大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性及分化潜能研究

目的建立一种体外分离、培养和扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法.探讨体外培养骨髓间充质干细胞的一些生物学特性,为利用MSCs进行多种疾病的细胞治疗提供实验基础. 方法分离6～8周龄的大鼠胫骨、股骨,用DMEM/F12培养基冲出骨髓,采用Percoll淋巴细胞分离液获得骨髓中的单个核细胞,并结合MSCs的贴壁特性,获得大鼠MSCs,体外扩增.体外进行多向诱导分化鉴定分离的细胞,并测定传代细胞的生长曲线、观察其接种贴壁率、检测细胞周期和超微结构.结果体外培养的MSCs生长状况良好,并能迅速扩增,具有分化形成成骨和成脂肪细胞的能力;MSCs倍增时间约为28.8h;传代后10h贴壁达95.5% 以上;细胞周期显示有92%细胞处于G0/G1期;电镜显示的结果进一步证实MSCs具备了干细胞的结构特点.结论在本实验条件下,体外培养的MSCs具有多向分化潜能,体外生长稳定,传代后的细胞适应性强,增殖较快,超微结构和细胞周期表现出较早期细胞特点.使干细胞用于移植治疗、基因治疗成为可能.     

小鼠骨髓间质干细胞的生物学特点及分化潜能鉴定

目的：建立一种体外分离，培养和鉴定小鼠骨髓间质干细胞的方法，探讨体外培养中间质干细胞的一些生物学特点，为利用MSCs促进创伤修复提供实验基础，方法：分离5－6周龄的小鼠胫骨，股骨，用预冷的IMDM培养基冲洗出骨髓，经密度梯度离心得到骨髓单个核细胞，接种后12－16d形成意志贴壁的成纤维状细胞，体外多向诱导分化鉴定分离的细胞，用传代的细胞进行生长曲线的测定，观察其接种贴壁率，检测细胞周期和超微结构。结果：体外传代培养的MSCs具有分化形成成骨和成脂细胞的能力；MSCs倍增时间约为38h，传代后12h贴壁达90％以上，细胞周期显示有80％细胞处于G0／G1期，并用电镜照片显示其超微结构。结论：在本实验条件下，体外培养的MSCs具有多向分化潜能,体外生长稳定，传代后的细胞适应性强，增殖较快，超微结构和细胞周期表现出较早期细胞特点，可望用于自体创伤促愈。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及生物学特性研究

目的 探讨体外培养骨髓间充质干细胞的一些生物学特性，为利用MSCs进行疾病的细胞治疗提供实验基础。方法 密度梯度离心，贴壁培养和消化时间控制相结合，分离纯化人骨髓间充质干细胞，并用马血清诱导分化为脂肪细胞。结果 分离获得了高纯度贴壁生长的MSCs。MSCs原代培养呈均匀分布的集落样生长，呈梭形。细胞传代稳定，在体外连续传代培养9代，未发生形态学改变，无衰老征象；传代培养MSCs（P3）在20％马血清的L—DMEM培养液中分化为脂肪细胞。结论 采用Percoll细胞分离液密度梯度离心，贴壁培养和消化时间控制相结合，可以获得纯度较高和活性骨髓MSC，是简便有效使用可行的方法；骨髓MSCs体外增殖和传代能力强，通过离体培养可使体内环境下低丰度的MSCs实现数量扩增；     

兔外周血间充质干细胞生物学性状的研究

目的应用G—CSF动员骨髓干细胞后分离外周血间充质干细胞（MSCs）,并体外培养扩增然后进行鉴定。方法应用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、培养兔外周血MSCs,并用显微镜观察细胞形态,测定细胞的生长曲线并用流式细胞仪鉴定。结果@MSCs于体外培养2h开始贴壁生长,细胞形态为梭形、多角形及纺锤状等。传代MSCs变为形态均一、排列有序的长梭形细胞,增殖活跃,细胞平均倍增时间为30h;②流式细胞仪检测MSCs表面抗原CD34、CD45呈阴性表达,CD44呈阳性表达。结论采用密度梯度离心法和贴壁法可以有效获得应用G—CSF动员后的外周血MSCs,且细胞纯度高,生长增殖活性好。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性观察

目的：观察体外培养的人骨髓间充质干细胞(MSCs)部分生物学特性。方法：自健康人骨髓中分离出MSCs,进行原代培养,第5d首次更换培养液,以去除未贴壁细胞,以后每周换液2次,细胞铺满整个培养瓶底90％时开始传代培养。倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞形态及生长特性,并绘制传代细胞的生长曲线。流式细胞仪检测第3代MSCs细胞表面分子CD29、CD44,以进行MSCs鉴定。结果：MSCs体外培养为贴壁生长。MSCs原代培养约18～21d才达传代要求;传代培养细胞生长潜伏期仅24～36h,对数增长期约3～5d,之后为平台期,4～6d传1代。传至第8代,出现凋亡征象。第3代MSCs细胞表面CD29、CD44的表达率分别为90．6％和91．5％,MSCs均一性较高。结论：从人骨髓中分离出的MSCs在体外环境中具有很强的自我更新和分裂增殖能力。     

兔骨髓基质干细胞的分离、扩增和生物学特性检测

目的探讨密度梯度离心法分离培养兔骨髓基质干细胞(MSCs)的条件,为组织工程选择合适的种子细胞奠定基础。方法采用密度梯度离心法将兔MSCs自少量骨髓中分离并培养,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线,测定贴壁率。结果兔MSCs性状稳定,生长曲线相似,第5-6天细胞数目最多;传代后10 h贴壁率高达90%。结论密度梯度离心法是分离兔MSCs的理想方法,MSCs能为未来组织工程提供足量种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、培养的适宜条件。方法:采用密度梯度离心法结合贴壁分离法分离培养大鼠骨髓MSCs,观察其形态,流式细胞仪检测细胞表面标记,MTT法观察不同浓度的胎牛血清(FBS)对MSCs生长曲线的影响及不同代MSCs的生长曲线和细胞贴壁率。结果:大鼠MSCs呈梭形或纺锤形,CD34、CD45表达阴性,CD44表达71.5%、CD166表达83.2%;MSCs用10%的FBS培养,其增殖明显高于用无血清、5%及20%的FBS培养;第1、3、5、10代MSCs的生长曲线及细胞贴壁率无明显差异(P>0.05)。结论:密度梯度离心法结合贴壁分离法适于大鼠MSCs的分离;10%的FBS适合MSCs的培养;早期传代对MSCs的增殖无影响。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及rhEGF对其增殖的影响

目的分离培养大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,并探讨人重组表皮生长因子（rhEGF）对其体外增殖的影响。方法用贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs,传代扩增,将生长良好的传代细胞分为rhEGF组和空白对照组,rhEGF组加20 ngrhEGF和含20%新生牛血清（FBS）的DMEM培养基,对照组只加含20%FBS的DMEM培养基,连续观察细胞形态及生长特性,绘制生长曲线。结果 2、4、6代细胞生长曲线基本相同,细胞倍增时间约34 h,方差分析P〉0.05,三代细胞间无统计学差异。rhEGF组与空白对照组的数值,分别做重复测量方差分析,P〈0.01,差异有统计学意义。结论骨髓MSCs体外稳定扩增,有很强的增殖能力,且rhEGF能促进其增殖。     

克隆化兔骨髓基质干细胞系的建立及其生物学特性研究

目的 建立克隆化兔骨髓基质干细胞（MSC）系，并对其生物学特性进行研究，为组织缺损修复寻找理想的种子细胞提供新的途径。方法 应用密度梯度离心和贴壁分离培养方法，从兔骨髓中获得原代骨髓MSCs，再应用克隆化分离培养技术，建立克隆化扩增的骨髓MSC系。体外传代培养、低温冻存复苏、形态学观察、生长曲线测定、染色体分析和分化潜能鉴定。结果 建立了一株克隆化兔骨髓MSC系。该细胞系在含10％胎牛血清的LG-DMEM中连续传代至第32代，仍保持旺盛的增殖能力，P4和P32代细胞染色体众数保持稳定的二倍体核型，成骨细胞诱导试验阳性。结论 获得一株具有旺盛的增殖能力和分化潜能，遗传性能稳定的克隆化兔骨髓MSC系。     

体外培养的婴幼儿MSCs生物学特性研究

目的探讨体外分离和培养的婴幼儿骨髓间充质干细胞(MSCs)的基本生物学特性. 方法无菌条件下抽取先心病婴幼儿骨髓,经密度梯度离心、接种获得MSCs,观察其形态、贴壁率、克隆形成能力、超微结构和生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标记物.结果体外培养的MSCs 3 ～ 4 h后开始贴壁,贴壁率为65% ～ 80%;2 ～ 3 d可见集落形成,10 d左右融合90%以上,随着传代次数增加, 克隆形成率逐渐降低.透射电镜观察显示体外培养的MSCs具有MSCs典型的超微结构,其表面标记物CD29、CD44、CD71、CD90表达阳性.结论体外分离培养的先心病婴幼儿MSCs生长稳定且增殖较快,可作为体外构建工程化先心病修复材料的种子细胞来源.     

QY1骨髓多能间质干细胞系向心肌细胞和血管内皮细胞分化

目的:探索QY1骨髓多能间质干细胞系在体外向心肌细胞、血管内皮细胞分化的能力;优化骨髓多能间质干细胞向心肌细胞分化的体外适宜诱导条件;并初步探讨骨髓间质干细胞向成心肌成血管细胞分化的能力.方法:分别用5-氮胞苷、血管内皮生长因子对QY1骨髓多能间质干细胞进行定向诱导分化.利用免疫组化、RT-PCR鉴定分化后的细胞.结果:在传代培养至72 h时,加入10 μmol/L5-氮胞苷诱导24 h后换液培养,以后每7 d换液1次,培养14 d进行再次诱导的条件下,细胞能出现自发性搏动的心肌细胞和肌管样结构,诱导率达(39.47±0.56)%.心肌特异性的表面抗体α-横纹肌肌动蛋白、心肌连接蛋白-43表达阳性,RT-PCR检测有心肌特异性因子α-肌球蛋白重链表达.在用血管内皮生长因子诱导48 h后,出现呈直线排列的血管内皮细胞;7 d后,有部分区域细胞相互连接呈血管内皮细胞网状;14 d时免疫组化检测,发现诱导后的细胞血管内皮特异性表面抗体CD31和Ⅷ因子表达阳性.结论:QY1骨髓多能间质干细胞系细胞在体外特定条件下具有分化为心肌细胞和血管内皮细胞的能力.     

Biological features of mesenchymal stem cells from human bone marrow

Objective To study the biological characteristics of mesenchymal stem cells (MSCs) from human bone marrow. Methods A culture of mesenchymal stem cells was initiated from bone marrow low-density mononuclear cells separated by Percoll Centrifugation and maintained in low-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) with 10% selected fetal calf serum. Cell growth pattern and its responses to cytokines were evaluated by trypan blue exclusion and MTT test, respectively. Cell cycle and surface antigenic features were analyzed by flow cytometry technique. Cytochemistry characteristics of MSCs were determined.Results Easy-handling methods to isolate and culture expand MSCs were developed in this study. MSCs were unique in their phenotypes. They were positive for CD29, CD44, CD166, and negative for CD34, CD45, HLA-DR and Ulex europaeus. Cytochemistry evaluation showed that MSCs were homogeneously positive for acid α-naphthl acetate esterase (ANAE), glycogen (periodic acid Schiff reaction, PAS), and negative for acid phosphatase (ACP) and the Sudan black reaction (SB). Around 5% of them were positive for alkaline phosphatase (ALP). The cells had a population doubling time of 30 hours and cell cycle analysis showed that approximately 10% of them were in S phase. MSCs grew at significantly different rates when incubated in the presence of various recombinant human cytokines, of which interferon γ, tumor necrosis factor α, stem cell factor and insulin-like growth factor promoted the proliferation of MSCs dramatically, while others tested had no effects on cell growth. Conclusions MSCs are a homogenous population of cells that have unique growth, phenotypical and cytochemical characteristics. Furthermore, the diverse responses of MSCs to different cytokines provide a clue for the selection of optimal expansion and maintenance of MSCs.     

近交系五指山小型猪骨髓间充质干细胞分离培养及生物特性

目的：建立近交系五指山小型猪(inbreed line miniature pig of Wuzhishan,ILMW)骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)体外分离培养和鉴定方法,比较我国不同种系猪来源BM-MSCs的生物 学特性,为下一步研究BM-MSC对ILMW单侧输尿管梗阻所致肾损伤的修复机制提供细胞来源。方法：选取4月龄及 10月龄健康ILMW各4头,从距髂骨翼边缘1 cm处穿刺,抽出骨髓约5 mL;经密度梯度法分离单个核细胞,分别用含 10%,12%和15%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的完全培养基于体外培养;并取第1代、第3代、第5代、第11代细胞 分别行细胞形态学、表型、分化能力、生长曲线、细胞周期等检测。结果：分离培养的BM-MSCs在体外贴壁,呈成 纤维样或旋涡状生长;原代细胞18 h出现贴壁,第6天进入对数增长期,约9 d后80%融合,传代后细胞状态未出现明显 异常。细胞表面抗原检测显示CD29,CD44,CD90表达呈阳性;CD34和CD45表达呈阴性;且各代间差异无统计学意 义(均P>0.05)。成骨诱导18 d后,茜素红染色阳性;成软骨诱导21 d后,阿利新蓝染色阳性。细胞周期检测显示G0/G1 的细胞百分比约为81.45%。结论：ILMW的BM-MSCs贴壁时间早,细胞增殖活跃,传代周期短,传代后仍能保持稳定 的生物学特性,是中国大陆地区猪来源BM-MSC的最佳选择之一。     

QY1骨髓多能间质干细胞系多向分化潜能的检测

目的:检测QY1骨髓间质干细胞系在体外向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、血管内皮细胞和神经细胞分化的能力.方法:选用第5代QY1骨髓间质干细胞系,分别用成脂培养基、成软骨培养基、成骨培养基、5–氮胞苷、血管内皮生长因子、神经细胞培养液(诱导液1为10mmol/L β-巯基乙醇;诱导液2为2%二甲基亚砜和10-8mol/L地塞米松)对其进行定向诱导分化.采用染色法、免疫组化法、RT-PCR法鉴定分化后的细胞.结果:在成脂培养基培养21d左右出现大量含脂滴的脂肪细胞,苏丹III染色法检测脂肪细胞胞浆呈桔红色.在成软骨培养基培养21d左右有软骨结节形成,阿尔新蓝染色法将软骨结节染为深蓝色.在成骨培养基培养35d左右有凸出的骨结节形成,Von Kossa染色法显示有黑色矿化结节形成.在10μmol/L 5–氮胞苷诱导液中能出现自发性搏动的心肌细胞和肌管样结构,免疫组化法显示心肌特异性的表面抗体α-横纹肌肌动蛋白、心肌连接蛋白-43表达阳性,RT-PCR法检测有心肌特异性因子α-肌球蛋白重链表达.在含有50ng/mL血管内皮生长因子的诱导液中能出现呈直线排列的血管内皮细胞和血管内皮细胞网状结构,免疫组化法显示血管内皮特异性表面抗体CD31和VIII因子表达阳性.神经诱导液1处理组出现神经元,免疫组化法显示胶质纤维酸性蛋白表达阴性,神经元特异性核蛋白表达阳性;神经诱导液2处理组出现神经胶质细胞,免疫组化法显示胶质纤维酸性蛋白表达阳性,神经元特异性核蛋白表达阴性.结论:本研究证实QY1骨髓间质干细胞系细胞具有分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、神经元和神经胶质细胞的潜能,提示QY1骨髓间质干细胞系具有向多个胚层、7个方向分化的多向潜能.     

人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离、培养、鉴定及冻存、复苏

目的：探讨从人脐带华通氏胶（Wharton’s jelly,WJ）中分离、培养、鉴定间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）及其冻存、复苏的方法。方法：采用植块法分离、培养间充质干细胞,流式细胞仪检测P3代细胞免疫表型,鉴定其向成骨、成脂方向诱导分化的能力;将P1细胞冻存6个月后复苏,鉴定复苏后细胞的特性。结果：植块法容易从人脐带华通氏胶中获得间充质干细胞;组织块贴壁后6 d可见组织块周围细胞爬出,原代培养14~18 d细胞融合70%~80%;P3代细胞强烈表达CD73、CD90、CD105,不表达CD14、CD34、CD45、CD79a和HLA-DR;成骨诱导分化后10 d,可见明显钙结节;成脂诱导14 d,有明显的脂滴出现,油红O染色阳性。冻存再复苏细胞活力达80%,细胞免疫表型及成骨、成脂诱导显示与冻存前细胞呈相同的特性。结论：组织块培养法可从人脐带华通氏胶中分离、培养出纯度较高间充质干细胞,冻存、复苏不改变其特性。     

大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性研究

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离和培养扩增的方法。研究MSCs的生物学特性，为利用MSCs作为种子细胞治疗多种疾病提供实验基础。方法通过密度梯度离心、贴壁筛选法分离培养大鼠MSCs，测定其接种贴壁率；在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化，利用MTT法测定MSCs生长曲线；并应用流式细胞术测定细胞周期和表面标记物。结果MSCs体外培养生长状况良好，具有活跃的增殖能力，接种10h后贴壁率为96％以上；细胞周期显示有91．4％处于G0／Gl期；培养的MSCs阳性表达CD29、CD44，阴性表达CD34、CD45。结论在实验条件下，体外培养8代以前的MSCs生长稳定，增殖较快，细胞周期表现出较早期细胞特点，可作为组织工程的种子细胞。     

人骨髓间充质干细胞生物学特性的实验研究

目的建立人骨髓间充质干细胞体外分离、培养体系,并将其向成骨细胞定向诱导分化。方法采用梯度离心法从人骨髓血中提取骨髓间充质干细胞(m esenchym al stem cell,MSC),经体外培养扩增,观察其生物学特性。结果在体外培养条件下,骨髓MSC具有较强的增殖能力,并能被诱导向成骨细胞分化。结论建立了骨髓MSC体外分离、培养的体系,探讨了骨髓MSC的生物学特性,为进一步研究MSC作为骨组织工程的种子细胞打下了基础。     

体外非接触性共培养对MSC向软骨细胞诱导分化的实验观察

目的：探讨骨髓基质干细胞（MSCs）与软骨细胞体外非接触性共培养成软骨的可行性。方法：分离、培养、扩传兔MSCs及软骨细胞，MSCs以1×10^5个/ml接种于共培养板内孔，第1代软骨细胞以1×10^4个/ml接种于共培养板外空板。48h后将内孔插如外孔中，补充全培养基覆盖于MSC细胞层上。以相同密度MSC单独培养为空白对照，观察共培养7d和14d流式细胞仪观察MSC的Ⅱ型胶原蛋白变化情况。结果：实验空白组在7d和14d，Ⅱ型胶原蛋白均阴性表达，符合MSC特性。非接触共培养1周后，Ⅱ型胶原蛋白阳性表达，与空白对照比较，P〈0.01，具有统计学意义；非接触共培养2周后，Ⅱ型胶原蛋白也阳性表达，与空白对照比较，P〈0.01，同样具有统计学意义；实验14d组与实验7d组比较，P〈0.01，具有非常显著性差异。结论：软骨微环境在MSCs成软骨分化及体内软骨形成中具有重要作用，软骨细胞能有效地诱导MSCs向软骨细胞分化并促进MSCs体内软骨形成。     

不同传代倍数成人间充质干细胞成骨分化能力的研究

目的:观察不同传代倍数成人骨髓间充质干细胞(MSC)定向诱导分化为成骨细胞的能力,为自体MSC修复骨组织损伤的临床应用提供部分参数。方法:采用全髓直接接种法分离培养胸科手术取下肋骨骨髓,贴壁细胞达90%以上融合时消化传代。传代细胞部分以1×106/ml的细胞密度接种于含100ml/L胎牛血消(FBS)的L-DMEM的培养基中继续培养,传代;部分在培养基中添加成骨诱导剂地塞米松,β-甘油磷酸钠及抗坏血酸向成骨细胞诱导分化。如此连续传10代。结果:5代以内成人MSC成骨分化能力无显著差异(P>0.05),以第3代最强,第6代后MSC成骨分化能力逐渐减弱。结论:不同代次的MSC诱导分化为成骨细胞的能力不同,6代以后明显减弱。做为组织工程的种子细胞,成人MSC体外培养不宜超过5代。