甲型流感病毒DNA疫苗双表达载体的构建及表达

目的： 构建含有甲型流感病毒M2基因与GM-CSF基因的DNA疫苗双表达载体,为研究甲型通用流感疫苗奠定基础。方法： 将甲型流感病毒（H1N1）接种鸡胚后收获尿囊液,提取流感病毒总RNA,RT-PCR法扩增M2基因;将微小病毒内部核糖体进入位点（IRES）基因插入到质粒pVAXⅠ多克隆位点,再将M2基因和GM-CSF基因依次克隆到IRES的上、下游多克隆位点,构建出甲型流感病毒双表达载体pMIG,酶切鉴定后测序;脂质体法转染COS7细胞并检测目的蛋白的表达。结果： 成功扩增出M2基因（约300 bp）、IRES基因(约580 bp)和GM-CSF基因(约400 bp),酶切鉴定结果表明构建出甲型流感病毒双表达载体pMIG,Western blotting检测证明流感病毒M2蛋白的表达。结论：成功构建出流感病毒DNA疫苗双表达载体pMIG。     

甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及初步表达

目的:构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体。体外转染真核细胞株HEK293细胞并检测目的蛋白的表达。方法:从接种人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增M2基因。通过分子克隆技术将所扩增片段插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)。经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到HEK293细胞中,通过免疫荧光技术鉴定其表达。结果:经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功。免疫荧光技术证实流感病毒M2基因的表达。结论:甲型流感病毒M2蛋白是一种具有高保守性,可形成离子通道并影响流感病毒表面蛋白血凝素(HA)天然构象的形成,被认为是具有交叉免疫保护性的结构蛋白。甲型流感病毒M2基因真核表达质粒的构建及成功表达将为甲型流感病毒基因工程疫苗,通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础。     

B型流感病毒广州株的分离及血凝素基因进化分析

[摘要] 目的 了解B型流感病毒广州分离株的分子流行病学背景和中国大陆地区该病毒的流行情况。方法 从疑似流感患儿身上取样，经荧光定量RT-PCR检测证实为B型流感病毒；应用RT-PCR方法扩增出该株病毒的HA片段，将该片段克隆到T克隆载体测序后进行序列分析；从Genbank中提取中国内地不同时间的HA基因序列和国际代表株序列，应用系统发育分析软件建立HA基因的系统发育树并进行进化分析。结果 软件分析表明广州株HA片段长1 882bp，编码584个氨基酸，新分离的B型流感病毒广州株在分类上属于Yamagata系；从80年代末期开始，中国内地流行的B型流感病毒分别属于Victoria系或者Yamagata系，90年代和00年代同时存在Victoria系和Yamagata系的流行。结论 广州地区07年存在B型流感病毒Yamagata系的流行，中国大陆地区90年代和00年代Victoria系和Yamagata系B型流感病毒的流行比例相当，时间规律不明显。     

两株登革2型病毒E、NS1蛋白基因序列测定及其系统发生分析

目的 :对从登革出血热 (denguehemorrhagicfever ,DHF)病人血清分离到的一株登革 2型病毒 (denguevirustype 2 ,DEN 2B株 )和DEN 2NGC株作E、NS1蛋白部分基因序列测定并进行系统发生树分析 ,了解其变异及分子进化特证。方法 :利用RT PCR法扩增B株和NGC株E、NS1部分基因片段 ,PCR产物直接测序 ;利用DNAssist软件预测其氨基酸序列 ,以及PHYLIP软件的CLUSTAL方法绘制系统发生树。结果 :B株与NGC株E蛋白基因区第 1～ 4 76nt(4 76bp)碱基序列存在 8个位点的差异 ;编码氨基酸存在 4个位置的不同 ;NS1基因区第 5 89～ 1 0 0 …     

多聚酶链反应检测艰难梭菌产毒株

以艰难梭菌A毒素基因非重复片段中的两个寡核苷酸链作引物,扩增306bp,用多聚酶链反应技术扩增31株细菌,结果19株艰难梭菌产毒株均扩增出单一特异的电泳带,而8株艰难梭菌无毒株、2株索氏梭菌和2株大肠杆菌均无特异带出现。将艰难梭菌产毒株的模板DNA从50ng稀释至0.5ng后再进行多聚酶链反应,结果仍可见特异扩增带。说明多聚酶链反应检测艰难梭菌产毒株较之细菌分离培养、细胞毒索测定方法具有快速、简便、特异、敏感的优点,可望用于临床标本的直接检测。     

人副流感病毒广州分离株ZYMgz01全基因组序列测定及分析

目的探讨广州地区副流感病毒的基因组结构和基因型。方法参照GenBank副流感病毒(U51116)全基因组序列设计11对引物,覆盖副流感病毒基因组的全长。以副流感病毒cDNA为模板分段扩增病毒基因组的全长,各片段克隆到T载体上,并进行序列测定和分析。结果人副流感病毒ZYMgz01株全基因组核酸序列为15462bp,提交到GenBank的序列号为EU326526,与3型副流感病毒保守基因同源性为94.0%,具有3型副流感病毒的结构特征。基因组序列同源性比较结果显示,ZHYMgz01株病毒与兰州的LZ22(FJ455842)病毒株的同源性最高,为99.1%;与美国突变病毒株(U51116)同源性为95.1%;与美国病毒株(Z11575)同源性为95.2%;与日本(ABO12132)病毒株的同源性为94.8%,而与加拿大(EU424062)病毒株的同源性为94.8%。系统进化树显示ZHYMgz01病毒株与兰州的LZ22病毒株同属一个进化分支。结论广州地区儿童呼吸道感染的副流感病毒ZHYMgz01全基因组为15462bp,与3型副流感病毒的同源性最高,确定ZHYMgz01是3型副流感病毒。3型副流感病毒系统进化可能与地域差异有一定的关系。     

大鼠海马组织中神经元型一氧化氮合酶基因克隆

目的 :克隆胚胎大鼠海马组织中神经元型一氧化氮合酶 (nNOS)基因。方法 :采用RT -PCR法 ,从胚胎大鼠海马组织mRNA中扩增nNOS基因CDS区片段 ,克隆入T载体 ,筛选阳性克隆、酶切签定并经序列测定。结果 :RT -PCR法扩增出一特异产物与预期长度 2 4 0bp相符 ,DNA序列测序的结果与GenBank的序列 (U6 730 9)比较 ,所克隆的nNOS基因与其中的 2 4 0bp完全相同 ,与nNOS基因 10 0 %同源。结论 :采用RT -PCR和T载体技术获得了胚胎大鼠海马组织中的nNOS基因克隆     

登革病毒1型和2型国内分离株NS1基因的扩增和克隆

登革病毒(DEN)为单链正股RNA病毒,其非结构蛋白NS1在病毒免疫反应中起重要作用。我们在NS1基因序列设计了一对通用引物,扩增序列长度为413bP。应用逆转录—聚合酶链反应成功地扩增了DEN1_-4型部分基因片段,采用该引物扩增国内分离株DEN1(GZ)和DEN2(HN91)同样出现一条特异扩增带,并发现国内分离株扩增产物的电泳迁移率与国际参考株有差别。因此我们应用低融点琼脂糖回收该DNA片段,并将DEN1(GZ)和DEN2((HN91)NS1基因部分片段分别克隆到Puc19质粒载体中。经Pst Ⅰ和Ecor Ⅰ双酶切分析和通用引物PCR鉴定证明重组质粒内含有NS1基因部分片段。并准备进行核苷酸序列分析,以进一步了解其核苷酸的变异与抗原性的关系,为我国登革热的预防和控制提供理论依据。     

广州市A型流感病毒血凝素基因的遗传变异研究

 【目的】 了解2006-2007年广州地区流感的病原学分布,掌握 H1N1亚型流感病毒血凝素基因(HA)的遗传和进化特征。【方法】 选取2006-2007年广州市19个流感监测点的流感病毒代表株共45株,应用病原学、血清学和分子生物学方法对病毒的型别进行了鉴定;选取24株H1N1亚型流感病毒进行全长HA基因的扩增、克隆与分子进化分析。 【结果】 A型流感病毒H1N1和B型流感病毒交替成为广州地区2006年流感的优势流行株;2006-2007年广州地区H1N1亚型流感病毒流行株在HA蛋白的抗原区、受体结合位点和潜在糖基化位点均发生了点突变;遗传进化分析结果表明,24株H1N1亚型毒株间基因同源性的平均值为98.4%;与WHO推荐的疫苗株(New Caledonia/20/1999和Solomon Islands/3/2006)相比,同源性高达96.6%和97.8%。【结论】 2006年,广州地区流感的病原体为H1N1亚型流感病毒和B型流感病毒;2006-2007年广州市H1N1亚型流感病毒HA基因发生了一定程度的变异, 有必要对毒株的变异加强监测;WHO推荐的2006-2007年H1N1亚型流感病毒疫苗株适用于我国人群的免疫预防。     

恶性疟原虫Pf332基因片段的分泌型、非分泌型真核表达重组质粒的构建

目的 构建包含恶性疟原虫Pf332基因片段的分泌型、非分泌型真核表达重组质粒。方法 从FCCl／HN株基因组DNA中PCR扩增P1332基因片段，P332-RO、P332-R1和P332-R2；用PCR扩增法合成鼠IgG轻链信号肽的编码序列。用定向克隆法分别构建分泌型重组质粒pcDNA3-s—P332-R0、pcDNAl-s—P332-R1、pcDNA3-s—P332-R2和非分泌型重组质粒pcDNA3-s—P332-R0、pcDNA3—s—P332-R1、pcDNA3—s—P332-R2。阳性克隆的重组质粒DNA经酶切、PCR扩增及测序鉴定。结果 PCR扩增得到特异的FCCl／HN株P1332基因片段，P332-R0、P332-R1、P332-R1，大小分别为489、429和393bp。用PCR扩增法合成63bp的Balb／c小鼠IgG轻链信号肽的编码序列。酶切、PCR及测序鉴定表明获得了正确的含P1332基因片段的分泌型、非分泌型重组质粒。结论 成功构建分别包含恶性疟原虫P1332基因片段-1332-R0、P332-R1和P332-R2的分泌型、非分泌型真核表达重组质粒。     

流感病毒抗原快速检测与real-time RT PCR的比较

目的介绍一种可同时检测甲型、乙型流感病毒的快速方法,便于及早确诊流感病原体。方法采用快速抗原法对2014年1月—2015年12月收集的632份流感样患者标本进行甲型、乙型流感病毒抗原检测,并对其中102份进行real-time RT PCR检测。结果快速抗原法检测到样本中甲型流感病毒阳性14例,乙型流感病毒阳性10例。real-time RT PCR法检测到甲型流感病毒阳性15例,乙型流感病毒阳性12例。快速抗原法针对甲型流感病毒诊断灵敏度93.3%,特异度100.0%;针对乙型流感病毒,诊断灵敏度83.3%,特异度100.0%,耗时15 min,明显少于real-time RTPCR法的3 h。结论采用快速抗原法可及早筛查甲型、乙型流感标本。     

2009—2012年石嘴山市流行性感冒监测结果分析

目的分析2009—2012年石嘴山市流行性感冒监测结果,了解其流行趋势及病毒优势株的变化,为防控提供科学依据。方法通过流行性感冒监测信息系统计算哨点医院流感样病例就诊比例,并采集病例标本进行病原学检测,通过疾病监测信息报告管理系统统计流感病例报告例数进行综合分析。结果石嘴山市流行性感冒毒株以A型为主,A（H1N1）亚型和A（H3N2）亚型同时存在,交替成为优势株,B型隔年出现,与A型共存。结论应加强流感监测,分析流行性感冒病毒优势毒株,以便预防控制流感的流行。     

2009-2010年度乌鲁木齐市流感哨点监测结果分析

目的对2009-2010年度乌鲁木齐市流行性感冒(流感)监测结果进行分析。方法统计2009-2010年度流感监测哨点医院监测诊室报告的流感样病例(influenza-like illness,ILI)就诊比例,采集流感样病例标本进行流感病原学检测,对监测结果进行整理、分析,并与2006-2008年度数据进行比较。结果流感样病例监测显示,35周ILI%(流感样病例占门诊就诊病例总数的百分比)开始呈波浪式上升,41周(十一长假后)至第44周ILI%开始急骤上升,44周达高峰(17.01%),是近几年最高水平。45周开始ILI%又呈快速连续回落趋势,下降到50周的4.35%。病原学检测显示,哨点医院采集的标1 915份本中,流感病毒阳性511份,阳性率26.68%,其中甲型H1N1阳性396份,占77.50%,H3N2阳性43份,8.41占%,H1N1阳性18份,占3.52%,B型阳性54份,占10.57%。结论在本监测年度乌鲁木齐市发生甲型H1N1暴发流行,高峰出现在44周,较往年提前了8周,进入2010年后则以B型流感病毒流行为主为主。     

广州市某区2008年度流行性感冒的流行情况调查

目的了解广州市某区2008年度流感发病及抗原变异情况,为制定流感防治策略提供科学依据。方法利用流感监测点定期采集的流感样标本,以MDCK细胞分离病毒,并应用红细胞凝集抑制法进行型别鉴定,对流感的病原学以及流感疫情监测情况进行统计分析。结果全年共监测咽拭子763份,分离病毒株80株,其中A（H1N1）型37株,A（H3N2）14株,B（Victoria）23株,B（Yamagata）6株。15岁以下人群发病最多,占流感样病例的65．00％。全年发生流感疫情2起。春季以B（Victofia）为主,夏季以A（H1N1）为主。结论全年广州市某区流感发病呈散发,并以H1N1亚型为主,15岁以下人群为流感高危人群,流感发病高峰出现在3月份和7月份。     

贵州省2010-2011年流行性感冒监测结果分析

目的对贵州省2010-2011年流行性感冒的监测结果进行分析,了解流感的流行趋势,为流感防控提供科学依据。方法对哨点医院就诊的流感样病例(influenza-like illness,ILI)进行流行病学和病原学监测,以及对聚集性发热病例进行监测。结果 2010年哨点医院门诊ILI就诊比例为5.81%,2011年ILI就诊比例为5.91%;2010年和2011年以甲型为优势株,其次是乙型。2010年流感暴发疫情较2011年多,疫情主要集中在学校。结论流感病毒流行优势株逐渐由甲型转为乙型。做好流感监测和预测预报。     

贵州省2008-2009年流行性感冒监测结果分析

目的对贵州省2008-20O9年流行性感冒的监测结果进行分析,了解流感的流行趋势,为流感防控提供科学依据。方法对哨点医院就诊的流感样病例(ILI)进行流行病学和病原学监测,以及对集中发热疫情进行监测。结果 2008年哨点医院门诊ILI就诊比例为2.36%,2009年ILI就诊比例为9.14%;2008年流感病毒以乙型为优势株;2009年以甲型为优势株,尤以甲型H1N1居多。2009年流感暴发疫情较2008年增多,疫情主要集中在学校。结论流感病毒流行优势株由乙型转为甲型,做好流感监测和预测预报。     

云南省2016-2018年流行性感冒监测分析

目的分析2016-2018年云南省流行性感冒(流感)监测结果,探讨云南省流感流行特征,为云南省流感防控提供科学依据。方法利用描述流行病学方法,对2016-2018年云南省19个哨点医院监测到的流感样病例(influenza like illness, ILI)的流行病学特征、病毒分离鉴定结果、暴发疫情信息进行分析。结果 2016-2018年云南省哨点医院ILI占门急诊病例总数的百分比(ILI%)分别为1.38%(60 292/4 381 852)、 1.45%(71 734/4 945 164)和1.31%(66 729/5 078 609),年平均ILI%为1.38%(198 755/14 405 625),3个监测年度ILI%走势基本一致,不同州市、科室ILI报告情况有较大差异。2016-2017年优势株为B型流感病毒Victoria系(BV),占36.15%(355/982),2017-2018年、2018-2019年优势株均为甲型H1N1,分别占42.67%(632/1 481)、70.32%(732/1 041)。2016-2017、2017-2018、2018-2019监测年度毒株分离率分别为4.54%、6.55%、4.87%,差异有统计学意义(χ²=101.49,P<0.001)。5~<15岁患者的毒株分离率较高(7.38%,1 011/13 706)。暴发疫情主要发生在小学(55.71%,39/70)和初中(30.00%,21/70),德宏州、玉溪市、大理州分别占暴发疫情的40.00%(28/70)、17.14%(12/70)、15.71%(11/70),不同年度各州(市)暴发疫情构成比差异无统计学意义。结论 2016-2018年云南省冬春季是流感高发季,优势株由2016年的BV系转为2017-2018年的甲型H1N1型。暴发疫情主要集中在小学和初中,部分州(市)暴发疫情居高不下,提示学校应在流感流行季加强疫情监测和报告,做好流感疫苗接种宣传工作。疫情高发地应做好暴发疫情的调查和处置,认真落实哨点医院监测、实验室检测等各项工作,控制暴发疫情发生。     

小鼠β防御素2、3融合基因载体构建及其抗流感病毒作用

目的构建mBD2与mBD3融合基因的真核表达载体,检测其在MDCK细胞中的表达情况,并探讨其抗病毒特性。方法利用PCR方法分别扩增mBD2与mBD3基因片段,通过重叠延伸PCR技术（SOE—PCR）将mBD2与mBD3通过一段多肽接头Gly4Ser连接为融合基因mBD2与mBD3。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）获得重组质粒pcDNA3．1（＋）／mBD2-mBD3,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,用脂质体转染MDCK细胞,通过免疫荧光检测融合蛋白表达情况,最后采用CCID50测定并分析抗流感病毒作用。结果经鉴定后证实,构建真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／mBD2-mBD3正确,该重组质粒能在MDCK细胞中稳定表达,CCID50实验结果说明有较好的抗流感活性。结论本研究成功构建mBD2-mBD3融合基因的真核表达质粒,并证实其融合蛋白能在MDCK细胞中稳定表达,该结果为进一步研究防御素抗病毒机制奠定了坚实的基础。     

禽流感病毒H7N2血凝素HA1基因在大肠杆菌中的表达

目的　表达H7N2亚型禽流感病毒 (AIV)HA1基因 ,用于感染H7亚型禽流感病毒抗体的检测和HA1蛋白功能研究。方法　采用RT PCR方法对H7N2亚型AIVHA1基因进行扩增 ,将PCR产物克隆于pGEM T Easy载体 ,将该基因插入pGEX 4T 2中构建HA1基因原核表达载体 ,转化BL2 1大肠杆菌后 ,在IPTG诱导下表达HA1蛋白 ,Westernblot鉴定表达HA1蛋白。电洗脱方法纯化表达HA1蛋白 ,建立间接ELISA方法 ,对感染AIVH7、H9、H5亚型AIV阳性血清进行检测。结果　成功克隆H7N2亚型AIV的HA1基因 ,其核苷酸序列长度 96 6bp ,编码 32 2个氨基酸残基。构建HA1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约 6 1× 10 3的HA1融合蛋白。Westernblot和ELISA方法鉴定表明 :表达HA1蛋白与感染H7亚型AIV鸡血清有反应 ,与H5、H9亚型AIV阳性血清没有反应。结论　本研究在大肠杆菌中成功表达了H7N2亚型AIVHA1基因蛋白 ,具有与感染H7亚型AIV阳性血清反应原性 ,不与H5和H9亚型AIV感染阳性血清发生反应。     

2010年石嘴山市流感监测结果分析

目的分析石嘴山市2010年度流感监测结果,了解流感病毒优势株的变化,为流感防控提供科学依据。方法通过流感监测信息系统计算哨点医院流感样病例就诊比例,并采集流感样病例标本进行病原学检测。结果流感样病例就诊比例为0.6%,高峰出现在1月和3月,25~59岁年龄组发病较高,病毒核酸检测阳性率为14.6%,B型最多占53.2%,但不同时期优势型别不同。结论 2010年石嘴山市流感活动相对稳定,1~10月以B型流感病毒为主,11、12月份以季H3型为主。