外周血细胞DNA、RNA及血红蛋白同时提取法

采用淋巴细胞分离液分离外周血中的有核细胞,经细胞裂解液处理,上清提取RNA,沉淀提取DNA,用分离液分离所得红细胞沉淀制备血红蛋白溶液。经对抽提物质量进行评价,发现3种提取物质量均高。本法能从少量外周血中同时分离DNA、RNA及血红蛋白,高效易操作,值得推广。     

乳腺癌患者外周血RNA提取方法的探讨

目的：建立外周血RNA的提取方法，为用逆转录－聚合酶链反应检测乳腺癌外周血中微转移打好基础。方法：从30例乳腺癌患者的冰冻保存和新鲜全血标本，用两种不同方法分离外周血有核细胞，提取RNA，测定RNA产量及RNA的完整性。结果：从冰冻保存和新鲜全血标本，提取的总RNA的OD值有显著性差异。从新鲜全血中提取RNA的产量高于从冰冻保存的全血中提取的RNA的产量。但是，电泳时均有28S与18S的条带。结论：用逆转录－聚合酶链反应时，以从新鲜全血中提取RNA为宜，但为留取标本的方便，也可用冰冻保存的全血标本，该实验中所采用的两种分离外周血有核细胞提取RNA的方法都切实可行。     

一种新型全白细胞分离液的研制

目的：为了有效地允离、提取外周血全白细胞，研制一种新型的细胞分离液。方法：右旋糖苷（聚蔗糖）和泛影葡胺按不同比例混合配制成四种比重、五种渗透压的分离液。通过对50例正常外周血的分离摸索出最佳全白细胞分离液的比重和渗透压。结果：最佳全白细胞分离液的比重为1．112g/ml，渗透压为520mOsm／L。结论：我们自制的全白细胞分离液提取细胞浓度及细胞纯度高，细胞组分全，细胞比例正常，细胞形态及细胞活性保持良好。同时全白细胞分离液还可以进行其他细胞分离，为相关学科的研究提供了一种有效的细胞分离新方法。     

人外周血细胞DNA快速提取

外周血采集方便,是核酸筛查时常规取样途径。提取外周血DNA经典方法常需分离白细胞并经表面活性剂和蛋白酶K(SDS-PK)处理,操作比较繁琐。Bowtell等报告以浓盐酸胍(GHCL)溶液作为蛋白变性剂用于染色体DNA的提取,原方法未经酚抽提而将细胞裂解液与乙醇混合后,采用末端为“U”型的玻璃棒将线状DNA挑出,在实验室试用后发现,在体外培养细胞或组织DNA取样量较多时才易将DNA分子绕在玻璃棒上,且操作时体积大于20ml。为了适用于数毫升全血DNA快速提取。辅     

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

目的(1)建立RT PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA PCR和RNA PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。方法用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PBMC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。结果DNA PCR和RNA PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7d,RNA PCR结果为79阳性,DNA PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有59阳性;此后一直到感染后的42d,RNA PCR和DNA PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35d下降到49,到42d时下降为零。结论PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期———血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。     

培养细胞RNA与DNA的同时提取

RNA与DNA的提取技术,从微量分离到大规模制备,已日趋完善。但有时样品数量较少如处理细胞标本时,则有必要同时提取RNA与DNA。目前一般采用CsCL超速离心获取具有不同密度离心速率的DNA和RNA。该法简单且收率高,但受设备条件限制。我们在提取人肺高转移巨细胞癌细胞系RNA用于构建cDNA文库时,将现有方法稍加改良,可以同时制备纯度较高的基因组DNA。     

大鼠心肌总RNA的提取

目的 建立一种高效快速提取大鼠心肌总RNA的方法，为心肌组织mRNA的检测提供条件。方法 利用高浓度强烈变性剂(异硫氰酸胍)使细胞结构迅速破坏，并直接通过酚等有机溶剂处理、离心，使RNA与细胞DNA、蛋白质、细胞残片等分离，迅速得到总RNA。结果 得到高纯度、未被降解的总RNA。结论 此法简洁高效，耗时短，完全可用于临床分析工作。     

毛细管电泳测定micro RNA346基因多态性的方法研究

目的建立micro RNA346基因多态性的毛细管电泳（CE）测定方法。方法采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取血清样品基因组DNA，PCR扩增micro RNA346目的基因，BciT130Ⅰ限制性内切酶酶切，产物用CE测定。对CE筛分介质质量浓度、分离电压等参数进行了优化。在优化的条件下（筛分介质质量浓度为10 g/L分离电压为12 kV)，分别测定类风湿性关节炎患者和正常人血清样品micro RNA346酶切产物，并对其进行基因分型。结果在优化的CE实验条件下（筛分介质质量浓度为10 g/L，分离电压为12 kV，25 min内可完成micro RNA346基因酶切产物检测。方法日内相对标准偏差（RSD）为0.43%～0.63%，日间RSD为1.49%～1.56%。用该法测定了96份类风湿性关节炎患者样品和43份正常人样品，结果均为micro RNA346 Ⅰ型，未发现micro RNA346 Ⅱ型。结论本研究建立的方法操作简单，具有高效、快速、样品用量少、自动化程度高等优点，适用于micro RNA类小分子RNA基因多态性的测定。     

简便快速提取心肌组织总RNA

利用高浓度尿素变性蛋白质抑制RNA酶，氯化锂（LiC1)选择性沉淀RNA，酚／氯仿抽提除去变性的蛋白质，脂类及DNA。结果表明：该法适合大量样品少量组织细胞的RNA提取。     

C-myc癌基因在正常人外周血淋巴细胞及肿瘤细胞株上的表达

目的探讨癌基因C-myc在正常人外周血淋巴细胞及肿瘤细胞株上的表达情况。方法分离正常人外周血淋巴细胞,采用异硫氰酸胍一步法提取正常人外周血淋巴细胞及肿瘤细胞株RNA,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,比较正常人与肿瘤细胞株C-myc mRNA表达程度。结果 HL-60细胞系C-myc RNA表达最强,GBC胃癌细胞株较正常人为高。结论 C-myc参与了正常、异常细胞生长的调节。     

同一细胞DNA和RNA同时分别提取的简便方法

本文探讨并建立了从同一细胞中同时提取细胞核DNA和细胞浆RNA的方法。经紫外分光光度仪扫描,生化测定以及电泳等方法的鉴定表明:提取的核酸无论从量还是从质上均可满足对DNA和RNA的各种实验研究。此法简便稳定,是从同一细胞中分别提取DNA和RNA的理想方法。     

人白细胞介素-10 cDNA的克隆、测序和真核表达载体的构建

目的 克隆、测序人白细胞介素－10 cDNA开放阅读框架。方法 刀豆蛋白A活化的人外周血核细胞培养后用于提取总RNA,以随机引物行逆转录反应合成hIL-10 cDNA第一链,并以hIL-10 特异性引物行PCR扩增,将PCR产物克隆至pUC18中测序并构建真核表达载体pcDNA3.1hIL-10。结果 PCR扩出550bp特异性片段,经克隆至pUC18后测序表明序列同源性与GenBank报道完全一致,并克隆鉴定了真核表达载体pcDNA3.1hIL-10。结论 成功克隆了人白细胞介素－10 cDNA开放阅读框架,序列分析证实与ＧenBank录入序列同源性达１００％,并成功构建了真核表达载体pcDNA3.1hIL-10。     

原位聚合酶链反应检测结核分枝杆菌L型的初步研究

目的：建立一种不需提取ＤＮＡ的检测分枝结核杆菌Ｌ型的分子生物学方法。方法：采用原位聚合酶链反应（原位ＰＣＲ）技术,扩增结核杆菌Ｌ型及其感染的人和小鼠血标本中的结核杆菌ＩＳ６１１０基因,再用免疫组化技术显色。结果：结核杆菌Ｌ型菌株中的ＤＮＡ被扩增,血标本中,可见到红细胞和淋巴细胞周围粘附大量结核杆菌ＤＮＡ阳性颗粒。结论;红细胞和淋巴细胞具有免疫粘附功能,原位ＰＣＲ快速、简便,可用于检测稳定和不稳定分     

两种冻存方法在肿瘤微转移检测中的运用

目的 建立科学的外周血有核细胞的冻存方法,为肿瘤的微转移逆转录ＰＣＲ检测打好基础。方法 分离１５例ＣＥＡ分泌性肿瘤患者外周血有核细胞,分别用两种方法冻存,设为两组。对细胞进行总结ＲＮＡ的抽提,测定ＲＮＡ ＯＤ值并行１％琼脂糖凝胶电泳,进一步逆转录ＰＣＲ反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳分析最终产物。结果 经两种方法冻存的细胞,其总ＲＮＡ ＯＤ值差异无显著性,电泳均见竹节样带。两组逆转录ＰＣＲ结果一致,阳性率     

CPDA液对RT-PCR检测急性白血病MUC1表达的影响

目的分析CDPA液保存急性白血病患者骨髓对RT-PCR方法检测MUC1基因的影响。方法31例初治急性白血病患者各同时留两份骨髓标本,一份立即分离单个核细胞提取总RNA,一份注入CDPA液血袋4℃保存48h后再分离单个核细胞提取总RNA,分别用RT-PCR方法检测MUC1基因的表达并对结果进行比较。结果两组标本提取的总RNA0D260／280都大于1.8;两组标本的MUC1基因检测结果完全一致。结论4℃下CDPA液保存骨髓48h对采用RT-PCR方法检测MUC1基因的结果无影响,基层医院可用此法保存骨髓送上级医院行基因检测。     

四种腺病毒核酸提取方法的比较

目的通过蛋白酶K法、苯酚法、病毒DNA/RNA提取试剂盒、腺病毒荧光PCR检测试剂盒等四种腺病毒核酸提取方法的比较,为进一步研究腺病毒的分子生物学特性选择合适的方法提供参考。方法以腺病毒感染的A549细胞为样品,分别以蛋白酶K法、苯酚法、病毒DNA/RNA提取试剂盒、腺病毒荧光PCR检测试剂盒等四种方法提取核酸,核酸经紫外分光光度计检测A260/A280的比值后,用荧光定量PCR方法检测核酸中腺病毒拷贝数浓度,并记录四种腺病毒核酸提取方法所需的操作时间。结果蛋白酶K法、苯酚法、病毒DNA/RNA提取试剂盒、腺病毒荧光PCR检测试剂盒等四种方法提取核酸的A260/A280的比值依次为1.85532、1.7377、1.81474和1.43934,核酸中腺病毒拷贝数浓度依次为4.9×105copies/mL、3.94×103copies/mL、2.66×106copies/mL和6.15×106copies/mL,提取核酸所需的时间分别为1.5、15、0.5和0.5h。结论四种腺病毒核酸提取方法中,蛋白酶K法简单快捷、成本低廉,适合一般实验室使用;苯酚法适合用于提取细胞培养上清中病毒的核酸;病毒DNA/RNA试剂盒...     

黄花石蒜花蕊和花葶组织中总RNA提取方法的比较

目的 筛选适合黄花石蒜花蕊和花葶组织中总脱氧核糖核苷酸(RNA)的提取方法.方法 采用CrAB法、SDS法和植物总RNA提取试剂盒法对黄花石蒜花蕊和花葶组织中总RNA进行提取并比较其效果.结果 CTAB法和SDS法均不能提取到完整的RNA;植物总RNA提取试剂盒能有效地去除蛋白质、多糖及DNA,28S条带的荧光亮度是18S条带的2倍左右,OD260/280值在1.8～2.0之间,花蕊和花葶的产率分别为304.1 μg/g和255.8 μg/g,并且试剂盒法提取的总RNA通过RT-PCR扩增能获得特异性条带.结论 试剂盒法适合黄花石蒜花蕊和花葶组织总RNA的提取,提取的总RNA质量高、完整性好、产率高,符合后续实验的要求.     

人外周血细胞线粒体DNA中存在特大片段缺失突变

了解线粒体ＤＮＡ大片段缺失突变及其意义。方法采用６种方法提取人外周血细胞ＤＮＡ,,其中１种方法先分离线粒体,再抽提线粒体ＤＮＡ。以得到的人外周血细胞ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增,其产生经琼脂糖凝胶回收后与ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接、转化、测序。结果６种方法抽提ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增后,产物电泳行为相同,发现人血细胞线粒体ＤＮＡ存在１３１６２ｂｐ特大片段缺失突变。结论此缺失首首发现的,经测序证明为人线粒体ＤＮ     

改良CTAB法提取连钱草基因组DNA

目的:建立高质量的连钱草基因组DNA的提取方法.方法:在传统十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法的基础上加以改良,比较不同浓度CTAB对提取的连钱草基因组DNA质量的影响,并对所得的DNA采用紫外分光光度计、电泳和PCR扩增等方法进行检测.结果:用2%浓度的CTAB处理所获得的基因组DNA质量较好,蛋白质残留少,RNA消...