人胚神经干细胞的培养与基因修饰后体内的表达

目的 分离培养人胚神经干细胞(human neural stem cells, hNSCs),建立人胚神经干细胞株;体外通过逆转录病毒转染人胚神经干细胞,观察其生物学特性及在脊髓损伤(spinal cord Injury,SCI)模型体内的表达.方法 分离孕10～20周(平均13周)人胚脑皮层来源的神经干细胞并连续传代培养,通过克隆试验、免疫组织化学等方法检测其生长特性与增殖能力;用构建了增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因的逆转录病毒转染神经干细胞并检测其生物学特性;制备兔T9全横断脊髓损伤模型,观察携带EGFP基因的人胚神经干细胞在体内的表达情况.结果 从胎龄10～20周的人胚脑皮层中成功分离出人胚神经干细胞,该细胞具有连续克隆能力及多分化潜能,能表达干细胞及分化细胞的特异性抗原;逆转录病毒转染后,仍然保持未分化状态并能自我更新形成新的神经球;移植入兔脊髓损伤模型后,可在体内存活较长时间,高效表达转基因蛋白.结论 人胚脑皮层中存在能连续传代培养的神经干细胞,转基因及移植入体内后能高效表达目的基因蛋白并保留干细胞的基本属性,发挥治疗作用.     

人胚神经干细胞的长期培养与基因修饰

目的 通过逆转录病毒将增强绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因转染人胚神经干细胞,观察其生物学特性与体内表达情况.方法 分离孕10～20周人胚脑皮层来源的神经干细胞并连续传代培养,通过克隆试验、免疫组织化学等方法检测其生长特性及增殖能力;使用构建了EGFP基因的逆转录病毒转染神经干细胞并检测其生物学特性;制备兔T9全横断脊髓损伤模型,观察携带EGFP基因的人胚神经干细胞在体内的表达情况.结果 从胎龄10～20周的人胚脑皮层中成功分离出人胚神经干细胞,该细胞具有连续克隆能力及多分化潜能,表达干细胞及分化细胞的特异性抗原.转染EGFP基因后,仍保持未分化状态,能够自我更新形成新的神经球;移植入兔脊髓损伤模型后,仍高效表达转染基因蛋白,并在体内发生增殖、迁移.结论 人胚脑皮层中存在能长期传代培养的神经干细胞;转染EGFP基因后仍保留神经干细胞的基本特性;移植人体内能持续、高效表达EGFP,有利于观察其存活、迁移情况,并为功能基因修饰与移植研究提供了方法.     

大鼠胚胎大脑皮层源性神经干细胞体外培养及增殖分化特点

目的 建立大鼠胚脑皮层神经干细胞体外培养及鉴定技术,探讨其增殖分化特性,为应用神经干细胞移植治疗神经疾病提供基础。方法 采用含有丝分裂源表皮生长因子(EGF)的无血清培养基培养SD大鼠孕14．5d的胚胎大脑皮层神经干细胞,应用免疫细胞化学方法了解其增殖分化特性;以单细胞克隆实验及BrdU免疫标记证实神经干细胞自我增殖能力。结果 培养细胞在EGF作用下可分裂增殖,并表达神经干细胞特异性抗原nestin,分化细胞MAP2及GFAP抗原表达阳性。结论 SD大鼠胚脑皮层可分离培养出神经干细胞;并具有增殖、自我更新能力和多向分化潜能特性。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养和鉴定

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14~16 d的SD大鼠胚胎端脑皮层在条件培养基中培养增殖传代分化,用神经干细胞特异性抗体———巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞,用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。结果获得了大量自我增殖并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经干细胞。结论成功分离并获得了大鼠胚胎端脑皮层神经干细胞,并连续稳定传代,具有多向分化潜能,可用于进一步的实验研究。     

Study on the differentiation of embryonic stem cells derived epidermal stem cells into sweat gland cells in vitro

目的:探讨体外诱导胚胎干细胞来源表皮干细胞向汗腺上皮分化可行性及条件,为汗腺组织工程探索新的种子细胞提供来源.方法:体外分离培养、扩增并鉴定人汗腺细胞.将胚胎干细胞培养于人羊膜表面诱导其向表皮干细胞转化后,与人汗腺细胞直接共同培养,诱导其分化为汗腺细胞.采用倒置显微镜进行形态学观察,并用免疫细胞化学染色方法检测诱导分化结果.结果:体外培养的人汗腺细胞CK19、CEA阳性表达.培养于人羊膜表面的胚胎干细胞β1整合素呈强阳性表达,符合表皮干细胞的表面抗原标志.经与人汗腺细胞共培养2周后,有部分胚胎干细胞来源的表皮干细胞表达CEA,表明通过汗腺细胞分泌的细胞因子、细胞间直接接触等可能的作用途径,使其表型向汗腺细胞表型转化.结论:胚胎干细胞来源表皮干细胞可能成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源.     

人胚脑神经干细胞的分离、培养和鉴定

目的：探讨人胚脑神经干细胞的体外生长特性、分化情况和培养条件，为相关实验研究提供条件。方法：利用神经干细胞的条件培养基，对从9周和12周胚龄的自然流产胎儿分离的前脑、后脑进行神经干细胞培养，并比较其生长特性。以免疫荧光细胞化学技术检测神经上皮干细胞蛋白(Nestin)和分化后神经细胞抗原的表达。结果：两胚龄前、后脑组织中均分离出神经干细胞，他们均表达Nestin抗原阳性。血清诱导分化后，表达神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。9周胚龄的脑组织原代培养形成细胞克隆的比例高于12周胚龄的脑组织。在条件培养基存在的情况下，后脑组织分离的神经干细胞比前脑组织来源的更容易分化。结论：从人胚脑组织中的前、后脑中分离出神经干细胞，较小胚龄的脑组织原代培养时细胞克隆的形成比例较高，后脑组织分离的神经干细胞比前脑组织来源的更容易分化。     

人胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

目的探索人胚胎神经干细胞的体外分离培养条件,并观察神经干细胞增殖、分化的特点.方法采用机械方法从流产的10～18周胎龄的人胚胎前脑分离神经干细胞,用无血清培养液,加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激细胞增殖,进行体外扩增、传代培养.传3～4代的神经细胞球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液贴壁诱导分化培养.采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞.结果从人胚胎前脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经细胞球,这些神经细胞球可在体外增殖及传代培养.神经细胞球用特异性的鼠抗人巢蛋白(nestin)抗体鉴定,大部分为阳性细胞.神经细胞球在血清培养液贴壁培养后可分化出神经纤维细丝(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Gal-C)表达阳性的细胞.结论从人胚胎前脑分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,属于神经干细胞;在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,神经干细胞能在体外大量扩增.     

体外诱导胚胎干细胞来源表皮干细胞向汗腺细胞分化的研究

目的:探讨体外诱导胚胎干细胞来源表皮干细胞向汗腺上皮分化可行性及条件,为汗腺组织工程探索新的种子细胞提供来源。方法:体外分离培养、扩增并鉴定人汗腺细胞。将胚胎干细胞培养于人羊膜表面诱导其向表皮干细胞转化后,与人汗腺细胞直接共同培养,诱导其分化为汗腺细胞。采用倒置显微镜进行形态学观察,并用免疫细胞化学染色方法检测诱导分化结果。结果:体外培养的人汗腺细胞CK19、CEA阳性表达。培养于人羊膜表面的胚胎干细胞β1整合素呈强阳性表达,符合表皮干细胞的表面抗原标志。经与人汗腺细胞共培养2周后,有部分胚胎干细胞来源的表皮干细胞表达CEA,表明通过汗腺细胞分泌的细胞因子、细胞间直接接触等可能的作用途径,使其表型向汗腺细胞表型转化。结论:胚胎干细胞来源表皮干细胞可能成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源。     

人胚胎海马神经干细胞体外培养方法的建立

为建立人胚胎海马神经干细胞的体外培养方法 ,防止神经干细胞在培养过程中的分化 ,确立最佳的传代时机和方法 ,分离 1 6周人胚海马组织 ,采用无血清培养基对所分离的神经干细胞进行体外培养 ,比较不同培养条件与方法所获得的神经球数量的差异。结果 :建立了人胚胎海马神经干细胞体外培养的优化条件 ,确立了最佳传代方法与时机。提示 :人胚胎海马神经干细胞在体外抑制分化的条件下可以长期处于未分化状态增生 ,并且可多次传代。     

壳聚糖与神经干细胞生物相容性的研究

目的 探讨生物降解材料壳聚糖与神经干细胞的生物相容性。方法 取SD大鼠胚胎（孕14-16d)大脑皮层组织制成单细胞悬液在无血清培养液中进行培养，获得大量的神经干细胞，再将所获神经干细胞在不同条件下移植接种至壳聚糖膜上联合培养1周，在倒置显微镜下观察神经干细胞生长增殖情况及形态变化，并对其分别进行免疫组化染色，电镜观察，了解壳聚糖对神经干细胞生长，增殖，分化的影响。结果 在无血清联合培养条件下，神经干细胞仍然维持其原有的干细胞特性；在含血清的培养液中，神经干细胞能分化成多种形态的神经细胞，并且在壳聚糖膜上生长良好。结论 壳聚糖与神经干细胞具有良好的生物相容性。     

人胚神经干细胞体外分离扩增及移植应用

目的　从胎龄 10周 - 12周的人工流产胚胎脑皮分离 ,鉴定神经干细胞并加以扩增后移植进入脑瘫患儿脑内的治疗效果。方法　利用无血清培养从胎龄 10周 - 12周的人工流产胚胎皮层分离具有增殖能力的细胞群 ,经过连续传代后得到大量亚克隆 ,采用免疫荧光细胞化学技术检测 Nestin抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。确定合适的受体后将其多点植入胼胝体及受损脑区。结果　从皮层分离的细胞群具有连续克隆能力 ,免疫组化证实其 Nestin抗原阳性。移植术后患儿病情有一定好转。结论　我们分离的中枢神经系统的细胞具有自我更新能力 ,是神经干细胞。这种神经干细胞为以脑瘫为代表的某些神经系统疾病的进一步治疗提供了有潜在价值的细胞资源。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定研究

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞（NSCs）的分离、培养、分化及鉴定的条件与方法。方法分离孕14～16dSD大鼠胚胎脑皮质及皮质下区域NSCs,无血清培养基（DMEM／F12,含bFGF、EGF、B27等）条件下培养,通过有限稀释法克隆、传代,含血清培养基诱导分化,免疫组织化学法鉴定NSCs及诱导分化后的细胞。结果体外培养的NSCs能稳定增殖成神经干细胞球并传代（nestin染色阳性）,经诱导可分化为神经元细胞（NSE染色阳性）、星形胶质细胞（GFAP染色阳性）和少突胶质细胞（CNP染色阳性）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可在体外大量培养出稳定增殖并具有多向分化潜能的大鼠胚胎NSCs,为进一步研究NSCs的生物特性及应用奠定了基础。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

人神经干细胞体外诱导分化及在体裸鼠胃肠道的移植

目的:探索人神经干细胞体外诱导分化,以及在体移植人裸鼠(免疫缺陷小鼠)幽门部后的存活及分化状况.方法:取10周左右流产人胚胎神经干细胞,体外悬浮培养、传代和诱导分化,用免疫荧光方法检测神经干细胞标志物神经上皮干细胞蛋白(nestin)、肠道神经细胞标志蛋白基因产物9.5(protein gene product 9.5,PGP9.5)和神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP);取体外悬浮培养3个月的人神经干细胞移植入裸鼠的幽门部,检测神经十细胞在幽门局部的存活和分化状况.结果:免疫荧光染色显示体外培养的人神经干细胞nestin阳性,诱导分化后PGP9.5和GFAP阳性.将人神经干细胞移植入裸鼠幽门部后连续检测到第6周,可见细胞存活,但免疫荧光染色未能榆测到神经细胞和神经胶质细胞的分化标志.结论:人神经干细胞可以成功地在体外培养、传代和诱导分化,移植入裸鼠幽门部后可在局部存活,对干细胞移植治疗胃肠道神经系统失调性疾病进行了初步探索.     

神经干细胞球和单层贴壁神经干细胞的培养及鉴定

目的：探讨小鼠大脑皮层源性神经干细胞（NSCs）体外培养的两种方法并对培养的细胞进行鉴定。方法：分别取孕14-16d的昆明小鼠胚胎脑皮质并用细胞球悬浮培养和单层贴壁培养两种方法进行体外培养，用光学显微镜观察NSCs的生长情况，并用免疫细胞化学鉴定NSCs特异性抗原的表达，经过血清对NSCs分化诱导后进行胶质纤维酸性蛋白及微管相关蛋白．2的检测。结果：①培养出来的细胞可以扩增生长；②这两种方法分别培养的神经干细胞球和单层神经干细胞经抗巢蛋白免疫细胞染色均呈阳性；③两种培养方法培养出的NSCs经诱导分化后，免疫细胞化学染色显示微管相关蛋白-2、神经胶质酸性蛋白染色阳性。结论：采用无血清培养基中加入特定生长因子的神经干细胞球培养和单层贴壁两种培养技术，可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的NSCs。     

人胎脑神经干细胞的体外分离、培养与鉴定

目的探索人胎脑神经干细胞的体外分离培养条件,从而在体外大量增殖神经干细胞,并观察神经干细胞增殖和分化的特点。方法采用含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养技术,从14周自愿水囊引产人胎脑海马皮质中分离出神经干细胞,并进行培养、传代、分化观察,应用免疫荧光细胞化学技术对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果从14周人胎脑皮质中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续增殖能力,可传代培养,表达神经巢蛋白抗原（Nestin）;在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞和胶质细胞的特异性抗原。结论在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,从人胎脑能分离培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞,并能在体外扩增,可进一步用于基础及临床研究。     

胚胎小鼠神经干细胞的培养和诱导分化

目的 探索体外培养和诱导分化胚胎小鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法 .方法分离12.5 d ICR小鼠胚胎的大脑皮质,通过Accutase酶消化法和机械消化法,将组织消化成单个细胞,置于完全培养基中培养,3d后神经干细胞增殖成神经球;将传代的神经球消化,通过诱导培养基诱导其分化;采用细胞免疫荧光染色和qRT-PCR技术检测巢蛋白(Nestin)、中间微管相关蛋白2(Map2)和胶质纤维酸性蛋白(Gfap)的表达,鉴定NSCs、分化形成的神经元和星形胶质细胞.结果 NSCs能被Nestin特异性标记,诱导分化后的细胞可被Map2和Gfap抗体特异识别;qRT-PCR结果显示,诱导后Nestin的表达水平降低,而Map2和Gfap的表达水平升高.结论 通过Accutase酶消化法联合机械消化法分离小鼠胚胎脑皮质,进行体外培养,可获得具有自我更新能力和多向分化潜能的NSCs.     

人胚神经干细胞的分离培养和鉴定

目的：从流产人胚前脑中分离培养人胚神经干细胞。方法：神经干细胞具有自我复制和多向分化潜能。本实验利用神经干细胞特定的培养增殖培养体系分离纯化人胚神经干细胞,并对分离得到的神经干细胞的分子标记及分化潜能进行鉴定。结果：从8~10周龄流产人胚胎分离得到了神经干细胞,它能表达神经干细胞特异性抗原nestin,并能在体外诱导分化为神经元细胞和神经胶质细胞。结论：在人胚中枢神经系统中存在神经干细胞,并能够在体外扩增,为神经干细胞的基础研究和临床应用奠定了基础。     

体外培养的神经干细胞的端粒和端粒酶活性

目的了解体外培养的神经干细胞端粒酶活性，观察培养不同时间神经干细胞的端粒酶活性、端粒长度的情况。方法采用无血清培养法从新生大鼠脑皮质分离培养神经干细胞，通过免疫荧光细胞染色鉴定神经干细胞；TRAP-ELISA法测定培养4～12周的神经干细胞的端粒酶活性；Southern-blot法测定培养第1代、第10代时神经干细胞的端粒长度。结果从新生大鼠脑皮质分离培养的神经干细胞具有端粒酶活性；体外培养12周内神经干细胞的端粒酶活性未见变化；神经干细胞具有较长的端粒（23．8～24．3kb），且不随细胞传代而变化。结论大鼠脑神经干细胞具有端粒酶活性，在体外培养过程中，未见活性变化并能维持端粒的长度。