脐血间充质干细胞治疗大鼠脑缺血性损伤的实验研究

目的探讨脐血间充质干细胞(UCB-MSCs)移植对大脑中动脉闭塞(MCAO)模型大鼠神经功能恢复的治疗效果及其作用机制。方法 MCAO模型大鼠随机分为实验组(n=20)和对照组(n=10),实验组大鼠经尾静脉输入经BrdU(5-溴脱氧核苷尿嘧啶)标记的UCB-MSCs,对照组尾静脉注射等量PBS,分别对大鼠神经功能缺损情况进行评分,并测定大鼠梗死灶体积,计数脑组织中BrdU阳性细胞、BrdU/NSE(神经元特异性烯醇化酶)、BrdU/GFAP(胶质纤维酸性蛋白)双阳性细胞。结果移植UCB-MSCs可有效降低MCAO大鼠神经功能缺损评分,减少大鼠脑梗死灶体积,并且实验组大鼠脑缺血区及周围组织中可检测到BrdU阳性细胞,及少量BrdU/NSE、BrdU/GFAP双阳性细胞。结论移植的UCB-MSCs能逐渐向MCAO大鼠脑缺血区及周围迁移,并可分化为神经元细胞及神经胶质细胞,促进脑缺血性大鼠神经功能恢复。     

大鼠胎血间充质干细胞移植对局灶性脑缺血治疗作用的研究

目的：研究大鼠胎血间充质干细胞(MSCs)移植入大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠模型后大鼠神经功能的恢复情况。方法:线栓法建立左侧大鼠MCAO模型,随机分为3组:手术组、MSCs 移植组、生理盐水组。5溴-2脱氧尿核苷(BrdU) 标记的MSCs移植后，采用改良神经功能损伤评分系统(mNSS)评价大鼠神经功能恢复情况；应用免疫组织化学双染技术检测MSCs的存活、迁移及其巢蛋白（Nestin）、胶质纤维酸性蛋白(GFAP) 和神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达。结果:MSCs增殖能力强，并能在体外诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞。MSCs移植后显著提高局灶性脑缺血大鼠神经功能的恢复。移植的MSCs细胞可在大鼠脑组织中存活,并向缺血区域迁移, 有不同比例MSCs 细胞分别表达Nestin、 GFAP、NSE。结论:大鼠胎血中含有MSCs，体外扩增纯化后可促进局灶性脑缺血大鼠神经功能的恢复,移植细胞可在大鼠脑缺血区域中存活、迁移并向星形胶质细胞或神经元分化。     

针刺任脉和督脉对脑缺血大鼠海马星形胶质细胞的影响

目的：研究针刺任脉和督脉经穴对局灶性脑缺血大鼠缺血海马星形胶质细胞的调节作用。方法：100只成年健康雄性wistar大鼠，随机分为假手术（sham）组、模型组、针刺督脉组及针刺任脉和督脉组，sham组10只，其余3组又分别随机分为7d组、14d组和28d组3个亚组，每亚组10只。Wistar大鼠以线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）模型。通过免疫荧光双标法研究各组胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性细胞和胶质纤维酸性蛋白／神经元特异性烯醇化酶（GFAP／NSE）双标细胞的表达。结果：针刺督脉治疗可以下调脑缺血后海马齿状回的GFAP阳性细胞数，同时使GFAP/NSE双标细胞增多；针刺任脉和督脉治疗的GFAP阳性细胞增殖幅度小于针刺督脉组，而GFAP／NSE双标细胞的增殖幅度则大于针刺督脉组。结论：针刺任脉和督脉可抑制脑缺血后海马星形胶质细胞的过度增殖并可促进细胞分化。     

新生大鼠HIBD后海马增殖细胞分化和bFGF的相关性探讨

目的: 观察新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后海马齿状回增殖细胞分化情况,及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 干预对其的影响,探讨实验大鼠的远期行为学变化.方法: 7日龄SD大鼠随机分为假手术组、缺氧缺血组和bFGF干预组,建立HIBD模型(假手术组不予缺氧处理),分别于术后5、10、14、21 d取脑,采用免疫荧光双标记观察大鼠海马齿状回BrdU/MAP-2、BrdU/GFAP阳性细胞表达,并应用Y-迷宫法进行行为学测定.结果: 缺氧缺血组及bFGF干预组BrdU/MAP-2、BrdU/GFAP阳性细胞于术后10、14 d较5 d时有所升高(P＜0.05),21 d下降至5 d时的水平.与假手术组及缺氧缺血组比较,bFGF干预组于HIBD后各个时间点BrdU/MAP-2、BrdU/GFAP阳性细胞均有所增加(P＜0.05).Y-迷宫测试显示bFGF干预组学习记忆能力较缺氧缺血组有所提高(P＜0.05).结论: HIBD后海马齿状回增殖细胞存在分化为神经元及星形胶质细胞的现象,bFGF能够促进HIBD后海马齿状回增殖细胞向神经元及星形胶质细胞分化,并可以改善大鼠后期行为记忆能力.     

电针刺激对脑缺血大鼠神经干细胞分化的影响

目的研究电针刺激对脑缺血大鼠神经干细胞分化的影响。方法制作大鼠大脑中动脉闭塞模型(MCAO),随机分为电针组和模型组。电针组电针刺激"百会"和"风府"穴,模型组不予电针。免疫荧光双标法检测5-溴脱氧尿苷-神经元特异性烯醇化酶(BrdU/NSE)和5-溴脱氧尿苷-胶质纤维酸性蛋白(BrdU/GFAP)阳性细胞的表达。结果两组间BrdU/NSE阳性细胞表达比较差异有显著性(F=1 069.23,P<0.01);组内不同时间BrdU/NSE阳性细胞表达比较差异均有显著性(F=1.90、355.51,P<0.01)。组间BrdU/GFAP阳性细胞表达比较差异有显著性(F=28 100.21,P<0.01);组内不同时间BrdU/GFAP阳性细胞表达比较差异有显著性(F=6.50、90.18,P<0.01)。结论电针刺激能促进脑缺血大鼠NSE和GFAP的表达。     

补阳还五汤对脑缺血大鼠梗死灶周围脑区新生神经细胞增殖、分化及Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的 观察补阳还五汤对脑缺血再灌注大鼠梗死灶周围皮层新生细胞增殖、分化及Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路关键蛋白在新生细胞表达的影响.方法 将SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、补阳还五汤组,每组9只.采用线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型.造模后24 h,补阳还五汤组灌胃补阳还五汤水煎液16.1 g/kg,每日1次,连续给药30 d.于造模后第3天开始腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU),活体标记梗死灶周围皮层新生细胞.分别于造模后第9、15、30天取材.采用免疫荧光双标结合图像分析技术,检测各组大鼠梗死灶周围皮层BrdU阳性细胞、双标BrdU/胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、BrdU/微管相关蛋白2(MAP-2)、BrdU/Wnt、BrdU/β-catenin、BrdU/散乱蛋白(Dishevelled)阳性细胞.结果 补阳还五汤组大鼠脑缺血再灌注9、15、30 d,梗死灶周围皮层BrdU+细胞数均较同时点模型组大鼠增加(P<0.01),双标BrdU+/GFAP+细胞数较模型组减少(P<0.01);缺血再灌注9、15 d,补阳还五汤组大鼠梗死灶周围皮层双标BrdU+/MAP-2+细胞数较模型组增加(P<0.01).与同时点模型组比较,脑缺血再灌注9 d,补阳还五汤组大鼠梗死灶周围皮层双标BrdU+/Wnt+细胞数增加(P<0.05);脑缺血再灌注15 d,补阳还五汤组大鼠梗死灶周围皮层双标BrdU+/Dishevelled+、BrdU+/β-catenin+细胞数增加(P<0.05);脑缺血再灌注30 d,补阳还五汤组大鼠梗死灶周围皮层双标BrdU+/Wnt+、BrdU+/Dishev-elled+、BrdU+/β-catenin+细胞数均增加(P<0.05或P<0.01).结论 补阳还五汤可激活脑缺血再灌注大鼠梗死灶周围皮层组织新生细胞增殖,抑制新生细胞向胶质细胞分化,促进新生细胞向神经元分化,并可增强新生细胞Wnt、β-catenin、Dishevelled蛋白的表达.     

人胚神经干细胞及人脐血干细胞治疗大鼠脑缺血的实验研究

目的:观察人胚神经干细胞(hNSCs)?人脐血干细胞(hUCBCs)治疗脑缺血大鼠的效果及其在缺血大鼠脑内的增殖?分化情况?方法:从自然流产的孕10~13周的人胚脑组织中分离?培养hNSCs;采集足月新生儿脐带血60~100 ml,分离出其中的单个核细胞;治疗前hNSCs?hUCBCs均经5-溴脱氧嘧啶尿苷(BrdU)标记48 h?采用线栓法制作大鼠脑缺血模型,1天后经尾静脉注射未分化的hNSCs?hUCBCs至脑缺血大鼠体内,对治疗后大鼠进行神经损害严重程度评分(NSS),用免疫组化方法观察hNSCs?hUCBCs的存活?迁移?分化状况?结果:从人胚脑中成功培养出hNSCs,培养条件下呈悬浮状态生长,形成神经球;hUCBCs在体外也具有增殖能力?两治疗组大鼠均自治疗后21天起其NSS显著低于对照组(P < 0.05),两治疗组间比较各时间点NSS无显著性差异(P > 0.05)?治疗后14?21?28?35天脑组织切片中均可见BrdU染色阳性细胞,缺血侧明显多于对侧(P < 0.05),治疗后21?28?35天明显多于治疗后14天(P < 0.05);hNSCs组BrdU染色阳性细胞数多于hUCBCs组(P < 0.05);治疗组各时间点脑组织切片中均可见nestin染色阳性细胞;在BrdU阳性细胞群中,hNSCs组73.8%为胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色阳性细胞,16.7%为2,3-环核苷酸磷酸二脂酶(CNPase)染色阳性细胞,9.5%为神经元特异性烯醇化酶(NSE)染色阳性细胞;hUCBCs组74.5%为GFAP染色阳性细胞,15.4%为CNPase染色阳性细胞,10.1%为NSE染色阳性细胞;两组间差异无显著性(P > 0.05)?结论:hNSCs?hUCBCs均具有多分化潜能,受缺血部位微环境信号的影响分化成3种主要类型的神经细胞;静脉注射hNSCs?hUCBCs能有效改善脑梗死大鼠的神经功能评分;除了hNSCs外,hUCBCs也是治疗缺血性脑血管病的一种可能手段?     

大鼠永久性脑缺血后脑内Nestin的表达变化

目的 研究永久性脑缺血大鼠脑内巢蛋白（neuro epithelial stem cell prote,Nestin）的表达变化,探讨脑缺血后神经干细胞的增生、迁移和分化规律。方法 采用微创开颅法复制大鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型,分为正常对照组、假手术组和脑缺血组;假手术组和脑缺血组又分为术后1d、2d、3d、1周、2周、3周和4周共7个亚组,抗Nestin抗体和抗Nestin/胶纸原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）抗体分别进行免疫组化单标和免疫荧光双标染色。结果 正常对照组和假手术组仅在部分血管内皮、侧脑室室管膜下区（subventricular zone,SVZ）及第三脑室周围见极少量的Nestin阳性表达,阳性细胞呈椭圆形或不规则形,体积小,突起短少。脑缺血后Nestin阳性细胞明显增多,体积变大,呈多突起的星形,且大部分阳性细胞与星形胶质细胞的标志物GFAP共表达;增生的阳性细胞从缺血侧SVZ梯度式迁往梗死灶边缘,于缺血后3d达到增生高峰,之后增生能力逐渐下降,缺血后2周,缺血侧SVZ的Nestin阳性细胞数及吸光度值已回落到正常水平;缺血4周后,梗死灶周围的阳性细胞也基本消失。结论 大鼠永久性脑缺血后激活了SVZ的Nestin阳性细胞一过性增生、迁往梗死灶周围并分化为星形胶质细胞,可能对缺血损伤后的脑组织起到修复作用。     

大鼠骨髓间质干细胞脑内移植后分化行为的观察

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)植入大鼠脑内后,在脑微环境作用下的分化行为.方法:梯度离心法分离、培养、纯化MSC,Hoechst33342标记后植入大鼠海马CA4区;1,2,4周后处死大鼠取脑,制作冷冻切片;观察Hoechst33342阳性细胞,免疫荧光法CY3显示神经元特异性烯醇酶(neurone specific enolase, NSE)、神经巢蛋白(nestin)、神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、神经生长因子(nerve growth factor, NGF)阳性表达细胞.结果:MSC植入后可见大量细胞存活,沿针道、注射区向周围散在分布,植入细胞有呈红色荧光的NSE,nestin,GFAP及NGF阳性表达细胞.结论:MSC植入动物脑内后能够存活,并分化为神经系统样细胞,表达功能产物NSE、nestin、GFAP及NGF.     

脑栓通对脑缺血再灌注大鼠神经血管单元的保护作用

目的：观察中药脑栓通对脑缺血再灌注大鼠神经血管单元主要成分神经元、星形胶质细胞以及脑血管内皮细胞的保护作用。方法：30只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组和1g/（kg·d）脑栓通组。采用大脑中动脉线栓法建立局灶性脑缺血损伤模型,1.5h后拔出线栓实施再灌注。再灌注24h时后进行大鼠神经功能缺损评分,采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷原位末端标记法结合神经元核抗原、胶质纤维酸性蛋白及CD31免疫荧光双染检测缺血再灌注24h时缺血灶周边的神经元、星形胶质细胞以及脑血管内皮细胞的凋亡情况。结果：脑栓通能显著改善脑缺血损伤大鼠的神经功能缺损,减少缺血灶周边星形胶质细胞、脑血管内皮细胞和神经元的凋亡。结论：脑栓通通过保护脑缺血再灌注后大鼠的神经血管单元促进神经功能的改善。     

转染脑源性神经营养因子的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑缺血损伤的实验研究

目的： 探讨移植转染脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)基因的大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在宿主脑缺血区的基因表达情况,以及对神经损伤的修复作用。方法： 将pcDNA 3.1-BDNF转染到大鼠MSCs中,并检测其表达情况。建立大鼠大脑中动脉梗塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,并将大鼠随机分成对照组、PBS移植组、MSCs移植组和转基因MSCs移植组,每组均8只。将PBS悬液、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)标记的MSCs悬液、BrdU标记的转基因MSCs悬液分别移植到PBS移植组,MSCs移植组和转基因MSCs移植组大鼠的纹状体缺血区半暗带,对照组不移植。移植后1～30 d对各组大鼠进行神经损害严重程度评分(neurological severity score, NSS)并相互比较。移植后30 d,检测各组大鼠脑缺血区BDNF、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolasw,NSE)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达情况。结果： 大鼠脑缺血区移植转基因MSCs 24 h后,检测到BDNF的表达。移植后1 d各组NSS评分无显著差异,移植后7、14、21、30 d均显示转基因MSCs移植组低于其他组。移植后30 d, 转基因MSCs组BDNF阳性细胞数较MSCs组明显增多;NSE、GFAP阳性细胞数较其他组显著增多。结论： 大鼠脑缺血区移植转基因MSCs后表达基因产物,同时其表达的NSE、GFAP蛋白增加,对宿主的神经损伤具有修复作用。转染BDNF基因的MSCs移植是治疗脑缺血性疾病的可行途径。     

转基因神经干细胞移植治疗暂时性脑缺血的实验研究

目的探讨转染血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因的神经干细胞在宿主缺血区的基因表达情况,以及对神经功能的保护作用.方法用脂质体介导法将VEGF121基因转染到大鼠神经干细胞中.经RT-PCR及免疫荧光染色检测转基因神经干细胞及其分化细胞的基因表达情况.建立大鼠大脑中动脉梗塞模型(tMCAO),并将其随机分成(1)对照组,(2)细胞悬液PBS移植组,(3)神经干细胞移植组,(4)转基因神经干细胞移植组,前3组每组10只大鼠,第4组20只大鼠.立体定向法将BrdU标记的转基因神经干细胞移植到tMCAO大鼠的纹状体缺血半暗区.移植后2～12周进行神经损害严重程度评分(NSS)并与其他3组比较.用免疫荧光染色方法观察移植后1周转基因神经干细胞在脑内的基因表达情况和移植后12周转基因神经干细胞在脑内的分化、迁徙情况.结果转基因神经干细胞及其分化的子代细胞均有VEGF121的表达并持续2周左右.移植后2、4、6、8、10、12周(4)组大鼠的NSS评分分别为5.8±1.5、5.0±1.0、4.6±1.0、4.0±0.7、4.0±1.0、3.8±0.4,均低于其他3组.其中第8周显著低于(1)、(2)组(均P=0.008),第12周显著低于(1)、(2)、(3)组(均P=0.000).转基因神经干细胞移植后1周在宿主脑内迁徙并表达VEGF基因产物,移植后12周在宿主脑内存活、迁徙,部分分化成神经元.结论转染VEGF基因的神经干细胞移植后在缺血早期表达基因产物,并对宿主局部血管和神经结构具有保护作用.转基因神经干细胞移植是治疗脑缺血性疾病的可行途径.     

神经干细胞和神经生长因子联合移植对大脑中动脉阻塞大鼠的影响

目的 将神经干细胞(NSCs)移植和神经生长因子(NGF)单独及联合应用于大脑中动脉阻塞(MCAo)模型大鼠,观察NGF和NSCs移植对大鼠缺血性脑卒中神经功能恢复的作用及NGF对自体和移植NSCs的影响.方法 体外分离、培养新生大鼠海马NSCs,BrdU标记.实验动物随机分为A组(MCAo组)、B组(MCAo NGF组)、C组(MCAo NSCs组)及D组(MCAo NGF NSCs组),每组16只,移植后进行神经功能损害评分(NSS),用免疫组化行BrdU、槽蛋白检测,分析结果.结果 移植后的2周、4周神经功能评分显示D组显著好于其他3组(P<0.05),B组与C组显著好于A组(P<0.05).B组的槽蛋白及BrdU阳性细胞数最著多于A组(P<0.05),D组的BrdU阳性细胞数显著多于C组(P<0.05).结论 NSCs移植和NGF单独及联合应用对MCAo大鼠的神经功能恢复均有作用,二者联合具有协同作用.NGF对自体NSCs的激活、增殖有促进作用,对移植NSCs的增殖有促进作用.     

局灶性脑缺血后室管膜/室下区细胞迁移到梗塞区周围并分化为神经元和星形胶质细胞

目的研究局灶性脑缺血后室管膜/室下区细胞的迁移分化,揭示梗塞区周围新生细胞的来源.方法大脑中动脉阻塞前,将10μl 0.2%的荧光染料DiI注射于体质量250～350 g的雄性SD大鼠侧脑室以预标记室管膜/室下区细胞.脑缺血后,采用累积式的BrdU标记方法标记新生细胞并通过双重免疫荧光染色确定细胞分化.标记的细胞通过激光共聚焦显微镜观察.结果在非缺血对照大鼠,DiI标记细胞定居于室管膜/室下区.局灶性脑缺血后,DiI标记细胞出现于胼胝体,邻近的纹状体和皮质.此外,缺血14 d后,梗塞区周围纹状体和皮质内可见一些DiI/BrdU/GFAP或DiI/BrdU/NeuN三重标记阳性细胞.结论局灶性脑缺血后,室管膜/室下区细胞迁移到梗塞区周围并分化成神经元和星形胶质细胞,这一发现对于理解成体神经干细胞的起源和开发促进脑损伤后内源性神经发生的新措施具有重要意义.     

局灶性脑缺血后室管膜 /室下区细胞迁移到梗塞区周围并分化为神经元和星形胶质细胞

目的 研究局灶性脑缺血后室管膜/室下区细胞的迁移分化,揭示梗塞区周围新生细胞的来源。方法 大脑中动脉阻塞前,将10μl0.2%的荧光染料DiI注射于体质量250~350g的雄性SD大鼠侧脑室以预标记室管膜/室下区细胞。脑缺血后,采用累积式的BrdU标记方法标记新生细胞并通过双重免疫荧光染色确定细胞分化。标记的细胞通过激光共聚焦显微镜观察。结果 在非缺血对照大鼠,DiI标记细胞定居于室管膜/室下区。局灶性脑缺血后,DiI标记细胞出现于胼胝体,邻近的纹状体和皮质。此外,缺血14d后,梗塞区周围纹状体和皮质内可见一些DiI/BrdU/GFAP或DiI/BrdU/NeuN三重标记阳性细胞。结论 局灶性脑缺血后,室管膜/室下区细胞迁移到梗塞区周围并分化成神经元和星形胶质细胞,这一发现对于理解成体神经干细胞的起源和开发促进脑损伤后内源性神经发生的新措施具有重要意义。     

银杏内酯B对局灶性脑缺血时星形胶质细胞GFAP表达的影响

目的 观察血小板活化因子(PAF)受体拮抗剂银杏内酯B(GB)对局灶性脑缺血时星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响,并探讨其作用机制.方法 建立光化学诱导树局灶性脑缺血模型,用HE染色和电镜技术观察缺血后不同时间脑组织星形胶质细胞的形态学改变;用免疫组织化学法观察脑缺血后4 h、24 h、72 h及给予GB后24 h半暗区及对侧皮层星形胶质细胞GFAP的表达,并测定其平均灰度值.结果 光镜下可见,HE染色显示树局灶性脑缺血后,随缺血时间延长,星形胶质细胞形态有不同程度改变;电镜观察显示缺血24 h时星形胶质细胞明显肿胀.免疫组织化学染色可见,半暗区星形胶质细胞GFAP表达在4 h时没有明显改变, 24 h时增加 (P＜0.01),72 h时仍维持在较高水平(P＜0.01);对侧皮层星形胶质细胞GFAP表达于72 h时开始增加(P＜0.05).缺血后6 h舌下静脉注射GB至缺血24 h时,星形胶质细胞GFAP表达少于缺血组(P＜0.05),但仍较假手术组高.结论 脑缺血后星形胶质细胞GFAP表达增强,GB可通过减少星形胶质细胞GFAP的表达而起脑保护作用.