利用免疫磁珠分离鉴定miRNA靶基因的方法研究

目的:利用免疫磁珠分离鉴定miRNA靶基因,建立一种经济、有效、快捷的miRNA靶基因鉴定方法.方法:直接提取细胞总RNA后加入生物素标记的miRNA分子共孵育,而后利用免疫磁珠分离与miRNA结合的mRNA,或将生物素标记的miRNA分子瞬时转染HeLa或HepG2细胞,48 h后裂解细胞并在离心后应用链霉亲和素磁珠分离与miRNA特异性结合的mRNA.将分离获得的mRNA反转录获得cDNA,并以其为模板,以特异性引物和Oligo(dT)进行PCR扩增,而后经过克隆测序,通过生物信息学方法比对测序结果,鉴定miRNA的靶基因.结果:利用已知的let-7靶基因证实了上述方法的有效性,并通过该方法鉴定出let-7的一个新的靶基因.结论:建立了免疫磁珠分离鉴定miRNA靶基因方法,为miRNA靶基因的研究提供新的实验学方法.     

肿瘤坏死因子α调控启动子活性促进netrin-1的表达

目的 探讨TNF-α对netrin-1基因表达的影响,并对其调控机制作初步研究。方法 使用RT-PCR和Western blot方法检测TNF-α对netrin-1表达影响。PCR反应克隆出netrin-1启动子序列,构建pGL3-netrin-1-promoter荧光素酶报告基因表达载体。转染HEK-293A细胞检测荧光素酶活性。观察细胞因子TNF-α对netrin-1转录水平的表达调控。结果 首先证实了TNF-α能够上调Netrin-1的表达。其次成功构建pGL3-netrin-1-promoter荧光素酶表达载体,测序正确,然后利用双荧光素酶报告基因系统证实构建的报告基因载体启动子具有活性。发现肿瘤坏死因子TNF-α可以使netrin-1启动子活性显著增加 (P<0.05),TNF-α以剂量和时间依赖方式调节netrin-1启动子的活性。结论 细胞因子TNF-α可能通过调控启动子的活性而调节netrin-1的表达。     

铁代谢与维持性血液透析患者左心室肥厚关系

目的探讨维持性血液透析(MHD)患者铁代谢与左心室肥厚(LVH)的关系。方法回顾性分析北部战区总医院血液净化中心收治的96例MHD患者临床资料。根据铁代谢靶目标将患者分为低铁代谢组(n=31)、铁代谢达标组(n=22)及高铁代谢组(n=43);根据LVH诊断标准将患者分为LVH组(n=63)与左室正常组(n=33)。观察各组基本情况及实验室化验指标。采用Logistic回归分析来分析LVH的危险因素。结果 LVH组患者年龄、收缩压、铁蛋白高于左室正常组,血红蛋白低于左室正常组,两组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。低铁代谢组左心室质量(LVM)、左室心肌质量指数(LVMI)、二尖瓣口舒张早期血流速度/舒张晚期血流速度(E/A)与铁代谢达标组比较,差异有统计学意义(P<0.05);铁代谢达标组LVM、LVMI、E/A与高铁代谢组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Logistic回归分析显示,年龄、血红蛋白水平和铁蛋白水平是LVH的危险因素(P<0.05)。结论 MHD治疗的患者中铁代谢情况与LVH的发生密切相关,临床上应重视铁剂的治疗与铁代谢指标的管理。     

转化生长因子β调控miR-200b-200a-429启动子活性

目的 探讨转化生长因子β（TGF-β）对miR-200b-200a-429簇表达的影响,对其调控机制作初步研究。 方法 使用RT-PCR方法检测TGF-β对人肾小管上皮细胞HK-2 miR-200a、miR-200b和miR-429表达的影响。PCR方法扩增出miR-200b-200a-429簇启动子序列,构建miR-200b-200a-429启动子荧光素酶报告基因表达载体,转染至HK-2细胞,检测其荧光素酶活性。观察TGF-β对miR-200b-200a-429转录的表达调控。 结果 实时定量PCR检测结果显示TGF-β作用细胞24 h后下调了miR-200a、miR-200b和miR-429的表达。成功构建miR-200b-200a-429启动子荧光素酶表达载体,测序正确,然后利用双荧光素酶报告基因系统证实构建的报告基因载体启动子具有活性,发现TGF-β可以抑制miR-200b-200a-429启动子活性（P<0.05）。 结论 TGF-β可以调控miR-200b-200a-429启动子的活性。     

灸神阙穴对雌性大鼠寒凝血瘀模型的实验研究

目的:探讨妇科寒凝血瘀证形成机理和灸神阙穴对其治疗的作用机制.方法:用冰水法刺激健康雌性大鼠诱发寒凝血瘀证的动物模型.采用灸神阙穴作为治疗组,与模型组比较其寒凝血瘀证的改善情况以及血清中超氧化物歧化酶(SOD)及一氧化氮(NO)的含量.结果:灸神阙穴可改善寒凝血瘀证大鼠的情况,治疗组血清中SOD与No含量分别为(101.55±5.06)U/mL、(127.04±22.73)μmol/L,明显的高于模型组SOD(94.35±5.17)U/mL以及NO的含量(94.64±25.72)μmol/L(P＜0.05).结论:妇科寒凝血瘀证时SOD活性和NO含量表现不足,灸神阙穴可以提高血清中SOD活性和NO含量,从而有助于妇科寒凝血瘀证的治疗.     

维持性血液透析患者血清甲状旁腺激素水平与心功能评价的相关性研究

目的 探讨维持性血液透析（MHD）患者全段甲状旁腺激素（iPTH）水平的变化与左心室结构和功能的相关性,评估iPTH对MHD合并心力衰竭早期诊断、治疗及判定预后的临床价值。方法 随机选取沈阳军区总医院血液净化科186名MHD患者。入选标准为：血液透析3次／周,每次4h;年龄在18～75岁;透析年限6个月以上,10年以下;无急性心血管事件。利用放免法检测患者透析前iPTH水平、电化学发光免疫分析法检测透析血浆B型钠尿肽前体（pro—BNP）水平。左心室肥厚（LVH）可由心脏超声检查判断。超声心动图检测患者左心房内径（LAD）、左心室舒张末内径（LVDd）、室间隔厚度（IVST）、左心室后壁厚度（LVPwT）、左心室射血分数（LVEF）等,计算左心室重量（LVM）,左心室心肌重量指数（LVMI）。根据2009年KDIGO指南iPTH水平的目标范围,按iPTH正常参考值上限水平2～9倍为界将患者分为3组,探讨iPTH与MHD患者左心功能的关系。结果 iPTH≥549．9pg／ml组患者的LAD、LVMI、LVDd、IVST、LVPwT显著高于iPTH≤122．2pg／ml,122．2～549．9pg／ml组（P〈0．05）。随着iPTH的增长,患者pro—BNP水平升高,有统计学差异（P〈0．05）。随着iPTH的增长,iPTH与NYHA心功能分级呈正相关,血清iPTH水平与LAD、LVMI、LVDd、LVDs、IVST、LVPwT、左心室收缩功能、pro—BNP呈正相关（P〈0．05）,与LVEF呈负相关（P〈0．05）。结论 MHD患者iPTH水平与左心室功能密切相关,可能成为诊断及评估患者心功能的一个重要标志物。     

残存肾功能对高通量透析患者尿毒症毒素水平的影响

目的：探讨不同残存尿量水平患者接受高通量或低通量透析获益差异。 方法：采用回顾性病例对照设计。选取沈阳军区总医院血液净化中心第一血液透析室维持性血液透析患者。按24小时残存尿量多少分组(尿量<300ml或≥300ml),比较尿毒症毒素水平差异。再按照是否使用高通量透析器进行亚组分析,比较高低通透析对不同残存尿量水平患者的临床指标影响及差异。 结果：对比发现残存尿量较多患者倾向于更低的透析频次(P=0.031),体重指数(P=0.015)显著更高,血清肌酐 (P=0.033)、胱抑素C (P=0.002)、β2微球蛋白 (P=0.000)、铁蛋白(P=0.012)水平显著更低。对于残存尿量较少患者：使用高通量透析器者β2微球蛋白水平(P=0.000)及铁蛋白水平(P=0.043)显著较低,但甲状旁腺激素水平(P=0.023)及体重水平 (P=0.049) 显著较高。对于残存尿量较多患者：使用高低通量透析β2微球蛋白水平(P=0.439)与甲状旁腺激素(P=0.190)水平无显著差异。 结论：使用高通量透析可获得更好的β2微球蛋白清除效果。高通量透析有助于维持更好的体重及体重指数,高通量透析对于不同残存尿量水平患者的生物学效应存在差异。残存尿量较少的患者使用高通量透析获益更多。     

Gαs在肝癌中的表达情况及其高表达对肝癌细胞HepG2的影响

目的:探讨Gαs过表达对人类肝癌细胞HepG2生长、增殖的影响,及Gαs在人类肝癌中的表达情况,寻求有效的治疗靶点.方法:利用QpCR技术检测人类肝癌组织中Gαs基因水平的表达情况;利用Western blot检测人肝癌细胞HepG2及正常肝细胞HL-7702中Gαs蛋白水平的表达;利用脂质体法将Gαs质粒转染HepG2细胞;用MTT检测HepG2细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞周期变化.结果:QPCR 结果显示在基因肝癌组织中Gαs表达高于癌旁组织;Western blot结果显示肝癌细胞中Gαs在蛋白水平表达高于肝正常细胞;Gαs质粒转染HepG2细胞后,Gαs表达增高,细胞增殖加快.结论:Gαs基因表达水平在肝癌组织中高于周围癌旁组织;Gαs的高表达可能与肝癌的发生发展相关联,其高表达促进HepG2细胞的生长与增殖.     

曲古抑菌素A通过上调KLF4表达诱导人子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡

目的:观察组蛋白乙酰基转移酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡的影响,并研究其与Krupell样因子4(Krupell-like factor 4,KLF4)的关系。方法:0、50、100、200、300、500ng/ml TSA作用于Ishikawa细胞24 h,或100 ng/ml TSA作用于Ishikawa细胞0、4、8、12、24、48 h,流式细胞术检测Ishikawa细胞凋亡情况,qRT-PCR检测Ishikawa细胞中KLF4 mRNA的表达情况;将KLF4真核表达载体pcDNA3-KLF4转染Ishikawa细胞,流式细胞术检测Ishikawa细胞凋亡情况。结果:100 ng/ml TSA作用于Ishikawa细胞24 h后,Ishikawa细胞的凋亡率显著高于对照组[(30.6±4.5)%vs(7.53±0.93)%,P<0.05];不同质量浓度TSA处理Ishikawa细胞24 h后或100 ng/ml TSA作用Ishikawa细胞不同时间后,KLF4 mRNA表达水平以剂量依赖和时间依赖方式明显增高(P<0.05);pcDNA3-KLF4转染后Ishikawa细胞凋亡率显著增加[(27.3±2.7)%vs(4.53±1.75)%,P<0.05]。结论:TSA能通过诱导子宫内膜癌Ishikawa细胞中KLF4的表达,促进Ishikawa细胞发生凋亡。