S100A11慢病毒表达载体的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 构建S100A11基因慢病毒表达载体,建立Huh-7 S100A11稳定细胞株,并鉴定其表达. 方法 RT-PCR扩增S100A11基因片段,与pWPT载体经Mlu Ⅰ和Not Ⅰ同时酶切后连接,构建慢病毒表达载体pWPT-S100A11;将表达载体pWPT-GFP和pWPT-S100A11与慢病毒包装质粒pMD2.G和psPAX2共同感染293T细胞,获得携带GFP和S100A11基因的慢病毒,将两种慢病毒分别感染Huh-7细胞,获得Huh-7 S100A11和Huh-7GFP稳定细胞株;利用Real-Time PCR和Western Blotting实验方法检测感染后S100A11的过表达情况. 结果 成功构建慢病毒表达载体pWPT-S100A11;慢病毒感染Huh-7细胞株后,阳性对照Huh-7GFP经荧光镜检测传染率达95％;感染Huh-7细胞后S100A11的mRNA和蛋白表达量均增加. 结论 成功构建慢病毒表达载体pWPT-S100A11,并建立了Huh-7S100A11稳定细胞株,为进一步研究S100A11基因在肝癌中的生物学功能和机制奠定了基础.     

WWOX基因慢病毒载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的：构建及鉴定WWOX基因慢病毒载体,观察WWOX基因在人卵巢癌PEO1细胞株中的表达,为进一步研究WWOX基因的作用机制及其功能奠定基础。方法：采用PCR技术从克隆质粒模板中获得全长WWOX基因,将WWOX基因亚克隆到慢病毒载体PCDH—CMV—MCS-EF1-copGFP中,构建慢病毒载体表达质粒PCDH—WWOX,通过双酶切验证后,慢病毒表达质粒与慢病毒包装质粒pPACKH1-GAG,pPACKH1-REV,Pvsv-G共转染293T细胞,获得携带WWOX基因及EGFP基因的重组慢病毒Lenti WWOX,并转染靶细胞人卵巢癌PEO1细胞株。通过RT—PCR和Western Blot验证Lenti WWOX在PEO1细胞株中的表达。结果：测序结果显示成功构建重组慢病毒载体表达质粒PCDH—WWOX;表达质粒与辅助包装质粒共转染包装细胞293T后能产生慢病毒颗粒并能有效感染靶细胞PEO1,转导效率约为60％,有WWOX基因mRNA和蛋白水平的高表达。结论：本实验成功构建了携带WWOX基因慢病毒表达载体,包装成病毒后能有效感染卵巢癌PEO1细胞。     

构建可诱导表达MST1基因的慢病毒载体及其在肝癌细胞系Huh-7中的表达

 目的 构建可诱导表达MST1基因的慢病毒载体,为进一步研究MST1与肝癌之间的关系提供理想的模型。方法 克隆MST1基因到慢病毒载体pLVPT-tTRKRAB中,2种慢病毒载体（pLVPT-tTRKRAB-MST1和pLV-tTRKRAB-Red）与包装质粒通过293FT细胞系介导,分别包装成病毒颗粒,先后2次去感染肝癌细胞系Huh-7。培养7 d后,使用强力霉素（doxcycline）进行诱导,用Western blot检测MST1表达情况。结果 构建了可诱导MST1真核表达病毒载体并获得相应的病毒,病毒可以高效感染目的肝癌细胞系Huh-7。在强力霉素诱导条件下,肝癌细胞系Huh-7可以表达MST1。结论 成功构建出可诱导表达MST1基因的慢病毒载体,并获得在强力霉素诱导条件下可以表达MST1的肝癌细胞亚系。     

改建型STAT1-CC基因慢病毒载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达

目的:构建携带STAT1基因和突变型STAT1-CC基因的慢病毒表达载体,转染肺癌A549细胞并检测STAT1和STAT1-CC基因在肺癌A549细胞内的表达.方法:采用PCR技术从质粒模板中扩增得到目的基因STAT1和STAT1-CC,将其接入含有CMV启动子和绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体中,构建慢病毒载体表达载体Lenti-STAT1和Lenti-STAT1-CC,双酶切和测序鉴定.分别将重组子Lenti-STAT1、LentiSTAT1-CC和包装质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,感染非小细胞肺癌细胞株A549.荧光显微镜观察A549细胞EGFP表达,Western Blotting验证STAT1在A549细胞株中的表达.结果:酶切及测序结果显示成功构建重组慢病毒表达载体Lenti-STAT1和Lenti-STAT1-CC,将慢病毒颗粒感染A549细胞48 h后,观察到宿主细胞内EGFP表达,Western Blotting证实STAT1蛋白在A549细胞中过表达.结论:本实验成功构建了携带STAT1基因和STAT1-CC基因的慢病毒表达载体,并在A549细胞中过表达STAT1基因.     

胰腺癌新基因S100P与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建胰腺癌新基因SLOOP与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体.方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得SlOOP的全外显子片段.使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿棱质粒共转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞和宿主胰腺癌细胞.荧光显微镜观察293T细胞的荧光表达,RT-PCR鉴定胰腺癌细胞中SLOOP的表达水平.结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的S LOOP基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞.荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.共转染后293T细胞上清可高效感染293T细胞,感染后宿主细胞中S LOOP高表达.结论:成功构建了S LOOP与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究SLOOP基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体.     

携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在HeLa细胞中的表达.方法 采用Gateway技术使克隆载体pENTR221-hTERT与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组反应,构建重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT;将重组慢病毒载体与病毒包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染人胚肾293FT细胞,制备重组慢病毒颗粒;将重组慢病毒感染HeLa细胞,利用杀稻瘟菌素筛选阳性细胞克隆,PCR法检测外源hTERT基因在阳性细胞中的染色体整合状况,RT-PCR检测重组慢病毒感染对细胞hTERT基因mRNA表达的影响.结果 经鉴定,重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT携带hTERT基因,hTERT基因包装至病毒颗粒.重组慢病毒感染HeLa细胞后,得到具有杀稻瘟菌素抗性的细胞克隆,其染色体DNA整合有外源hTERT基因,细胞内hTERT基因mRNA的表达水平高于未感染慢病毒的对照细胞.结论 成功构建了携带hTERT基因的重组慢病毒载体,能够提高HeLa细胞hTERT基因mRNA的表达量.     

慢病毒载体介导CD1d和GFP融合基因转染PANC-1细胞的实验研究

目的构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合基因慢病毒载体并转染人胰腺癌细胞(PANC-1).方法实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.通过慢病毒转染预实验确定MOI,进行人CD1d重组慢病毒载体转染胰腺癌PANC-1细胞株.结果电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染PANC-1细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.结论成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体并转染人胰腺癌细胞.     

重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定基础.方法 设计引物扩增获得目的基因小鼠MIP-1α和B7-1基因的全长编码序列cDNA,将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,其产物转化感受态细胞,对长出的阳性克隆进行PCR鉴定和直接测序序列分析.MIP-1α和B7-1目的基因质粒转染293T细胞,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达,采用Western Blot法检测其蛋白表达,实时荧光定量PCR,检测慢病毒浓缩液的滴度.结果 成功构建了重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,实时荧光定量PCR证实MIP-1α、B7-1基因重组慢病毒载体的滴度均达2.00E+8 TU/mL.结论 本研究成功构建并包装出高滴度的小鼠MIP-1α和B7-1基因重组慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定了基础.     

携人PTHLH基因慢病毒表达载体的构建

目的构建携带人甲状旁腺相关激素(PTHLH)基因的慢病毒表达载体pGC-FU/PTHLH。方法酶切载体pGC-FU,根据人PTHLH基因合成特定引物,扩增目的基因片段,将其克隆到pGC-FU质粒(含EGFP基因)上,菌落PCR鉴定及测序分析重组载体,使用Lipofectamine 2000诱导转染pGC-FU、pHelper1.0和pHelper2.0载体三质粒进入293T细胞包装慢病毒,并用带PTHLH的慢病毒感染293T细胞和鼻咽癌CEN1细胞确认慢病毒包装是否成功。结果菌液PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定显示,与理论预计值阳性转化子735bp,阴性转化子198bp基本相吻合;PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,结果完全匹配,进一步鉴定载体构建成功。分别将质粒包装系统共转染293T细胞,包装产生空白对照慢病毒(pGC-FU)和过表达PTHLH的慢病毒(pGC-FU/PTHLH);或用携带PTHLH和EGFP基因的病毒上清感染CNE1细胞,48h后,倒置荧光显微镜下观察293T和CNE1细胞,均可见绿色荧光,转染成功。结论成功构建携人PTHLH基因慢病毒表达载体,为进一步研究PTHLH基因在鼻咽癌转移中的作用及鼻咽癌发病分子机制奠定了基础。     

携带鼠Foxp3基因的自身失活型慢病毒载体的构建及表达

目的 构建携带鼠Foxp3基因的自身失活型慢病毒载体,并研究其在CD4+CD25-T细胞中的表达.方法 构建含鼠Foxp3基因及内部核糖体进入位点序列(IRES)和绿色荧光蛋白基因(GFP)的双顺反子慢病毒载体.采用脂染法将慢病毒载体三质粒转染293T细胞,经共培养法感染免疫磁珠分离的小鼠CD4+CD25-T细胞,流式细胞术(FCM)检测基因转导效率,通过RT-PCR及Western Blotting法分别从mRNA和蛋白水平检测Foxp3的表达.结果 成功构建了慢病毒表达质粒pXZ208-IRES-GFP/pXZ208-Foxp3-IRES-GFP,包装的重组慢病毒滴度达106 IU/mL.以pXZ208-IRES-GFP为阴性对照组,共培养法感染CD4+CD25-T细胞,实验组细胞基因转导效率达55.95%,并且存在Foxp3 mRNA和蛋白水平的高表达.结论 成功构建了携带鼠Foxp3基因的自身失活型慢病毒载体;该系统可有效的介导Foxp3基因在CD4+CD25-T细胞中表达.     

miR-137过表达慢病毒的包装和鉴定

目的：构建miR-137过表达慢病毒载体并进一步包装慢病毒,探讨miR-137在HEK293T细胞中的感染效率和表达水平。方法：化学合成miR-137序列并克隆到慢病毒载体GV209,得到并鉴定含有目的片段的重组质粒,采用Lipofectamine 2000共转miR-137重组质粒与慢病毒辅助包装质粒到HEK293T细胞中生产慢病毒。以感染复数（MOI）值为40感染HEK293T细胞48h后,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达,采用荧光定量PCR法检测HEK293T细胞中miR-137的表达水平。结果：测序结果,目的基因序列与GenBank公布的miR-137基因序列完全一致。在感染的HEK293T细胞中观察到GFP的表达。过表达慢病毒感染细胞中miR-137表达水平是对照细胞的12.74倍。结论：成功包装miR-137过表达慢病毒,并可高效感染HEK293T细胞。     

Has-mir-335慢病毒表达载体的构建及其靶基因鉴定

目的构建过表达miR-335的稳定细胞株SW620并筛选和初步鉴定miR-335的靶基因。方法扩增包含hsa-miR-335前体序列在内的基因片段,并将其亚克隆至PLVTHM慢病毒载体;扩增包含RASA1 3’UTR种子区域的基因片段并将其亚克隆至psiCHECK-2载体,并对此重组载体进行定点突变构建psiCHECK-2-RASA1-Mut;检测萤火虫荧光素值(F)和海肾荧光素值(R),以R/F表示相对荧光素酶活性。流式细胞仪筛选建立稳定表达miR-335的细胞株,利用荧光定量PCR检测miR-335及其靶基因RASA1的表达,Western Blot检测RASA1蛋白水平的表达。结果质粒双酶切以及测序鉴定PLVTHM-miR335、psiCHECK-2-RASA1、psiCHECK-2-RASA1-Mut重组质粒构建成功。荧光定量PCR显示结直肠癌细胞中miR-335与RASA1表达趋势成负相关。双荧光素酶报告基因分析证实hsa-miR-335能够作用于RASA1的3’UTR。稳定过表达miR-335的细胞中,miR-335的表达明显高于对照组和未处理组,蛋白质水平有所下降。结论成功构建了PLVTHM-miR-335慢病毒重组质粒,构建过表达miR-335的细胞株SW620,初步证实RASA1是miR-335的靶基因。     

转录因子E2F-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建细胞周期相关转录因子E2F-1RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体。方法：选取E2F-1基因的19nt特异性序列,设计针对E2F-1的shRNA序列,应用基因重组技术克隆到pLentiLox3.7（pLL3.7）慢病毒表达载体中,XbaI和NotI进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,在脂质体的介导下将慢病毒的混合包装载体质粒和包含E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体共转染293FT细胞,包装成病毒48h后,收集病毒颗粒,孔稀释法测定病毒滴度。结果：双酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确;293FT细胞包装E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体成功;收集的细胞培养上清液中,病毒的滴度为5×10^7TU/mL。结论：成功构建人E2F-1基因RNAi慢病毒载体,为研究E2F-1对于胃癌生长的影响提供了稳定的转染细胞载体。     

重组Bmi1基因的慢病毒的制备和鉴定

目的制备携带B细胞特异单克隆鼠白血病毒整合位点1基因（Bmi1基因）的慢病毒pSin-Bmi1,并在人胚胎干细胞H1中过表达Bmi1基因和BMI1蛋白。方法根据GeneBank提供的Bmi1基因序列,以H1来源的cDNA为模板扩增其cDNA序列,回收片段,Bmi1基因和pSin载体分别进行双酶切,连接后的质粒转化。经菌落PCR、双酶切鉴定及测序鉴定pSin-Bmi1阳性克隆。将阳性表达的pSin-Bmi1和包装质粒转染到293T细胞中制备病毒液。将包装好的病毒感染人胚胎干细胞H1细胞系并用嘌呤霉素筛选稳定表达BMI1的细胞株。通过Western blot验证H1细胞中外源性BMI1蛋白表达。结果经菌落PCR、限制性核酸内切酶酶切和测序证实目的基因Bmi1序列正确。Western blot检测发现感染重组Bmi1的慢病毒的细胞中有外源性BMI1蛋白的高表达,而未感染重组Bmi1的慢病毒的对照组未检测到BMI1表达。结论成功制备了携带Bmi1基因的慢病毒,并得到了稳定高表达外源Bmi1的细胞株。     

VEGF和Smad7双基因过表达慢病毒载体的构建

目的：构建过表达VEGF和Smad7双基因的慢病毒载体,为勃起功能障碍基因治疗的研究提供有效工具。方法：根据GenBank中基因信息,设计合成VEGF和Smad7引物,采用overlap PCR方法扩增目的基因片段,运用基因重组技术将其克隆至慢病毒表达载体Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin,经酶切、测序对重组质粒进行验证。将重组质粒和Helper1.0、pHelper2.0辅助质粒共转染293T细胞,包装双基因过表达慢病毒并测试其滴度。结果：经酶切和测序鉴定表明VEGF和Smad7双基因重组慢病毒载体构建成功,荧光法测定重组慢病毒滴度高（2E+8TU/mL)。VEGF和Smad7重组慢病毒能高效转染293T细胞,Western blot检测显示VEGF和Smad7蛋白在靶细胞中过表达。结论：成功构建了携带VEGF和Smad7基因并能正确表达的高滴度的重组慢病毒载体。     

小鼠BMPRⅠb基因慢病毒载体构建及转染神经干细胞

目的:构建携带小鼠BMPRⅠb基因的慢病毒载体,并转染神经干细胞,为研究BM-PRⅠb在BMPs调控神经干细胞分化中作用奠定基础。方法:利用RT-PCR从小鼠脑组织中获得BMPRⅠb基因,然后定向插入慢病毒表达质粒,进行双酶切及测序鉴定。将鉴定成功的重组慢病毒质粒和另外两种辅助质粒共转染包装细胞,收集、浓缩慢病毒并检测其滴度。利用获得的慢病毒载体转染NSCs,并观察目的基因表达情况。结果:RT-PCR产物经电泳及测序证实克隆成功BM-PRⅠb基因,酶切及测序鉴定成功构建重组慢病毒质粒,共转染293T细胞72h后大部分细胞表达绿色荧光,病毒滴度为5×108 TU/ml。慢病毒感染后的NSCs表达绿色荧光且BMPRⅠb mRNA表达上升。结论:成功构建BMPRⅠb基因慢病毒载体,并成功转染NSCs。     

BAD慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的探讨促凋亡基因BAD(Bcl-2-associated death protein)重组慢病毒表达载体构建及其对肺癌A549细胞株增殖的影响。方法应用PCR法从含有目的基因的质粒pAV-MCMV-BAD-GFP中扩增BAD基因片段,克隆至慢病毒载体(pLVX-IRES-ZsGreen 1),应用PCR、酶切和测序鉴定正确后,经病毒包装,感染A549细胞,经流式细胞仪筛选稳定表达细胞株,Western blot鉴定重组慢病毒感染的A549细胞BAD的表达。采用CCK-8试剂盒定点检测细胞的光密度(OD)值,分析BAD蛋白过表达对A549细胞增殖能力的影响。结果酶切鉴定和基因测序证实长度为507bp的BAD基因成功克隆至慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1;重组慢病毒通过感染A549细胞株和流式细胞仪筛选出单克隆细胞株BAD-A549,Western blot检测结果显示,细胞培养BADA549细胞可稳定过表达BAD蛋白。体外增殖结果显示,细胞培养120~144h,BAD组的OD值均较对照组低(P<0.05)。结论成功构建了BAD重组慢病毒载体,获得稳定表达BAD的A549细胞株。BAD过表达能有效抑制A549细胞的增殖速度。     

黑色素转铁蛋白重组慢病毒载体的构建及其在宫颈癌HeLa细胞中的功能验证

目的: 构建黑色素转铁蛋白(melanotransferrin,MFI2)基因嵌入的慢病毒载体,上调宫颈癌HeLa细胞中MFI2表达水平,并探讨MFI2对HeLa细胞增殖的影响。方法: 以HeLa细胞cDNA为模板复制扩增MFI2相应片段,并将该单边对应序列嵌入到慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen(pHAGE)质粒中构建pHAGE-MFI2重组质粒;将重组质粒与包膜质粒pMD2.G、包装质粒psPAX2协同转染入人胚肾上皮293T细胞,制备MFI2融合病毒,通过梯度稀释法检测病毒滴度。以MFI2融合病毒感染HeLa细胞,通过免疫印迹法检测MFI2标签在细胞中的表达量,采用CCK-8法及划痕实验评价上调MFI2表达量对HeLa细胞扩增能力的影响。结果： 质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果均证实pHAGE-MFI2质粒构建成功;通过慢病毒三质粒协同包装系统成功构建MFI2基因融合慢病毒,病毒液滴度高达6×10⁷ TU/mL;MFI2慢病毒感染HeLa细胞后,其MFI2的蛋白表达水平明显增高,而细胞增殖活力则显著降低。结论： MFI2高表达可有效抑制HeLa细胞增殖。     

人CDH22基因RNAi慢病毒载体的构建及稳定干扰CDH22基因的表达

目的 构建人CDH22基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默大肠癌细胞的CDH22基因表达,为研究CDH22在大肠癌转移中参与的信号转导机制提供研究基础.方法 利用在线软件设计人CDH22基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核酸后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端,测序.得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组,获得真核表达慢病毒干扰载体.在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助质粒和CDH22基因重组慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染大肠癌细胞SW480,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰CDH22基因的细胞亚系.结果 成功构建CDH22真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8×105U/ml.荧光定量PCR结果表明,所获得的细胞克隆11中CDH22 mRNA水平的表达显著降低.结论 成功构建出CDH22基因慢病毒RNAi表达载体,并获得CDH22基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系,为研究CDH22在大肠癌转移中的作用机制提供了研究基础.