP/PS1/LC3三转基因小鼠的构建及其自噬流水平研究

目的：研究APP/PS1/LC3三转基因小鼠的构建及自噬流情况。方法：将CAG-mRFP-eGFP-LC3转基因自噬流模型小鼠与APP/PS1双转基因阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）模型小鼠交配繁殖,对产下的子代进行基因分型鉴定,选出同时含有 CAG-mRFP-eGFP-LC3基因和APP/PS1的小鼠为APP/PS1/LC3三转基因小鼠,Morris水迷宫实验检测小鼠行为学变化。取6月龄APP/PS1/LC3三转基因小鼠和同窝CAG-mRFP-eGFP-LC3 单转基因小鼠各6只,断头取脑后在透射电镜及荧光显微镜下观察自噬流的变化,采用免疫组织化学法检测老年斑的形成,用Western blot检测自噬标志物。结果：基因分型证实APP/PS1/LC3三转基因小鼠构建成功。Morris水迷宫显示,6月龄APP/PS1/LC3三转基因小鼠找到平台的平均潜伏期和路程均明显增加（F=87.096,P=0.000;F=41.583,P=0.000）,穿越平台的次数明显减少（2.000±0.707 vs. 4.800±0.800,t=2.622,P=0.031）。透射电镜下观察,6月龄APP/PS1/LC3三转基因小鼠脑神经元内出现更多的自噬小泡。荧光显微镜下观察,与同窝CAG-mRFP-eGFP-LC3单转基因小鼠比较,6月龄APP/PS1/LC3三转基因小鼠海马区自噬体及自噬溶酶体数量均明显增高（5.894±0.742 vs. 14.820±3.350,t=0.017,P=0.000;1.204±0.420 vs. 1.840±0.559,t=3.156,P=0.005）,大脑皮质内自噬体数量亦明显升高（1.943±0.415 vs. 10.030±4.382,t=6.364,P=0.000）,但自噬溶酶体数量比较,差异未见统计学意义（0.562±0.207 vs. 0.686±0.195,t=0.156,P=0.878）。免疫组化染色结果显6月龄APP/PS1/LC3三转基因大脑皮质及海马区域出现明显老年斑,而同窝CAG-mRFP-eGFP-LC3单转基因小鼠脑内未见老年斑。Western blot结果显示：与同窝CAG-mRFP-eGFP-LC3单转基因小鼠比较,APP/PS1/LC3三转基因小鼠脑内APP蛋白明显升高（0.294±0.070 vs. 0.690±0.275,t=3.423,P=0.007）,自噬相关蛋白LC3、 Beclin1、P62水平均增高（0.241±0.004 vs. 0.534±0.019,t=37.170,P=0.000;0.479±0.020 vs. 1.180±0.255,t=6.820,P=0.000;0.188±0.007 vs. 0.356±0.021,t=18.850,P=0.000）,但溶酶体膜蛋白LAMP1表达水平降低（1.450±0.065 vs. 0.773±0.043,t=8.705,P=0.000）。结论：APP/PS1/LC3三转基因小鼠自噬被激活,但自噬溶酶体降解受阻,是研究AD自噬流水平的理想动物模型。     

腺苷酸激活蛋白酶介导糖尿病大鼠心肌线粒体自噬的机制与TSC2的关系研究

目的：探讨腺苷酸激活蛋白酶（AMP-activatedproteinkinase,AMPK）介导糖尿病大鼠心肌线粒体自噬的机制与结节性硬化复合物-2（tuberoussclerosiscomplex-2,TSC2）的关系。方法：成年雄性SD大鼠30只,随机分为对照组、模型组、模型+AMPK激动剂AICAR组（AICAR组）。采用腹腔注射链脲佐菌素建立大鼠糖尿病大鼠模型。AICAR组大鼠连续皮下注射AICAR12周。采用超声诊断仪检测所有大鼠的心功能：左室舒张末期容积（leftventricularend-diastolicvolume,LVEDV）、左室收缩末期容积（leftventricularend-systolicvolume,LVESV）、左室射血分数（leftventricularejectionfraction,LVEF）、心率（heartrate,HR）、舒张早期血流峰值速度（peakvelocityofearlydiastolicflow,E）、舒张晚期血流峰值速度（peakvelocityoflatediastolicflow,A）、E/A。取心肌组织,采用免疫共沉淀法检测AMPK和TSC2的结合水平;Westernblot检测AMPK、TSC2、p-TSC2、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin-1和P62蛋白的表达水平。结果：AICAR组LVEDV、LVEF、E和E/A均高于模型组,而A低于模型组（P=0.004,P=0.001,P=0.000,P=0.011,P=0.027）;AICAR组AMPK和TSC2蛋白表达水平高于模型组（0.71±0.06vs.0.36±0.09,P=0.003;0.80±0.02vs.0.40±0.05,P=0.017）;AICAR组结合水平高于模型组（0.49±0.09vs.0.23±0.03,P=0.002）;AICAR组p-TSC2蛋白水平高于模型组（1.48±0.07vs.0.92±0.07,P=0.029）;AICAR组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1和P62均高于模型组（P＜0.05）。结论：AMPK介导糖尿病大鼠心肌线粒体自噬的机制可能与其对TSC2的磷酸化作用有关。     

莱菔硫烷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤炎症反应的影响

目的：研究莱菔硫烷（sulforaphane,ＳＦＮ）对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤炎症反应的影响,并进一步探讨其可能的机制。方法：利用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型,于MCAO后1 h腹腔注射ＳＦＮ 5 mg/kg。缺血2 h,再灌注24 h时,检测大鼠神经功能缺损评分并用TTC染色测定脑梗死体积;通过检测脑组织髓过氧物酶的含量反映中性粒细胞浸润和炎症反应的程度;Western blot检测核因子－κB（nuclear factor-κB,NF-κB）、肿瘤坏死因子－α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）以及白介素－６（interleukin-6,IL-6）的表达变化。结果：与模型组相比,5 mg/kg ＳＦＮ治疗组均能改善大鼠缺血再灌注损伤后神经功能缺损[（2.49±0.48）分 vs. （1.34±0.62）分,P=0.000] 、减少脑梗死体积[（0.41±0.02）% vs. （0.26±0.03）%,P=0.000],降低髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）的含量[（0.43±0.02） Ｕ/g vs. （0.35±0.02） U/g,P=0.000]。Western blot的结果显示,ＳＦＮ组脑组织NF-κB、TNF-α以及IL-6蛋白表达与MCAO组比较表达明显降低,分别为（0.39±0.05） vs. （1.65±0.05）,P=0.000;（0.30±0.05） vs. （0.91±0.03）,P=0.000;（0.49±0.11） vs. （1.50±0.03）,P=0.000。结论：ＳＦＮ可以通过减轻炎症反应对大鼠脑缺血/再灌注损伤起神经保护作用,其相关机制可能与其降低 NF-κB、TNF-α以及 IL-6表达有关。     

金诺芬通过促进自噬对弓形虫增殖的影响

目的：金诺芬对弓形虫速殖子的作用及对弓形虫感染小鼠的自噬初步探讨。方法：透射电子显微镜观察用药前后刚地弓形虫超微结构的变化;采用免疫荧光、免疫组化和免疫印迹法检测感染有弓形虫的脑组织中自噬蛋白LC3的变化。HE染色观察金诺芬作用前后小鼠脑部的弓形虫速殖子变化。结果：透射电镜显示10 ?滋g/mL组（B组）的弓形虫速殖子内部结构被破坏,虫体细胞膜破裂,细胞质均质样改变,20 ?滋g/mL组（C组）的虫体内容物溢出,线粒体及粗面内质网消失,核固缩,核膜断裂,细胞质出现许多空泡,严重者虫体崩解呈均质样改变。免疫荧光结果显示实验组（77.49±15.68）的LC3蛋白的表达量较对照组（53.81±15.24）明显增加（P=0.001）。免疫组化结果显示用药后（1 208.55±580.07）的LC3蛋白表达量比对照组（544.54±225.04）明显增高（P=0.000）。免疫印迹法检测结果显示用药后（41 738.52±0.00）的LC3蛋白表达量比对照组（25 383.88±607.34）明显增高（P=0.000）。用药后（218.80±21.17）寄生在小鼠脑部的弓形虫速殖子增殖数量明显少于对照组（495.40±31.91）（P=0.000）。结论：金诺芬在体外有破坏弓形虫速殖子的作用,同时金诺芬可以提高弓形虫感染小鼠的自噬水平从而抑制弓形虫增殖。     

PINK1/parkin介导的线粒体自噬在机械通气导致的膈肌功能障碍中的作用

目的：研究PTEN诱导激酶1（PTEN induced putative kinase 1,PINK1）/parkin介导的线粒体自噬在机械通气（mechani－cal ventilation,MV）导致的膈肌功能障碍和萎缩中的作用。方法：将24只成年雄性SD大鼠随机分成Control组（n=6）、MV-6h组（n=6）、MV-12h组（n=6）和MV-24h组（n=6）。Control组大鼠未经任何处理,MV-6h组大鼠机械通气6 h,MV-12h组大鼠机械通气12 h,MV-24h组大鼠机械通气24 h。采用RM6240生物信息采集系统测量膈肌复合肌动作电位（compound muscle action potential,CMAP）,HE染色测量膈肌肌纤维横截面积（cross-sectional area,CSA）,Western blot检测膈肌肌肉萎缩蛋白（muscle atrophy F-box,MAFbx）、肌肉特异性环指蛋白1（muscle specific ring finger 1,MURF1）、线粒体裂解蛋白1（dynamin-related pro－tein 1,drp1）、线粒体融合蛋白2（mitofusin-2,mfn2）、线粒体自噬相关蛋白PINK1、parkin、P62及微管相关蛋白轻链3（micro－tubule-associated protein 1 light chain 3,LC3）水平。结果：MV-12h组[（3.15±0.52） mV]和MV-24h组[（2.44±1.26） mV]膈肌的CMAP幅值明显下降（P=0.000）;MV-24h组[（7.05±0.61） ms]膈肌的CMAP时程明显延长（P=0.000）;与Control组[（5 308.67±228.18） μm2]相比,MV-6h组[（3 378.33±393.40） μm2]、MV-12h组[（2 969.67±35.16） μm2]和MV-24h组[（2 115.33±130.23） μm2]膈肌的CSA均明显减少（P=0.000）;与Control组相比,MV-12h组（2.59±0.19）、MV-24h组（4.11±0.19）的MAFbx明显升高（P=0.000）,MV-12h组（1.96±0.26）、MV-24h组（2.88±0.29）的MURF1明显升高（P=0.000）;与Control组相比,drp1在MV-24h组（5.55±0.36）明显上升（P=0.000）,mfn2在MV-12h组（0.47±0.13）、 MV-24h组（0.35±0.10）明显降低（P=0.002）;与Control组相比,PINK1在MV-12h组（2.53±0.25）和MV-24h组（4.78±0.31）明显上升（P=0.000）,parkin在MV-24h组（3.73±0.16）明显上升（P=0.000）,P62在MV-12h组（2.28±0.06）和MV-24h组（3.69±0.17）明显上升（P=0.000）,LC3Ⅱ/Ⅰ比值在MV-24h组（1.57±1.32）明显上升（P=0.002）。结论：MV可以引起PINK1/parkin介导的线粒体自噬发生改变,并引起膈肌功能障碍和萎缩。     

二甲双胍通过干预上皮-间质转化逆转尼古丁诱导的肺癌吉非替尼耐药

目的：探讨尼古丁（nicotine,NIC）诱导EGFR敏感突变PC-9肺癌细胞株吉非替尼耐药及二甲双胍对其作用。方法：PC-9分成4组：空白组、尼古丁组、二甲双胍组、尼古丁和二甲双胍组,利用定量反转录聚合酶连锁反应（quantificational real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测E-cadherin和Vimentin信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid,mRNA）的表达,Western blot检测E-cadherin和Vimentin蛋白表达,细胞计数试剂盒（cell counting Kit-8,CCK-8）检测不同分组细胞对吉非替尼药物敏感情况。Transwell小室实验检测细胞侵袭迁移。结果：尼古丁诱导PC-9细胞上皮间质转化呈时间浓度依赖,在10 μmol/L尼古丁处理72 h后,发生E-cadherin下调和Vimentin上调最明显,故选该条件做以下实验。CCK-8提示,相比空白组,尼古丁组PC-9细胞对吉非替尼敏感性减弱,在吉非替尼浓度为0.05 μmol/L最明显（P=0.000）。Matrigel侵袭实验提示尼古丁组穿膜细胞数较空白组明显增多[（15.70±1.53）个/高倍视野 vs. （32.70±2.08）个/高倍视野,F=75.406,P=0.000,P=0.000];迁移实验的结果与之相似。与空白组相比,尼古丁组E-cadherin mRNA 表达水平明显降低[（0.932±0.100） vs. （0.459±0.024）,F=25.924,P=0.000,P=0.000）],Vimentin mRNA表达水平明显升高[（1.200±0.200） vs. （1.973±0.129）,F=20.998,P=0.000,P=0.000]。蛋白水平变化与之相同。尼古丁＋二甲双胍组可以增加尼古丁作用PC-9对吉非替尼的敏感性,在吉非替尼浓度为0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 μmol/L时有统计学意义。尼古丁＋二甲双胍组可以减弱尼古丁组的穿膜数[（17.00±2.00）个/高倍视野vs. （32.70±2.08）个/高倍视野,F=75.406,P=0.000,P=0.000],迁移实验呈现相同的结果。相比于尼古丁组,尼古丁＋二甲双胍组上调E-cadherin mRNA[（0.459±0.024） vs. （0.838±0.058）,F=25.924,P=0.000,P=0.000）],下调Vimentin mRNA[（1.973±0.129） vs. （1.467±0.115）,F=20.998,P=0.000,P=0.003）]。结论：尼古丁通过上皮间质转化诱导PC-9细胞吉非替尼耐药,二甲双胍可以逆转上述现象。     

加速康复外科治疗护理措施对肝癌患者术后恢复的影响

目的?探讨加速康复外科治疗护理措施对肝癌患者术后恢复的影响。方法?选取2014 年7 月～2018 年8 月间65 例肝癌患者在本院行手术治疗,其中32 例患者接受加速康复外科治疗护理措施（加速康复组）,其余33 例患者接受常规治疗护理措施（对照组）。比较两组患者术后肠功能恢复时间、排便时间、进食半流质时间、术后住院时间和术后并发症等。结果?加速康复组术后肠功能恢复时间（h）[（20.14±9.24）vs.（32.22±10.25）,P=0.0000],排便时间（h）[（30.27±9.39）vs.（42.25±11.36）,P=0.0000],进食半流质时间（h）[（36.14±11.66）vs.（50.28±12.68）,P=0.0000],术后住院时间（d）[（9.27±2.57）vs.（12.24±3.24）,P=0.0000]均较对照组明显缩短。加速康复组术后泌尿系感染的发生率明显低于对照组[2/32（6.25%）vs.7/33（21.21%）,P=0.0353]。结论 加速康复外科治疗护理措施能显著促进肝癌患者术后恢复,减少并发症发生率。     

过表达NICD通过下调基因JunB的表达抑制BMP9

目的：研究Notch信号通路在骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化过程中的作用及其机制。方法：将细胞分为5组：空白组（Blank,n=3）,BMP9处理组（BMP9,n=3）,空白质粒对照组（BMP9+Control,n=3）,过表达Notch1胞内段质粒（Notch1 intracellular domain,NICD）处理组（BMP9+NICD,n=3）,DAPT处理组（BMP+DAPT,n=3）。通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和钙盐染色分别验证过表达NICD对成骨分化早晚期情况的影响。进一步采用定量逆转录PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-RCR）和Western blot检测基因NICD、Hey1及成骨相关基因Smad-1/5/8、p-Smad-1/5/8、OPN、Runx2、OCN、JunB的表达。结果：早期ALP活性及染色结果显示,NICD组较Control组能显著抑制C3H10T1/2细胞成骨分化过程中ALP的形成[5 d：（33 167.66±2 018.45） vs. （146 451.00±14 889.67）,P=0.000;7 d：（58 981.33±4 724.70） vs. （89 588.66±5 928.32）,P=0.000],γ-分泌酶抑制剂（N-[N-（3,5-difluorophen-acetyl）-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester,DAPT）完全抑制Notch通路时得到相同的结果[5 d：（44 812.66±4 174.94） vs. （146 451.00±14 889.67）,P=0.000;7 d：（64 622.93±4 724.70） vs. （89 588.66±5 928.32）,P=0.000]。茜素红S染色结果显示,NCID抑制钙盐结节的形成,而DAPT阻断Notch通路明显促进钙盐结节形成。qRT-PCR结果表明,NCID组中NICD及靶基因Hey1的表达较Control组明显增加[（3.90±0.02） vs. （0.35±0.01）,P=0.000;（19.79±0.01） vs. （11.80±0.02）,P=0.000],Western blot得到相同结果[（1.32±0.01） vs. （0.19±0.01）,P=0.000],且NICD明显抑制成骨分化相关基因JunB、Runx2、OCN、OPN等的表达[（0.10±0.01） vs. （0.53±0.01）,P=0.000;（0.18±0.01） vs. （0.30±0.02）,P=0.000;（0.36±0.01） vs. （0.62±0.02）,P=0.000;（0.07±0.01） vs. （0.48±0.01）,P=0.000],而转录因子Smad-1/5/8、p-Smad-1/5/8的表达不受影响[（0.74±0.02） vs. （0.73±0.03）,P=0.000;（0.63±0.01） vs. （0.58±0.04）,P=0.000],DAPT阻断Notch通路后上述相关基因的表达明显增加。结论：本实验结果首次证明,NICD激活Notch通路对BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化的抑制作用可能是通过抑制JunB基因发挥作用,而非调控BMP9/Smad（bonemorphogenetic protein 9/drosophila mothers against decapentaplegic）信号通路。     

多西紫杉醇诱导前列腺癌PC-3细胞自噬的研究

目的：观察多西紫杉醇是否诱导前列腺癌PC-3细胞产生自噬,并初步探讨其可能机制。方法：实验应用MTT法测定细胞的增殖率;透射电镜观察细胞超微结构的变化;免疫荧光和Western blot分别定性和定量检测自噬相关蛋白Ⅱ型微管相关蛋白轻链3蛋白（microtubule-associated protein 1 light chain 3 typeⅡ,LC3-Ⅱ）、底物蛋白（sequestosome 1/SQSTM1,P62）表达水平,RT-PCR检测自噬相关基因Beclin-1 mRNA。结果：MTT结果显示多西紫杉醇能有效抑制PC-3细胞增殖（F=58.684,P=0.000）;10-6 mol/L多西紫杉醇处理PC-3细胞24 h,即可发生明显的自噬,透射电镜观察到自噬体双层膜结构的形成。免疫荧光和Western blot结果显示多西紫杉醇处理PC-3细胞后P62表达降低（P=0.003、P=0.000、P=0.000）,LC3-Ⅱ表达增强（P=0.002、P=0.000、P=0.000）,RT-PCR结果显示多西紫杉醇处理PC-3细胞后可引起细胞Beclin-1 mRNA水平的上调（P=0.000、P=0.000、P=0.000）。结论：多西紫杉醇可以有效抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖并诱导自噬,其发生可能与通过上调Beclin-1的mRNA水平有关。     

咀嚼口香糖加速腰椎后路融合术后患者胃肠道功能恢复的临床观察

目的：探究咀嚼口香糖能否加速腰椎后路融合术后患者胃肠道功能的恢复。方法：回顾性分析重庆医科大学附属第一医院骨科脊柱病区2016年1月至2016年9月收治的腰椎间盘突出症且行腰椎后路融合手术治疗的患者的临床资料,共65例,按术后是否咀嚼口香糖分为观察组和对照组。观察组患者（30例）于术毕麻醉清醒后6 h开始咀嚼益达无糖木糖醇口香糖,每4小时1次,每次2粒,每次至少咀嚼15 min,至肛门首次排气后改为每8小时1次,直至术后第5天;对照组患者（35例）术后不咀嚼口香糖,仅接受常规护理。2组患者术后均禁食,肛门排气后开始进食流质饮食,并逐步过渡到正常饮食。比较2组患者术后首次闻及肠鸣音时间,肛门首次排气时间、首次排便时间、住院时间、住院费用以及并发症等指标。结果：咀嚼口香糖能明显缩短患者术后首次闻及肠鸣音时间[（12.35±2.87） h vs. （17.10±2.59） h,t=-7.007,P=0.000]、肛门首次排气时间[（17.34±2.86） h vs. （24.12±3.18） h,t=-8.974,P=0.000]及首次排便时间[（51.89±5.16） h vs. （74.81±4.76） h,t=-18.612,P=0.000],但2组患者的住院时间[（11.67±2.12） d vs. （12.03±2.33） d,t=-0.650,P=0.518]、住院费用[（66 554.13±16 325.18）元vs. （65 707.26±11 765.25）元,t=-0.493,P=0.809]及并发症发生率（10/30 vs. 12/35, ?字2=0.007,P=0.936）无统计学差异。结论：咀嚼口香糖可以加速腰椎后路融合术后患者胃肠道功能的恢复。上述结论尚需大样本、多中心的前瞻性研究来验证。     

Rho激酶抑制剂对先天性膈疝大鼠模型胎仔肺血管重构的作用

目的：探讨先天性膈疝（congenital diaphragmatic hernia,CDH）大鼠模型胎仔肺Rho激酶的表达及其抑制剂法舒地尔对肺血管重构的影响。方法：将定时配种成功的SD雌鼠随机分为对照组（5只）、膈疝组（6只）和法舒地尔干预组（6只）。分别给予膈疝组和干预组除草醚（100 mg/只）一次性灌胃建立CDH动物模型,对照组灌等量橄榄油。孕16.5 d给予干预组腹腔注射法舒地尔（15 mg/kg,1次/d,连续３ d）,对照组和膈疝组予等量生理盐水腹腔注射。定时剖宫产取出胎肺,光镜下进行肺血管重构观察,采用RT-PCR法和Western blot法观察肺组织Rho激酶表达变化;Western blot法检测Rho激酶底物肌球蛋白磷酸酶的磷酸化状态。结果：膈疝组肺小动脉管壁厚度占血管外径百分比（WT%）和肺小动脉中膜厚度百分比（MT%）均明显高于对照组[（26.88±2.41） vs. （13.50±1.45）;（25.59±2.57） vs. （16.47±2.07）,P=0.000];管腔面积与血管总面积百分比（LA%）明显低于对照组[（39.22±2.23） vs. （61.20±3.23）,P=0.000]。法舒地尔干预组WT%、MT%显著低于膈疝组[（15.38±2.14） vs. （26.88±2.41）;（17.69±1.79） vs. （25.59±2.57）,P=0.000],LA%明显高于膈疝组[（58.67±3.06） vs. （39.22±2.23）,P=0.000]。与对照组相比,膈疝组Rho激酶mRNA和蛋白质表达明显升高,肌球蛋白磷酸酶磷酸化水平也明显增高（P=0.000）。法舒地尔干预后Rho激酶mRNA和蛋白、肌球蛋白磷酸酶磷酸化水平均较膈疝组明显降低（P<0.01）。结论：先天性膈疝胎仔肺内存在肺血管重构,Rho/Rho激酶信号通路参与此过程,产前给予法舒地尔明显改善CDH胎仔的肺血管重构。     

针刺对脑出血大鼠自噬相关蛋白p62、Beclin-1表达的影响

目的：观察针刺“百会”透“曲鬓”穴对脑出血（ICH）大鼠自噬相关蛋白的影响,探究针刺促进ICH后大鼠神经功能恢复的作用机制。方法：将80只雄性SD大鼠（250-300 g）随机分成4组,假手术组、模型组（50 μL自体血注入尾状核）、非穴位组（平行中线距“百会”穴1 cm 处）、针刺组（患侧“百会”透“曲鬓”）,每个亚组20只。于行为学评分（前肢放置试验、拐角试验）结束后取患侧出血半暗带区脑组织,用免疫组化检测p62蛋白表达,用Western blot检测p62、Beclin-1表达含量变化。结果：在ICH后7天模型组出现明显神经功能缺损体征（均P＜0.01,转角试验（%）：28±8.37 vs. 60±15.81;前肢放置试验（%）：36±8.94 vs. 88±8.37）,并上调脑组织p62、Beclin-1蛋白表达含量（均P＜0.01,p62：0.85±0.07 vs. 0.37±0.03;Beclin-1：0.57±0.05 vs. 0.28±0.04）;而针刺干预能够明显提高ICH大鼠行为学评分（均P<0.01 vs. 模型组/非穴位组,44±11.41 vs. 28±8.37 or 22±8.37; 64±11.40 vs. 36±8.94 or 38±8.37）,并下调ICH大鼠脑组织p62,上调Beclin-1蛋白表达含量（均P＜0.01 vs. 模型组/非穴位组,0.61±0.05 vs. 0.85±0.07 or 0.82±0.06; 0.82±0.07 vs. 0.57±0.05 or 0.61±0.08）。结论：针刺能下调ICH大鼠脑组织p62蛋白表达,上调Beclin-1蛋白表达,进而改善大鼠神经功能缺损体征。     

以团队为基础的学习在消化系统疾病临床教学中的应用

目的　比较以团队为基础的学习（team-based learning,TBL）法和传统教学在消化系统疾病临床教学中的效果。方法　选择临床医学专业八年制医学生60名,随机分为TBL组和传统组,分别采用TBL教学和传统教学进行消化系统疾病临床教学。对TBL组学生的个人测评基线（IRAT-baseline）、小组测评（GRAT）和个人测评终点（ITT）成绩进行比较,对TBL组和传统组学生自习时间、自习方式、IRAT-baseline、ITT和临床实践评分成绩进行对比,并对TBL组学生进行问卷调查评价。结果　与传统组相比,TBL组自学时间更多[（85.70±11.43） min vs.（35.00±9.47） min,P=0.000）]、自学方式更为多样。在IRAT-baseline[（17.78±5.07） vs. 12.57±4.26）,P=0.000）]、ITT[（23.66±5.36） vs. （18.52±4.54）,P=0.000]、临床实践成绩方面[（16.53±5.10） vs. （12.24±4.59）,P=0.001],TBL组分数明显高于传统组。TBL组GRAT成绩明显高于TBL组IRAT-baseline成绩[（27.82±3.12） vs. （17.78±5.07）,P=0.000]。TBL组和传统组在教学干预后的ITT成绩均较IRAT-baseline成绩均有明显提高[（23.66±5.36） vs. （17.78±5.07）,P=0.000;（18.52±4.54） vs. （12.57±4.26）,P=0.000],成绩提高幅度在两组之间差异无统计学意义[（5.69±2.76） vs. （5.36±2.00）,P=0.754]。问卷调查结果显示,多数TBL组学生（>70%）赞同TBL可促进其学习积极性、自主性,比传统教学更有吸引力,组间讨论和教师讲解使其获益;但超过一半TBL组学生也表示TBL中所学知识的系统性不及传统教学并且增加学生课业负担。结论　TBL教学有助于提高学生的自主学习能力,培养其临床思维、团队协作能力、知识应用能力,激发其学习兴趣,提升整体临床教学水平,值得在消化系统疾病临床教学中推广。     

颗粒蛋白前体通过调控调节性T细胞影响急性肺损伤白细胞介素-10表达和肺巨噬细胞极化的实验研究

目的：研究颗粒蛋白前体（progranulin,PGRN）在小鼠急性肺损伤（acute lung injury,ALI）模型中对调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）的调控及其对白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）表达和肺巨噬细胞极化的影响。方法：将 C57BL/6小鼠随机分为 Control 组、脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）组、LPS+PGRN 治疗组。用 LPS 气道滴注诱导小鼠 ALI 模型,LPS+PGRN 治疗组在 LPS 处理半小时后采用 0.1 mg/kg 的 PGRN 气道滴注。给药 24 h 后用水合氯醒麻醉小鼠,取小鼠肺组织及肝素抗凝血。肺组织病理切片HE染色评估肺损伤;流式细胞术检测外周血 Tregs;酶联免疫吸附法检测血浆 IL-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α、IL-10 表达;免疫荧光检测肺巨噬细胞表型。结果：不同处理组间外周血 Tregs,血浆中 IL-6、TNF-α、IL-10,肺组织中 M1、M2 型肺巨噬细胞存在统计学差异（F=69.340,P=0.000;F=73.100,P=0.000;F=17.800,P=0.000;F=11.780,P=0.003;F=67.560,P=0.000;F=197.100,P=0.000）。并且 PGRN 治疗后,ALI 小鼠肺损伤明显减轻,外周血 Tregs 明显增高[LPS：（4.714±0.265）%,LPS+PGRN：（8.930±0.255）%,P=0.000],血浆中促炎因子 IL-6[LPS：（3 021.000±294.900） pg/mL,LPS+PGRN：（276.700±148.000） pg/mL,P=0.000]和TNF-α表达[LPS：（90.980±10.240） pg/mL,LPS+PGRN：（20.410±9.190） pg/mL,P=0.002]明显降低,血浆抑炎因子 IL-10 表达明显上升[LPS：（296.400±44.280） pg/mL,LPS+PGRN：（2 551.000±0 655.100） pg/mL,P=0.014],M1 型肺巨噬细胞减少[LPS：（17.870±1.890）%,LPS+PGRN：（4.436±0.248）%,P=0.000],M2 型肺巨噬细胞增多[LPS:（2.284±0.444）%,LPS+PGRN：（11.920±0.458）%,P=0.000]。结论：在小鼠ALI模型中,PGRN能够通过调控Tregs改变IL-10的表达,影响肺巨噬细胞极化。     

PBEF对HPMEC和A549细胞的影响及对ARDS发病机制的研究

目的：探讨前B细胞克隆增强因子（pre-B cell colony enhancing factor,PBEF）在急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）发病机制中的作用。方法：体外培养人肺微血管内皮细胞株（HPMEC）和人肺泡Ⅱ型上皮细胞株（A549）,采用不同浓度（0、50、100、500、1 000、2 000 ng/mL）重组人PBEF（rPBEF）分别作用于细胞,采用四甲基偶氮唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测细胞活性。选用100和1 000 ng/mL rPBEF刺激细胞,并设置空白对照组,采用流式细胞术法检测细胞周期和细胞凋亡率;采用透射电子显微镜观察细胞凋亡的形态学变化;采用蛋白印迹法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cas－pase-3）、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（B-cell lymphoma/leukemia-2 gene,Bcl-2）的蛋白表达水平;采用实时荧光定量PCR法和蛋白印迹法检测水通道蛋白-1（aquaporin 1,AQP1）、白细胞介素-8（interleukin-8,IL-8）、白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）的mRNA和蛋白表达情况。结果：100、500、1 000、2 000 ng/mL rPBEF组相比空白对照组明显抑制了细胞活性（P<0.05）。流式细胞仪检测可见,与对照组[HPMEC：（19.347±2.052）%;A549：（17.297±0.800）%]比较,100和1 000 ng/mL rPBEF组细胞S期百分比[HPMEC：（43.847±1.272）%、（63.300±2.102）%;A549：（36.247±2.045）%、（46.400±1.346）%]明显增多（P=0.000）;与对照组[HPMEC：（8.433±0.600）%;A549：（3.877±0.666）%]相比,100和1 000 ng/mL rPBEF组细胞凋亡率[HPMEC：（11.317±0.533）%、（15.227±0.637）%;A549：（6.120±0.439）%、（8.633±0.497）%]明显升高（PHPMEC=0.001,PHPMEC=0.000;PA549=0.002,PA549=0.000）。1 000 ng/mL rPBEF处理细胞后透射电子显微镜下可见典型凋亡细胞和凋亡小体。同时,与对照组[HPMEC：（1.279±0.077）;A549：（2.824±0.129）]相比,100和1 000 ng/mL rPBEF组Bcl-2蛋白表达水平[HPMEC：（0.418±0.043）、（0.190±0.012）;A549：（1.276±0.212）、（0.601±0.164）]明显下调（均P=0.000）,而caspase-3蛋白表达水平[HPMEC：（0.763±0.030）、（1.170±0.056）;A549：（0.217±0.010）、（0.375±0.032）]较对照组[HPMEC：（0.459±0.032）;A549：（0.114±0.007）]明显升高（PHPMEC=0.000,PHPMEC=0.000;PA549=0.001,PA549=0.000）;AQP1 mRNA和蛋白表达水平明显下降[mRNA：HPMEC（0.543±0.113）、（0.287±0.093） vs. （1.050±0.155）（P=0.002,P=0.000）;A549（0.823±0.104）、（0.463±0.184） vs. （1.317±0.215） （P=0.013,P=0.001）;蛋白：HPMEC（0.494±0.038）、（0.233±0.030） vs. （0.824±0.067）（均P=0.000）;A549（0.850±0.157）、（0.484±0.118） vs. （1.344±0.136）（P=0.005,P=0.000）],而IL-8、IL-1β基因和蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。结论：PBEF可能通过下调Bcl-2基因表达,使caspase-3表达水平增加,从而诱导HPMEC和A549细胞凋亡,并通过下调AQP1表达参与急性呼吸窘迫综合征的发生发展。     

慢性睡眠不足诱导小鼠大脑和肝脏氧化应激和炎症反应

目的：探讨慢性睡眠不足对小鼠肝脑功能的影响及作用机制。方法：20只4 周龄野生雌性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组（n=10）和睡眠剥夺组（n=10）,睡眠剥夺组小鼠睡眠剥夺45 d后,观察2组小鼠体质量变化;Morris水迷宫实验分析2组小鼠空间学习记忆能力的变化;测量各组小鼠肝重指数、脾重指数和肾重指数;ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）和白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）的含量;酶标比色法检测海马和肝脏超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活力和还原型谷胱甘肽（reduced glutathione,GSH）含量;Western blot检测海马和肝脏TNF-α、P53、BCL-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein,BAX）、B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）蛋白相对表达水平;免疫组化SP法检测海马Ki-67的表达水平。结果：睡眠剥夺组小鼠体质量较正常对照组增加缓慢,空间学习记忆能力减退,肝重指数和肾重指数均增高（t=4.274,P=0.000;t=3.629,P=0.002）,脾重指数明显降低（t=2.380,P=0.029）。与正常对照组相比,睡眠剥夺组小鼠血清TNF-α[（24.440±4.468） vs. （53.719±4.128）]、IL-6[（14.265±3.718） vs. （31.766±4.535）]和IL-1β[（20.383±3.230） vs. （41.916±4.819）]明显增高（t=10.762,P=0.000;t=6.673,P=0.000;t=8.229,P=0.000）,睡眠剥夺组海马和肝脏SOD活力和GSH含量明显降低（t=4.171,P=0.003;t=8.851,P=0.000;t=7.138,P=0.000;t=5.390,P=0.000）。Western blot结果显示,睡眠剥夺组海马和肝脏TNF-α[（0.702±0.088）,（0.818±0.074）]、P53[（0.626±0.103）,（1.225±0.116）]和BAX[（0.978±0.078）,（1.120±0.135）]蛋白相对表达量明显上调（t=13.688,P=0.000;t=11.682,P=0.000;t=6.991,P=0.000;t=10.023,P=0.000;t=13.721,P=0.000;t=10.422,P=0.000）,BCL-2蛋白相对表达量[（0.365±0.059）,（0.380±0.040）]明显下降（t=15.165,P=0.000;t=12.143,P=0.000）,海马齿状回和门区Ki-67蛋白的表达水平明显下降（t=4.171,P=0.003）。结论：慢性睡眠不足可诱导大脑和肝脏的氧化应激,增加血清中炎症因子的浓度,并通过细胞凋亡调节DNA损伤。     

肛肠外科PBL教学中融入人文关怀理念的效果研究

目的　探索临床PBL教学中融入人文关怀理念的可操作性及其实用价值。方法　选取112名在肛肠外科实习的本科医学生,随机分为PBL融入人文关怀理念的实验组和单纯PBL对照组,实习结束后进行理论考试、操作考试和患者满意度调查以评判两组效果;所得数据采用GraphPad Prism 6统计软件进行统计分析,两组间计量资料采用t 检验比较。结果　实验组病史采集、技能操作明显好于对照组[（22.57±2.63）vs.（20.87±3.08）,t=3.124,P=0.002;（31.42±2.89）vs.（29.87±4.72）,t=2.107,P=0.037],但两组在理论考试和病历书写方面无明显差异[（90.60±3.19）vs.（90.52±3.38）,t=0.129,P=0.898;（20.78±2.79）vs.（20.65±3.51）,t=0.215,P=0.830];实验组在服务态度、可信任度、沟通能力三方面的病人满意程度明显高于对照组[（3.94±1.07）vs.（3.22±1.09）,t=3.256,P=0.002;（3.85±1.16）vs.（3.22±1.05）,t=2.759,P=0.007;（3.92±1.03）vs.（3.16±1.03）,t=3.652,P=0.000],而在技术操作、医疗程序方面两组无明显差异[（3.60±1.09）vs.（3.67±1.10）,t=0.281,P=0.779;（2.74±1.10）vs.（3.02±1.02）,t=1.312,P=0.193]。结论　肛肠外科PBL教学中融入人文关怀理念可以提高学生的临床操作能力,并有利于提高病人的满意度。