乳腺癌拉帕替尼耐药模型建立及二甲双胍逆转其耐药性的初步探讨

目的：建立乳腺癌拉帕替尼耐药模型并初步探讨二甲双胍对其耐药性的逆转作用。方法：体外建立乳腺癌拉帕替尼耐药模型;实验分为亲本组、空白耐药组、拉帕替尼组二甲双胍组和联合用药组（n=3）;CCK-8法检测并计算空白耐药组细胞耐药倍数及二甲双胍组细胞逆转耐药倍数;流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测各组细胞凋亡率和周期;Western blot检测各组细胞PI3K信号通路相关蛋白的表达水平。结果：空白耐药组细胞对拉帕替尼敏感性降低;亲本组、空白耐药组及二甲双胍组细胞IC50值分别为（2.64±0.12）、（11.21±0.03）、（5.62±0.13） μmol/L,耐药倍数约为4.25,逆转耐药倍数约为2.0;二甲双胍组（0.73±0.04）细胞增殖指数较空白耐药组（1.11±0.02）明显降低（P=0.004）,联合用药组（0.63±0.06）细胞增殖指数较空白耐药组（1.11±0.02）同样明显降低（P=0.031）;二甲双胍组[（10.70±0.76）%]细胞凋亡率较空白耐药组[（5.05±0.59）%]明显增高（P=0.007）,联合用药组[（24.68±1.52）%]细胞凋亡率较空白耐药组[（5.05±0.59）%]同样明显增高（P=0.006）;联合用药组中PI3K信号通路相关磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白表达较空白耐药组均下降。结论：成功建立乳腺癌拉帕替尼耐药模型;二甲双胍通过抑制PI3K信号通路逆转乳腺癌拉帕替尼耐药性。     

环巴胺阻断Hedgehog信号通路对食管癌EC109细胞上皮间质化逆转的影响及机制

目的：探讨环巴胺阻断Hedgehog通路对食管癌EC109细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用及其可能机制。方法：实验分为实验组和对照组,实验组应用Hedgehog通路特异性阻断剂环巴胺作用食管癌EC109细胞48 h。通过real-time PCR检测Gli1的表达变化,观察细胞形态变化,通过血管拟态实验检测血管形成能力变化,Transwell小室侵袭和迁移实验、黏附实验分别检测细胞侵袭、迁移和黏附能力变化,real-time PCR及Western 印迹方法检测EMT相关标志物E钙粘蛋白（E-cadherin）、β连环蛋白（β-catenin）、波形蛋白（Vimentin）及EMT调控因子Snail、Twist1等的表达变化。结果：环巴胺阻断EC109细胞Hedgehog 信号通路Gli1的mRMA表达明显减少为（41.819±20.150）%,形态发生明显变化,血管拟态个数较对照组[（2.780±0.424） vs. （5.080±0.634）]明显减少（t=-16.919,P=0.000）,侵袭实验较对照组[（24.800±2.588） vs.（55.400±4.879）]和迁移实验较对照组[（23.200±1.924） vs. （65.400±4.775）]均明显减少（t=-12.390,P=0.000;t=-18.331,P=0.000）,同种细胞间黏附增强（F=9.327,P=0.009）,上皮表型标志物E-cadherin表达较对照组[（0.38８±0.56５） vs. （0.22８±0.582）]明显上调（t=3.421,P=0.027）,而间质表型Vimentin、β-catenin的表达水平较对照组[（0.58８±0.109） vs. （0.507±0.05１）;（0.998±0.128） vs. （0.756±0.03８）]明显下调（t=4.221,P=0.013;t=6.781,P=0.002）;与对照组相比,实验组细胞中转录因子Snail的表达较对照组[（0.401±0.02１） vs. （0.756±0.03８）]下调（t=6.774,P=0.002）,Twist1的mRNA表达量相对于对照组也明显下调为（74.987±9.031）%。结论：环巴胺阻断Hh信号通路能明显逆转EC109细胞EMT过程,其机制可能与下调转录因子Snail及Twist1表达有关。     

吉非替尼联合二甲双胍对EGFR-TKIs原发性耐药非小细胞肺癌H1975细胞的抑制作用及其机制研究

目的 探讨吉非替尼联合二甲双胍对肺癌H1975细胞的抑制增效作用及其机制.方法 采用MTT、克隆形成实验观察吉非替尼与二甲双胍单用及联用对原发性耐药非小细胞肺癌H1975细胞增殖活性的影响;Matrigel包被的Transwell小室检测细胞侵袭能力;划痕愈合实验检测细胞迁移能力;TUNEL检测细胞凋亡率;Western blot、免疫荧光法检测凋亡和上皮细胞-间充质转化(epithelial tomesenchymal transition,EMT)相关蛋白的变化.结果 吉非替尼联合二甲双胍组对H1975细胞增殖、侵袭及迁移抑制效应优于吉非替尼组,协同增效作用明显(P＜0.05);吉非替尼和二甲双胍单用时较对照组的细胞凋亡率增加,当两者联合作用时细胞凋亡率增加更显著(P＜0.05),且明显下调抗凋亡相关蛋白(Bcl-xl、Mcl-1)和上调促凋亡蛋白Bax;两药联用明显逆转H1975细胞EMT的发生;间质细胞相关蛋白(Vimentin、N-cadherin、Slug、Snail)表达水平降低,上皮细胞相关蛋白E-cadhenn表达水平升高.结论 吉非替尼联合二甲双胍可显著抑制EGFR-TKIs原发性耐药非小细胞肺癌H1975细胞的增殖、侵袭和迁移,促使肿瘤细胞凋亡;其机制可能通过激活线粒体凋亡途径及逆转EMT的发生来发挥抗肿瘤作用.     

粒状头样蛋白2下调诱导上皮间质转化促进肿瘤细胞对吉非替尼耐药

目的 探讨粒状头样蛋白2（GRHL2）在肿瘤靶向治疗药物表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）吉非替尼获得性耐药中的作用和可能机制。方法 利用吉非替尼浓度逐步递增的体外诱导方法培养人结直肠癌细胞DiFi和人肺腺癌细胞HCC4006,获得吉非替尼耐药细胞株。通过RNA测序方法筛选在耐药细胞株与其亲代细胞中差异表达的基因并进行实时荧光定量PCR验证。使用pcDNA3.1-GRHL2质粒转染耐药细胞株使GRHL2过表达,用CCK-8法检测细胞对吉非替尼的敏感性。采用蛋白质印迹法检测耐药细胞株中上皮标志物E-cadherin和间质标志物Vimentin的表达变化,并通过CellMiner^TM数据库分析60株人肿瘤细胞系中GRHL2表达与E-cadherin和Vimentin表达的关系。结果 成功获得DiFi和HCC4006的耐药细胞株。通过RNA测序和实时荧光定量PCR验证发现GRHL2在耐药细胞株中表达下调,而在耐药细胞株中过表达GRHL2后细胞恢复了对吉非替尼的敏感性。蛋白质印迹分析表明耐药细胞株中上皮标志物E-cadherin表达下调,而间质标志物Vimentin表达上调;CellMiner^TM数据库分析表明GRHL2的表达与E-cadherin/Vimentin比值高度一致。结论 GRHL2表达下调通过诱导上皮间质转化介导肿瘤细胞对吉非替尼的耐药。     

肿瘤坏死因子α诱导蛋白2对非小细胞肺癌细胞株H1299的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响

目的：观察肿瘤坏死因子α诱导蛋白2（TNF-α-induced protein 2,TNFAIP2）在非小细胞肺癌（non-small cell lung can－cer,NSCLC）中的表达以及对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。方法：RT-PCR检测NSCLC中TNFAIP2 mRNA表达情况;免疫组化检测NSCLC中TNFAIP2蛋白表达情况。构建TNFAIP2基因短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）干扰慢病毒载体（shRNA-TNFAIP2）和阴性对照慢病毒载体（shRNA-NC）分别感染H1299细胞后采用RT-PCR和Western blot检测感染效率。用Transwell实验检测细胞的迁移、侵袭能力;用CCK-8检测细胞的增殖能力;用流式细胞术检测细胞的凋亡能力;用Western blot检测细胞蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达的变化。结果：TNFAIP2 mRNA和蛋白质在NSCLC癌组织中的表达明显高于癌旁组织中的表达。慢病毒下调TNFAIP2表达后,shRNA-TNFAIP2组细胞迁移数（170±11）较shRNA-NC组（329±31）明显减少（P=0.001）;侵袭细胞数（75±10）较shRNA-NC组（135±8）明显减少（P=0.001）。CCK-8结果提示,shRNA-TNFAIP2组的吸光度值明显低于shRNA-NC组（P=0.000）;流式细胞术结果显示,shRNA-TNFAIP2组的凋亡率（18.730±0.490）%明显高于shRNA-NC组（6.570±0.870）%（P=0.000）;Western blot结果显示,shRNA-TNFAIP2组较shRNA-NC组细胞蛋白N-cadherin、Vimentin表达降低,E-cadherin表达增加。结论：TNFAIP2在NSCLC中存在高表达,下调能够抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡,逆转上皮间质转化。     

Kindlin-2 RNA干扰经Wnt信号通路抑制血管平滑肌细胞增殖

目的：观察Kindlin-2 RNA干扰（RNA interference,RNAi）对大鼠血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）增殖的影响并探讨相关的作用机制。方法：构建并制备Kindlin-2 siRNA慢病毒载体并感染大鼠VSMC,CCK-8和BrdU技术检测重组Wnt3a蛋白诱导的VSMC增殖情况,实时定量PCR测定VSMC中Kindlin-2、c-Myc和cyclin D1 mRNA的表达水平,免疫共沉淀了解Kindlin-2和β-catenin的关系,Western blot检测VSMC中Kindlin-2、β-catenin、磷酸化β-catenin（Ser675）、GSK-3β和磷酸化GSK-3β（Ser9）蛋白的表达。结果：Kindlin-2 siRNA慢病毒载体能有效感染大鼠VSMC。CCK-8和BrdU结果表明Kindlin-2 RNAi能够显著抑制Wnt3a诱导的VSMC增殖（1.12±0.14 vs. 2.25±0.15,P=0.000;0.162±0.017 vs. 0.288±0.019,P=0.000）。与阴性对照组相比,Kindlin-2 RNAi组和Kindlin-2 RNAi+Wnt3a组中Kindlin-2、c-Myc和cyclin D1 mRNA表达水平均明显下降（0.964±0.014 vs. 0.530±0.029,P=0.000;0.980±0.025 vs. 0.572±0.022,P=0.000;0.979±0.009 vs. 0.590±0.035,P=0.002和0.964±0.014 vs. 0.569±0.027,P=0.000;0.980±0.025 vs. 0.741±0.026,P=0.001;0.979±0.009 vs. 0.769±0.017,P=0.023）。免疫共沉淀证实VSMC中Kindlin-2可以与β-catenin结合,而且Kindlin-2 RNAi+Wnt3a组中Kindlin-2、磷酸化β-catenin（Ser675）和磷酸化GSK-3β（Ser9）蛋白的表达水平较阴性对照+Wnt3a组明显降低（0.468±0.029 vs. 0.725±0.033,P=0.001;1.058±0.109 vs. 1.478±0.045,P=0.001;0.624±0.048 vs. 0.809±0.067,P=0.020）。但各组中总β-catenin和总GSK-3β蛋白水平没有明显变化（F=0.638,P=0.647;F=0.781,P=0.563）。结论：Kindlin-2 RNAi可以通过Wnt信号通路发挥作用并抑制VSMC增殖。     

NF-κB/Snail在宫腔粘连患者内膜中表达升高

目的：探究锌指蛋白Snail与转录调节因子核因子－κＢ（nuclear factor－κB,NF-κB）在宫腔粘连（intrauterine adhesions,I－UAs）患者子宫内膜中的表达。方法：选择34例宫腔粘连患者作为试验组（IUAs）,非宫腔粘连患者19例作为对照组（control）,在宫腔镜直视下取子宫内膜组织。采用实时荧光定量PCR、免疫组织化学和Western blot分别检测 NF-κB、Snail、E-cadherin、Vimentin mRNA水平和蛋白水平的表达。结果：与对照组相比较,宫腔粘连患者子宫内膜组织中NF-κB（2.478±0.279 vs. 1.459±0.323,P=0.013）、Snail（2.801±0.502 vs. 1.218±0.313,P=0.005）、 Vimentin（3.581±0.650 vs. 1.756±0.260,P=0.006）的表达明显升高,E-cadherin（1.324±0.617 vs. 2.784±0.647,P=0.023）表达明显降低。结论：NF-κB和Snail可能参与了宫腔粘连的发生发展。     

敲低同源盒A6（HOXA6）抑制HCT116细胞增殖、迁移和侵袭

目的：探讨抑制同源盒A6（homeobox A6,HOXA6）的表达对HCT116结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法：构建重组干扰质粒（shRNA1,2,3,4-HOXA6）和阴性对照质粒（shRNA-NC）,脂质体转染,荧光显微镜、RT-PCR和Western blot检测转染效率和表达情况。CCK-8法和克隆形成检测增殖,Transwell检测迁移和侵袭。Western blot检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达。结果：荧光显微镜显示各组转染效率均为30%左右;RT-PCR和Western blot结果显示各干扰组HOXA6 mRNA（P=0.003）和蛋白（P=0.000）的表达均低于shRNA-NC组,其中shRNA1-HOXA6组最低（P=0.000）。CCK-8结果显示shRNA1-HOXA6组的吸光度值明显低于shRNA-NC组（P=0.005）;克隆形成结果显示shRNA1-HOXA6组（132±45）克隆形成数较shRNA-NC组（353±45）明显减少（P=0.004）;Transwell迁移和侵袭实验显示shRNA1-HOXA6组[（134±28）、（60±4）]穿出细胞数较shRNA-NC组[（276±94）、（168±50）]明显减少（P=0.025、P=0.008）。Western blot实验显示shRNA1-HOXA6组E-cadherin（0.490±0.025）的表达较shRNA-NC组（0.326±0.032）明显升高（P=0.003）,而N-cadherin（0.112±0.016）和Vimentin（0.886±0.033）较shRNA-NC组[（0.147±0.013）、（1.159±0.040）]明显降低（P=0.037、P=0.001）。结论：敲低HOXA6表达能显著抑制结直肠癌HCT116细胞的增殖、迁移和侵袭能力。     

吉非替尼对鼻咽癌细胞株CNE2放疗增敏作用

目的应用吉非替尼作用于鼻咽癌细胞株CNE2,观察其放疗增敏作用。方法体外培养鼻咽癌细胞株CNE2,以MTT实验检测细胞增殖抑制情况及吉非替尼对细胞放射敏感性的影响;用克隆形成法绘制细胞存活曲线,获得不同处理条件下的放射增敏比。以流式细胞术(FCM)分析细胞周期变化和凋亡情况。结果 MTT显示与单纯照射组比较,联合吉非替尼照射组细胞生存率显著降低(0.582±0.012vs0.398±0.016,P=0.0020);FCM显示吉非替尼联合放射组S期细胞显著下降(P=0.000),而G2/M期细胞比值显著增加(P=0.000),吉非替尼和放射线可协同作用,使CNE2细胞的周期再分布显著变化。结论吉非替尼可增强鼻咽癌细胞株CNE2放射敏感性,其机制可能与改变细胞周期的分布相关。     

二甲双胍抑制人前列腺癌细胞上皮间质转化及其作用机制

目的 研究二甲双胍对前列腺癌Vcap细胞增殖、侵袭及上皮间质转化（EMT）的影响,初步探讨microRNA(miRNA) 相关的作用机制。方法 以PBS处理组作为对照,使用不同浓度二甲双胍(1~50mmol/L) 处理前列腺癌Vcap细胞,MTS比色法检测细胞的增殖能力;流式细胞术分析二甲双胍对Vcap细胞周期分布的影响;划痕和侵袭小室实验分别检测5mmol/L二甲双胍和miR30a对细胞迁移和侵袭能力的作用;使用RT-PCR和Western blotting测定5mmol/L二甲双胍对Vcap细胞上皮指标物（E-cadherin、β-catenin）和间质指标物（Vimentin、Snail）mRNA和蛋白表达水平的影响;使用RT-PCR检测miR30a、miR143、miR185、miR196、miR205的表达水平变化。结果 二甲双胍抑制前列腺癌Vcap细胞的增殖,且呈浓度和时间依赖性。5mmol/L 二甲双胍明显影响Vcap细胞的周期分布并显著抑制Vcap细胞的迁移和侵袭能力。二甲双胍在mRNA和蛋白水平上,显著上调Vcap细胞中E-cadherin 和β-catenin的表达(P均<0.05) ,下调Vimentin和N-cadherin的表达(P均<0.05)。进一步的实验发现,二甲双胍显著上调miR30a的表达水平 (P<0.05),而后者可显著抑制Vcap细胞的增殖和EMT的发生。结论 二甲双胍明显抑制前列腺癌Vcap细胞的增殖、侵袭能力和上皮间质转化的过程。该过程可能涉及二甲双胍对miR30a的表达的上调。