maspin基因启动区的初步鉴定

目的：研究maspin基因表达的调控机制。方法：利用PCR技术扩增maspin基因5’上游启动区860bp(-765～ 95bp)不同的缺失片段,并将它们分别与荧光素酶(LUC)报告基因相连,构建了6种maspin—LUC报告基因表达质粒,通过转染实验检测maspin启动区不同长度片段在雄激素依赖性前列腺癌细胞(LNCaP)和雄激素非依赖性前列腺癌细胞(PC-3M)中驱动荧光素酶表达的活性：并转染雄激素表达受体(AR)到PC-3M细胞,观察雄激素及其受体对不同片段表达活性的作用。结果：maspin基因启动区(-312～247bp)之间含有与雄激素受体相关的负性调控元件,在( 14～95bp)之间含有一个功能性的中文(Sp1)调控元件一结论：maspin基因的表达受雄激素受体及Sp1的调节。     

姜黄素对前列腺癌LNCaP细胞PSA生成及AR表达的影响

【目的】研究姜黄素对前列腺癌细胞株LNCaP细胞增殖的影响。【方法】化学发光法检测不同浓度的姜黄素处理前列腺癌细胞株LNCaP后前列腺特异抗原(PSA)含量,利用荧光素酶报告基因pGL-3构建含PSA基因5’侧启动子区640 bp DNA的荧光素酶表达载体pGL3-PSA,并将其转染LNCaP细胞,不同浓度姜黄素作用24 h后应用荧光素酶测定系统检测荧光素酶表达活性。用免疫印迹Western-blotting技术检测雄激素受体(AR)的表达。【结果】姜黄素抑制LNCaP细胞培基中PSA蛋白及含PSA启动子的荧光素酶活性的表达;形态学结果显示姜黄素可抑制前列腺癌细胞LNCaP的增殖;Western-blotting技术检测结果显示姜黄素抑制AR的表达,并且对AR表达的抑制程度依赖于姜黄素的浓度。【结论】姜黄素对PSA启动子的影响及PSA蛋白表达的抑制作用是通过抑制雄激素受体(AR)的表达实现的,姜黄素能够抑制前列腺癌细胞LNCaP的增殖。     

小鼠Lrp5基因基本启动子分析

目的：研究小鼠Lrp5基因基本启动子。方法：PCR扩增小鼠Lrp5基因基本启动子序列，构建荧光素酶报告基因表达体系，以PRL—TK为内参照质粒，瞬时转染COS-7细胞，48h后收集细胞测定荧光素酶相对表达活性。结果：在小鼠Lrp5基因基本启动子区域，构建了三种荧光素酶报告基因表达体系pGL3—16(-16bp- 132bp)、pGL3—54(-54bp- 132bp)和pGL3—103(-103bp- 132bp)。pGL3—103表达载体的相对荧光素酶活性最高；pGL3—54的相对荧光素酶活性是pGL3—103表达载体的80％；而pGL3—16相对荧光素酶表达活性急剧下降，与阴性对照pGL3-basic的活性相近，无启动子活性。结论：-54bp--16bp区域内含有小鼠Lrp5基因转录所必需的基本启动子序列，其中三个SP1保守序列是小鼠Lrp5基因基本启动子所必需的。     

三七总皂甙增强人内皮源性一氧化氮合酶基因启动子活性

目的:探讨三七总皂甙(tPNS)对人内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的词控机制。方法:以基因重组技术构建人eNOS基因启动子区(-1--1600bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS-Luc，采用脂质体介导的细胞基因共转染技术将peNOS—Luc、空载体pGL2-Basic和β-半乳糖苷酶表达质粒pCMV-β共转染NIH3T3细胞，用细菌脂多糖(LPS)、tPNS和转移生长因子β1(TGFβ1)等因子分别刺激转染后的NIH3T3细胞，检测并比较荧光素酶／β-半乳糖苷酶活性，以确定LPS、tPNS和TGFβ1对人eNOS基因启动子转录活性的影响。结果：(1)酶切和测序结果均证实重组载体peNOS-Luc构建正确；(2)重组载体peNOS-Luc在NIH3T3细胞中有效表达；(3)在LPS刺激下．人eNOS启动子的转录活性降低，而在tPNS和TGFβ1刺激下，其启动子的转录活性增强，其中，TGFβ1较tPNS所致的转录活性更强。结论：正确构建了人eNOS基因启动子区(-1-1600bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS—Luc；tPNS在NIH3T3细胞中增强人eNOS基因启动子的转录活性。     

IPO8基因启动子的克隆及转录活性分析

目的：克隆IPO8基因5'端非编码序列,探讨其转录活性。方法：应用cDNA 5'末端快速扩增(rapid amplication of cDNA ends,5'CE)方法定位IPO8基因转录起始点;在此基础上针对其5'端非编码区包括转录起始点在 内的–3302 ~ +134区域分段进行PCR扩增,将产物克隆入荧光素酶表达载体pGL3-Basic。经酶切鉴定后,将重组质粒与 内参质粒pRL-TK共转染人骨肉瘤细胞Saos-2,用双荧光素酶活性检测以确定其转录活性。结果：成功确定IPO8基因 转录起始位点,酶切结果证实IPO8基因5'端非编码区6条续减片段正确插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic。重组 质粒转染Saos-2细胞后检测到荧光素酶的高表达(P<0.05)。结论：成功构建具有转录活性的IPO8启动子片段,为进一 步研究IPO8表达调控机制奠定了基础。     

人PSMA基因启动子表达载体pGL3-PSMP的构建

目的：构建含人前列腺特异性膜抗原（prostate specific membrane antigen,PSMA）基因启动子表达载体pGL3-PSMP。方法：PCR扩增人PSMA上游1175bp启动子序列,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic,构建前列腺特异性表达载体pGL3-PSMP,重组子经双酶切、测序鉴定。将构建载体用脂质体转染体外培养的前列腺癌细胞株PC-3M,应用双荧光素酶测定系统检测荧光素酶的表达活性。结果：序列测定表明,克隆获得的1175bp的DNA序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确。含人PSMA基因启动子的报告基因荧光素酶的表达活性显著提高,比pGL3-Basic高10倍多。结论：成功构建了含人PSMA基因启动子的荧光素酶表达载体。     

人Tim-3启动子的克隆及其真核报告质粒的构建

目的克隆人Tim-3基因5′端非编码区处具有启动子活性的片段，构建其真核报告质粒，为进一步研究Tim-3表达调控奠定基础。方法以人基因组DNA为模板，针对人Tim-3启动子5′端非编码区处包括翻译起始点ATG和转录起始点TSS在内的-898～+242片段，设计特异性引物，PCR扩增该片段，命名为Tim-3P2，经双酶切后克隆入pGL3-Basic载体SacⅠ、XhoⅠ位点，构建pGL3-Tim-3P2荧光素酶报告质粒，与内参照pRL-TK用脂质体法瞬时共转染COS-7、RAW264.7和B16细胞系，通过双荧光素酶活性检测确定其启动子活性。结果pGL3-Tim-3P2经PCR、双酶切及DNA测序分析鉴定正确无误；pGL3-Tim-3P2转染RAW264.7和B16细胞（两种细胞均可表达内源性Tim-3）24h和48h，双荧光素酶活性检测显示其启动子相对活性约为pGL3-Basic空载体的2倍；而pGL3-Tim-3P2转染不表达内源性Tim-3的COS-7细胞后检测不到荧光素酶活性。结论成功克隆并构建含有人Tim-3启动子的真核报告质粒，该载体具有特异性Tim-3启动子活性，为进一步研究Tim-3表达调控奠定了基础。     

雌激素上调LRP16基因表达的研究

目的：鉴定LRP16基因的表达调控途径并探讨其可能机制。方法：对LRP16基因进行启动子序列顺式作用元件和信息学角度的SAGE(serial analysis of gene expression)谱分析，提示雌激素对其可能具有转录调控作用。为证实这一作用，构建了LRP16基因启动子序列(2．6kb)调控的荧光素酶报告子(pS0)，并与雌激素受体α和β(ERα，ERβ)真核表达载体共转染COS-7和MCF-7细胞，加入雌二醇(β-E2)培养，lueiferase assay方法测定相对荧光素酶活性。结果：报告子pS0与ERα真核表达载体共转染细胞的相对荧光素酶活性较非共转染组及pS0／ERβ表达载体共转染组显著升高，并且在两种细胞中的升高幅度接近。结论：LRP16是受雌激素调控的一个新识别的靶基因，具体调控途径由雌激素变构激活的ERα直接介导，其临床意义有待进一步研究。     

β1整合素启动子荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的克隆β1整合素(CD29)启动子区基因全长序列,构建并鉴定β1整合素启动子全长序列荧光素酶报告基因载体pGL3-β1。方法以含β1整合素启动子基因全长序列的基因片段(2 735 bp)的重组pGEM-T easy载体为模板,用含有酶切位点的特异性引物扩增出整合素β1启动子基因全长序列1 756 bp,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-basic,构建含正确目的基因的表达载体pGL3-β1,并NheⅠ、XhoⅠ酶切、PCR及测序鉴定;并以该质粒转染人表皮细胞株HaCaT进行活性检测。结果酶切、PCR及序列测定表明,克隆获得的1 756 bp与GenBank DNA序列数据库对比分析序列一致,插入方向正确;且pGL3-β1启动子在人表皮细胞株HaCaT中有明显转录活性。结论成功构建了β1整合素启动子基因全长序列荧光素酶报告基因载体,为下一步研究人β1整合素启动子的活性分析、基因表达调控机制及其信号转导通路等研究奠定基础。     

白血病细胞雄激素受体基因启动子甲基化状态的研究

目的 检测白血病细胞雄激素受体基因启动子区CpG岛甲基化状态情况,初步探讨雄激素受体基因启动子区甲基化与白血病发病机制的可能联系.方法 应用甲基化特异性PCR技术(methylation specific PCR, MSP)检测3种白血病细胞株及15例患者骨髓标本雄激素受体基因甲基化状态.结果 白血病细胞株均出现甲基化和非甲基化带,呈部分甲基化状态,而作为对照的正常人白细胞均只出现非甲基化带.15例白血病患者全部检出甲基化状态. 结论 白血病细胞的雄激素受体基因启动子区存在高甲基化现象,可能为白血病的致病机制分析提供了一个新的方向,提示AR基因启动子CPG岛的甲基化有可能成为白血病的新的参考标记物.     

CLONING PROMOTER OF HUMAN SATBl GENE AND EFFECT OF ATRA AND CoCl_2 ON ITS ACTIVITY

Objective To explore the structure and activity of SATBI promoter in different cells, ATRA and CoCl2 effect on its activity. Methods Using luciferase system to assay the promoter activity of human SATB1 gene, three luciferase reporter vectors were constructed which driven by different regions of 5' untranslated sequence from human SATB1 gene, called pGL3-SP2946-luc, pGL3-SP1718-luc and pGL3-SP751-luc, and transfeted into Jurkat T,K562, U937 and Hela cells transiently using lipofectinamine, the expression activity was detected at different dosage of ATRA and CoCl2 treatment for different time course. Results The reporter gene expression from SATB1 promoter were high activity in U937 cell, moderate in Jurkat T cell, low activity in K562 cell and showed no obvious activity in Hela cell, the reporter gene expression from pGL3-SP751-luc kept on the higher lever in Jurkat T,K562 and U937 cells than the other two vectors. We also found that the repressive effect of CoCl2 on SATBI' s mRNA expression and the relative luciferase expression from pGL3-SP751~luc in U937 cell was down-regulated obviously by ATRA and CoCl2 in the concentration- and time-dependent manners. Conclusion SATB1 promoter drives gene expression with cell-specificity and its core promoter region maybe exist in the - 751 ~ - 9bp of 5' untranslated region of human SATBI gene. Combined with the experiment result we found before that SATB1 was down-regulated by ATRA in U937, the results imply that STAB1 maybe is down-regulated by ATRA and CoCl2 through its promoter in the differentiation of myeloid cell line-U937.     

人细胞表面黏附分子P选择素启动子报告基因的构建及鉴定

目的构建人细胞表面黏附分子P选择素（p-selectin）基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,检测其 转录活性,并应用于筛选药物对其转录活性的影响。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的p-selectin启动子序列并设 计两端引物,扩增人基因组DNA中的p-selectin启动子。用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和p-selectin启 动子后,将p-selectin基因启动子插入到pGL3-basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-pselectin-promoter。将其与内参 质粒pRL-SV40瞬时共转染293F细胞,检测双荧光素酶活性。对不同启动子片段长度的p选择素报告基因进行双荧光素酶的 检测。以炎症因子和药物分组刺激转染了报告基因质粒的293F细胞并检测双荧光素酶活性。结果成功构建p-selectin基因启 动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-pselectin-promoter/ pRL-SV40 组荧光素酶活性为0.8573±0.4703,高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40 组的荧光素酶活性值0.03955±0.05894。 pGL3-1826 bp相比较于pGL3-1092 bp组和pGL3-3738 bp组具有最强的转录活性。炎症因子LPS和TNF-α和药物As2O3均具 有上调pGL3-pselectin-promoter转录活性的作用。结论pGL3-pselectin-promoter在293F细胞中能被转录激活,并验证了炎症 因子对其转录表达的作用,并为药物筛选与评价提供解决方案。     

大鼠Caspase 8基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与IRF-1结合位点的鉴定

目的:构建大鼠Caspase 8基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞(HEK293)中,过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)对Caspase 8基因启动活性的影响?同时,筛选其可能的IRF-1结合位点?方法:采用PCR技术,扩增出大鼠Caspase 8基因启动子序列(-1136~+101 nt),将Caspase 8基因启动子插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中?将Caspase 8基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-Caspase 8-FL)和大鼠野生型IRF-1表达质粒(pcDNA3.1-IRF-1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定IRF-1对Caspase 8基因的启动作用?另用生物信息学软件预测Caspase 8基因启动子上IRF-1潜在的结合位点,并构建Caspase 8基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即pGL3-Caspase 8-1~4)?将上述Caspase 8基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和IRF-1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选IRF-1的结合位点?结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功?将pGL3-Caspase 8-FL和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞发现,Caspase 8基因启动子活性显著增加?而将pGL3-Caspase 8-FL?pGL3-Caspase 8-1~4和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞后证实,pGL3-Caspase 8-4的启动活性显著低于pGL3-Caspase 8-2和pGL3-Caspase 8-3?提示IRF-1可能结合在Caspase 8基因启动子的-336~-136 nt区域?结论:本实验成功构建了大鼠Caspase 8基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-1在Caspase 8基因启动子上的结合区域?     

转录因子MZF1对大鼠RGC32基因启动活性的影响及可能的结合部位

目的 :构建大鼠补体应答基因32(response gene to complement,RGC32)启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察人胚肾细胞(HEK293)过表达髓锌指基因1(myeloid zinc finger gene1,MZF1)对大鼠RGC32基因启动活性的影响。同时,筛选其可能的MZF1结合位点。方法:将RGC32基因启动子全长(-686~-1 nt)插入到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,获得RGC32基因启动子全长荧光素酶报告质粒(p GL3-RGC32-FL)后,再将p GL3-RGC32-FL与本课题组前期构建的大鼠野生型MZF1表达质粒(p IRES2-EGFP-MZF1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,以确定MZF1对RGC32基因的启动作用。另用生物信息学软件预测RGC32基因启动子上转录因子MZF1潜在的结合位点,并据此构建3个RGC32基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3)。将上述RGC32基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒与MZF1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,以筛选MZF1的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,大鼠RGC32基因启动子(全长和各截短)的荧光素酶报告质粒均构建成功。将p GL3-RGC32-FL和p IRES2-EGFPMZF1共转染HEK293细胞发现,RGC32基因启动子活性显著增加。而将p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3分别与p IRES2-EGFP-MZF1共转染HEK293细胞后显示,p GL3-RGC32-3的启动活性显著低于p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1和p GL3-RGC32-2。提示MZF1可能结合在RGC32基因启动子的-286~-86 nt区域。结论 :成功构建了大鼠RGC32基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,证实过表达MZF1可促进RGC32基因的启动,并初步筛查出转录因子MZF1在RGC32基因启动子上可能的结合区域。     

大鼠XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及IRF-1结合位点的鉴定

目的:构建大鼠X染色体连锁的凋亡抑制蛋白相关因子1(X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1,XAF1)基因启动子(全长和截断)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞HEK293中过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)对XAF1基因启动活性的影响,同时,筛选其可能的IRF-1结合位点?方法:采用PCR技术,扩增出大鼠XAF1基因启动子序列(-1497 ~ +166 nt),将XAF1基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中获得pGL3-XAF1-QC,与大鼠野生型IRF-1表达质粒(pcDNA3.1-IRF-1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定IRF-1对XAF1基因的启动作用?同时,应用生物信息学软件预测XAF1基因启动子上IRF-1潜在的结合位点,并构建截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒(pGL3-XAF1-1?pGL3-XAF1-2?pGL3-XAF1-3和pGL3-XAF1-4)?将上述全长和各截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒和IRF-1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选IRF-1的结合位点?结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功?将pGL3-XAF1-QC和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞发现,XAF1基因启动子活性显著增加?而将pGL3-XAF1-QC?pGL3-XAF1(1~4号)和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞后证实,pGL3-XAF1-3的启动活性显著低于pGL3-XAF1-1和pGL3-XAF1-2?提示IRF-1可能结合在大鼠XAF1基因启动子的-337 ~ -47 nt区域?结论:本实验成功构建了大鼠全长及截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-1在XAF1基因启动子上的结合区域,为后续研究奠定了基础?     

肿瘤坏死因子α调控启动子活性促进netrin-1的表达

目的 探讨TNF-α对netrin-1基因表达的影响,并对其调控机制作初步研究。方法 使用RT-PCR和Western blot方法检测TNF-α对netrin-1表达影响。PCR反应克隆出netrin-1启动子序列,构建pGL3-netrin-1-promoter荧光素酶报告基因表达载体。转染HEK-293A细胞检测荧光素酶活性。观察细胞因子TNF-α对netrin-1转录水平的表达调控。结果 首先证实了TNF-α能够上调Netrin-1的表达。其次成功构建pGL3-netrin-1-promoter荧光素酶表达载体,测序正确,然后利用双荧光素酶报告基因系统证实构建的报告基因载体启动子具有活性。发现肿瘤坏死因子TNF-α可以使netrin-1启动子活性显著增加 (P<0.05),TNF-α以剂量和时间依赖方式调节netrin-1启动子的活性。结论 细胞因子TNF-α可能通过调控启动子的活性而调节netrin-1的表达。     

HMGB2启动子报告基因载体的构建、活性验证及与其结合的转录因子的预测

目的: 构建高迁移率族蛋白B2(high mobility group box2,HMGB2)启动子荧光素酶报告基因载体,并对其进行活性验证,预测可能与HMGB2启动子结合的转录因子。方法: 在NCBI Genbank数据库中查询HMGB2基因启动子区域序列,运用PCR扩增HMGB2启动子序列片段,将其克隆至pGL3-Basic载体中,构建重组质粒pGL3-HMGB2-promoter,并通过双酶切和测定核酸序列鉴定。采用虫荧光素酶报告实验验证pGL3-HMGB2-promoter重组质粒的活性,进一步通过在线软件PROMO预测可以与HMGB2启动子序列结合的转录因子。结果： 经限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列比对,证实pGL3-HMGB2-promoter重组质粒构建成功。虫荧光素酶报告实验结果显示,构建的重组质粒具有启动子活性。PROMO在线软件分析结果表明,有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合。 结论： 成功构建了含有HMGB2启动子序列的荧光素酶报告基因重组质粒,该质粒具有启动子活性,且有72个转录因子可能与HMGB2启动子序列结合,促进HMGB2的转录。     

转录因子GATA结合蛋白3对哮喘易感基因ADAM33表达的影响

目的:探讨转录因子GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA3)对解整合素金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase 33,ADAM33)基因启动子活性及mRNA表达的影响.方法:以人正常肺上皮BEAS-2B细胞DNA为模板经PCR扩增得到AD...