家蝇胚胎细胞抗菌蛋白对人髓样白血病细胞K562抑制作用的研究

目的研究家蝇胚胎细胞MDEC-07114抗菌蛋白对人髓样白血病细胞K562的抑制作用。方法利用脂多糖诱导家蝇胚胎细胞MDEC-07114,提取抗菌蛋白,配制成40、80、160、320和640μg/ml 5个实验组,同时以人脐静脉血管内皮细胞作为正常对照组。采用MTT法测定不同浓度抗菌蛋白对人髓样白血病细胞K562和人脐静脉血管内皮细胞的抑制作用,流式细胞术观察5种浓度抗菌蛋白对人髓样白血病细胞K562细胞周期及凋亡的影响。结果①MTT显示5种浓度抗菌蛋白对K562细胞均有明显的抑制作用,而对人脐静脉血管内皮细胞无抑制作用。②流式细胞术显示对K562细胞S期的影响与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。各浓度组均可引起K562细胞的G0/G1期百分比上升,细胞增殖指数PI降低。与阴性对照组相比,各浓度组引起的K562细胞细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。结论家蝇胚胎细胞抗菌蛋白对肿瘤细胞具有明显的抑制作用,而对人体正常细胞无抑制作用。家蝇胚胎细胞抗菌蛋白可阻滞K562细胞周期的正常发育。     

家蝇胚胎细胞抗菌蛋白对肿瘤细胞A375抑制作用的研究

目的:研究家蝇胚胎抗菌蛋白对肿瘤细胞A375生长的抑制作用。方法:利用脂多糖诱导家蝇胚胎细胞提取抗菌蛋白,将提取的抗菌蛋白用PBS配制成40、80、160、320及640μg/mL 5个浓度组,做黑色素瘤细胞A375的MTT实验,实验组采用等量PBS,观察家蝇胚胎细胞抗菌蛋白对A375的抑制作用,以人脐静脉血管内皮细胞作为正常对照组。结果:MTT检测显示五种浓度抗菌蛋白对A375均有抑制作用,与阴性组相比P<0.05,差异有显著性。各浓度组对人脐静脉血管内皮细胞无抑制作用,与阴性组相比P>0.05,差异无显著性。结论:家蝇胚胎细胞抗菌蛋白对肿瘤细胞A375具有明显抑制作用,而对正常人体细胞无抑制。     

刺五加多糖对人白血病K562细胞作用的研究

目的：研究刺五加多糖对体外培养人白血病K562细胞有无增殖抑制和凋亡诱导作用。方法：取培养至对数生长期的K562细胞（密度为5×10^4／mL和1×10^4／mL）分别接种于96孔培养板（100μL／孔）及50mL培养瓶（1．5mL／瓶）中。加入不同浓度的刺五加多糖作用24h后。用CCK-8法检测刺五加多糖对K562细胞增殖抑制作用；荧光显微镜检测细胞凋亡。结果：不同浓度刺五加多糖（0．405、0．810、1．620、2．430、3．240mg／mL）作用K562细胞24h．抑制率分别为16％、27％、48％、50％、55％；荧光显微镜下观察发现培养K562细胞中出现核固缩、凋亡小体。结论：刺五加多糖对体外培养K562细胞生长有明显的抑制作用．可诱导K562细胞凋亡。     

血管内皮生长因子及其Flt-1受体在白血病细胞中的表达

目的探讨人白血病细胞系血管内皮生长因子(VEGF)及其Fh-1受体的表达,进一步阐明VEGF在白血病细胞异常增殖中的作用机制.方法以人脐静脉血管内皮细胞系ECV304作为对照,采用RT-PCR半定量技术和免疫组化检测体外培养的人白血病细胞系K562和HL-60中VEGF及Flt-1的表达.采用MTT试验观察VEGF反义寡核苷酸(VEGF-AS)对白血病细胞体外增殖的影响.结果K562和HL-60细胞同时表达VEGF和Fh-1 mRNA和蛋白.VEGF-AS能够抑制白血病细胞体外增殖.结论在白血病细胞异常增殖中自分泌VEGF可能起着重要作用.     

人红白血病细胞株K562上清液对人脐静脉内皮细胞的促增殖作用

目的研究人红白血病细胞株（K562）上清液对人脐静脉内皮细胞（hUVEC）增殖能力的影响。方法以hUVEC与K562细胞共培养为K562细胞组,以hUVEC加K562细胞上清液为K562细胞上清液组,以单独培养hUVEC为对照组。采用RT-PCR技术检测各组中hUVEC周期蛋白E（cyclinE）mRNA及周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）mRNA的表达情况。结果K562细胞组、K562细胞上清液组中hUVEC cyclinE mRNA及CDK2mRNA表达明显增加,与对照组相比差异均有显著性（P〈0.01）。结论人白血病肿瘤细胞K562上清液能够促进hUVEC的分裂增殖。     

高三尖杉酯碱诱导K562和CML细胞凋亡及分化的实验研究

目的 明确三尖杉酯碱（HHT）治疗慢性粒细胞性白血病（CML）的机理。方法 应用细胞长曲线、克隆形成能力、细胞内血红蛋白含量测定、细胞形态,结合DNA凝胶电泳、流式细胞仪等方法,观察HHT对K562细胞株及CML慢性期细胞的作用方式。进一步用RT－PCR方法研究bcr-abl、c-myc 、max基因在转录水平的改变。结果 低浓度HHT抑制K562细胞的克隆形成能力并使K562细胞内血红蛋白含量增加;0.1umol /L 及以上浓度HHT可诱导K562细胞及CML细胞凋亡;细胞周期分析发现细胞阻滞于G1期。c-myc基因在加药24h开始下凋; bcr-abl和max基基的表达未见明显改变。结论 低浓度HHT可抑制K562 细胞增殖并诱导其向红系分化;超过一定“ 阈浓度”HHT可诱导K562细胞和CML慢性期细胞凋亡;HHT可通过抑制c-myc/max 表达来阻 滞细胞周期。     

抗原致敏树突状细胞诱导CTL杀伤K562细胞体外实验研究

目的 研究体外负载K562细胞冻融抗原的树突状细胞（DC）诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的特异性杀伤作用。方法 联合应用细胞因子从外周血单个核细胞（PBMC）诱导培养出DC,在体外负载K562细胞冻融抗原。采用乳酸脱氢酶释放法,对比K562冻融抗原致敏DC组、未致敏DC组、淋巴细胞组、前列腺癌PC3冻融抗原致敏DC组分别激活的CTL对K562细胞的杀伤作用。结果 培养出具有典型特征的DC;在效靶比为10：1及20：1时。K562冻融抗原致敏DC组诱导的CTL对K562细胞的杀伤率分别为55．9％土22．0％、90．2％＋24．8％,均高于其他3组（p,0．05）。结论 K562细胞冻融抗原致敏DC可诱导激活CTL,具有明显杀伤K562细胞作用。并具有特异性。     

shRNA抑制survivin基因表达对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

目的：研究靶向存活素（survivin）的短发夹 RNA真核表达质粒（shRNA）对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响。方法合成靶向survivin的shRNA真核表达质粒及阴性对照质粒,用脂质体法将质粒转染至经 VEGF（50 ng／mL）处理的HUVEC细胞;转染48 h后,采用实时定量聚合酶链反应（PCR）和蛋白印迹法检测 HUVEC中survivin的mRNA表达及蛋白水平。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖;TUNEL 法检测细胞凋亡。结果（1）survivin‐shRNA 质粒试验组与阴性对照shRNA质粒组及空白对照组比较,转染48 h后人脐静脉血管内皮细胞survivin的mRNA及蛋白表达水平明显下降（P＜0．05）。（2）与阴性对照shRNA组及空白对照组比较,转染后的人脐静脉血管内皮细胞增殖能力明显下降。转染后24、48、72 h生长抑制率分别为（13．53±3．91）％、（38．97±1．82）％、（65．75±1．83）％,于转染后72 h最为显著。（3）试验组凋亡率为（28．07±1．71）％,较阴性对照组（11．45±1．52）％和空白对照组（10．04±1．46）％显著增高（P＜0．05）。结论靶向survivin的shRNA质粒能通过下调survivin表达,进而抑制人脐静脉血管内皮细胞增殖并促进其凋亡。     

依硫磷酸对人慢性髓细胞白血病K562细胞系增殖的抑制作用

目的观察依硫磷酸对人慢性髓细胞白血病K562细胞系增殖的抑制作用。方法将依硫磷酸（粉末）以1640培养液稀释成0.2mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1.0mg/ml、1.6mg/ml、3.2mg/ml共6个浓度组,分别处理增殖期人慢性髓细胞白血病K562细胞,镜下观察不同时间点各浓度组细胞生长情况,应用CCK-8法检测细胞增殖能力,绘制生长曲线,计算抑制率和半数抑制浓度（IC50）。结果依硫磷酸对K562细胞增殖具有抑制作用,细胞倍增时间为48h,并且具有时间和剂量依赖性。在给药48h〉0.75mg/ml浓度的依硫磷酸对K562细胞增殖具有抑制作用（P〈0.05）,而3.2mg/ml浓度的依硫磷酸与K562细胞培养72h后对其增殖抑制作用最强,抑制率为91%。结论依硫磷酸对K562细胞增殖具有抑制作用,为临床应用依硫磷酸治疗慢性髓细胞白血病提供了实验基础。     

脂质体方法转染人骨髓基质细胞的影响因素

目的探讨用脂质体介导的方法转染人骨髓基质细胞的影响因素。方法构建真核表达载体pcDNA3-sFlt-1D4，脂质体方法转染人骨髓基质细胞，流式细胞仪检测转染率，ELISA、MTT法检测转基因蛋白sFlt-1D4的浓度及功能。结果转染率为9．27％。ELISA法检测转染后24、48h及4周转基因骨髓基质细胞培养上清中sFlt-1D4蛋白的表达浓度分别为（0．104±0．078）μg／L、（0．158±0．022）μg／L和（0．171±0．069）μ5／L。ELISA法证实转基因组培养上清中血管内皮生长因子（VEGF）含量降低。MTr法证实转染24、48h及4周的转基因产物对K562细胞的抑瘤率分别为（9．41±4．71）％、（23．63±7．50）％和（33．13±6．93）％。结论血清、细胞铺板密度、转染后细胞筛选的方式等是影响转染质量的主要因素。转基因方法可以获得sFlt-1D4蛋白的表达，转基因蛋白具有抑制K562细胞生长的作用。     

人胚神经干细胞及人脐血干细胞治疗大鼠脑缺血的实验研究

目的:观察人胚神经干细胞(hNSCs)?人脐血干细胞(hUCBCs)治疗脑缺血大鼠的效果及其在缺血大鼠脑内的增殖?分化情况?方法:从自然流产的孕10~13周的人胚脑组织中分离?培养hNSCs;采集足月新生儿脐带血60~100 ml,分离出其中的单个核细胞;治疗前hNSCs?hUCBCs均经5-溴脱氧嘧啶尿苷(BrdU)标记48 h?采用线栓法制作大鼠脑缺血模型,1天后经尾静脉注射未分化的hNSCs?hUCBCs至脑缺血大鼠体内,对治疗后大鼠进行神经损害严重程度评分(NSS),用免疫组化方法观察hNSCs?hUCBCs的存活?迁移?分化状况?结果:从人胚脑中成功培养出hNSCs,培养条件下呈悬浮状态生长,形成神经球;hUCBCs在体外也具有增殖能力?两治疗组大鼠均自治疗后21天起其NSS显著低于对照组(P < 0.05),两治疗组间比较各时间点NSS无显著性差异(P > 0.05)?治疗后14?21?28?35天脑组织切片中均可见BrdU染色阳性细胞,缺血侧明显多于对侧(P < 0.05),治疗后21?28?35天明显多于治疗后14天(P < 0.05);hNSCs组BrdU染色阳性细胞数多于hUCBCs组(P < 0.05);治疗组各时间点脑组织切片中均可见nestin染色阳性细胞;在BrdU阳性细胞群中,hNSCs组73.8%为胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色阳性细胞,16.7%为2,3-环核苷酸磷酸二脂酶(CNPase)染色阳性细胞,9.5%为神经元特异性烯醇化酶(NSE)染色阳性细胞;hUCBCs组74.5%为GFAP染色阳性细胞,15.4%为CNPase染色阳性细胞,10.1%为NSE染色阳性细胞;两组间差异无显著性(P > 0.05)?结论:hNSCs?hUCBCs均具有多分化潜能,受缺血部位微环境信号的影响分化成3种主要类型的神经细胞;静脉注射hNSCs?hUCBCs能有效改善脑梗死大鼠的神经功能评分;除了hNSCs外,hUCBCs也是治疗缺血性脑血管病的一种可能手段?     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

巨细胞病毒诱导体外人血管内皮细胞凋亡的实验研究

目的探讨HCMV感染对体外培养人血管内皮细胞凋亡的影响。方法建立HCMV-AD169株感染体外培养人脐静脉血管内皮细胞模型,应用AV/PI双染法检测HCMV感染后ECs的凋亡变化。结果体外情况下HCMV感染后不同时相点(12、24、48、72h),ECs的凋亡率分别为(10.6±4.6)%,(23.8±6.9)%,(39.4±8.9)%,(31.4±7.8)%,明显高于对照组细胞。结论HCMV感染诱导ECs凋亡的异常改变可能参与了动脉粥样硬化的发生发展。     

Targeted induction of differentiation of human bone mesenchymal stem cells into neuron-like cells

A systematic method of isolating and culturing human bone mesenchymal stem cells （hMSCs）, and inducing them to differentiate into neuron-like cells in vitro was established. The hMSCs were isolated from bone marrow with the lymphocyte-separating medium, cultured and expanded in vitro, and induced after addition of compound neuro-revulsants. The morphological changes of hMSCs were observed, and the expression of surface markers in induced hMSCs was immunocytochemically identified during induction period. The hMSCs could be separated, cultured and expanded in vitro. After induction by compound neuro-revulsants for 48 h, the changes of neuron-like cells, such as cellular shrinkage and neurite growth, were observed in some cells. The immunochemical staining revealed nestin （＋） or NF （＋）, and GFAP （-）. It was concluded that hMSCs were successfully cultured and induced to differentiate into neuron-like cells.     

体外直接诱导人胚胎干细胞向神经细胞分化的研究

目的探讨体外直接诱导HSF6人胚胎干细胞(humanem bryonic stem cells,hESCs)分化为神经细胞的方法。方法采用直接的方法,在1%血清培养条件下,顺序添加bFGF、RA和Forskolin,诱导HSF6人ESCs分化为神经细胞。结果细胞发生神经样形态学改变,免疫荧光细胞化学分析结果显示,分化细胞表达神经干细胞特异性标志分子——巢蛋白(nestin),以及神经元标志分子——β微管蛋白Ⅲ(neuron-specific class Ⅲ beta-tubulin,TuJ1)。实验组nestin阳性细胞数占(95.2±3.03)%,明显高于未添加诱导因子组的(31.6±4.93)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论本研究直接诱导hESCs分化为神经细胞,减少了常规经胚胎体(embryoid body,EB)的诱导方法而产生其它胚层细胞的机会,为进一步探索hESCs源性神经细胞的功能,以及为细胞替代治疗提供高纯度的hESCs源性神经细胞奠定了基础。     

三种成体干细胞对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症状态的影响

目的比较人羊膜上皮细胞（（human amniotic epithelial cell, H-AEC））、羊膜间充质细胞（human amniotic mesenchymal
cell, HA-MSC）和脐带间充质细胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSC）分泌的细胞因子对脂多糖刺激巨噬细胞
系RAW264.7炎症状态的影响。方法将LPS刺激的RAW264.7细胞炎症模型作为对照组,比较H-AEC、HA-MSC、UC-MSC和
RAW264.7共培养或条件培养基培养RAW264.7对RAW264.7炎症状态的影响。比较各组RAW264.7细胞的迁移能力;检测各
组细胞分泌一氧化氮（NO）的水平;用实时定量多聚酶链反应（RT-PCR）检测各组细胞经典激活的巨噬细胞（classically
activated macrophage, M1 macrophage）相关的促炎基因如白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死基因а（TNFа）、一氧化氮合成酶-2
（NOS-2）以及M2 macrophage相关的抑炎基因如精氨酸酶（Arg-1）、甘露糖受体基因CD206、B类清道夫受体CD36）表达情况。
结果（1）H-AEC、HA-MSC、UC-MSC 处理后RAW264.7 的迁移率分别为14.7%±4.5%、9.6%±0.7%、13.0%±0.9%,与对照组
（31.1%±11.0%）相比,3 种细胞的条件培养基处理后RAW264.7 的迁移率均降低,差异具有显著性（P<0.05）;（2）H-AEC、
HA-MSC、UC-MSC共培养后RAW264.7 细胞分泌NO的水平分别为24.26±0.72、44.52±2.51、42.25±0.76 μmol/L,与对照组
（45.65±1.78 μmol/L）相比,H-AEC组细胞分泌的NO有显著性下降（P<0.05）;（3）促炎基因与抑炎基因的表达改变：（A）H-AEC
处理组促炎基因IL-1β、TNFа、NOS-2、INFβ的表达下调,与对照组相比有显著差别;HA-MSC、UC-MSC处理组促炎基因INFβ表
达下调显著,其余基因均上调表达;抑炎相关基因如Arg-1、CD206、CD36均上调;（B）3组细胞干预后抑炎症相关基因Arg-1、
CD206、CD36表达均上调,与对照组有显著差异。结论人羊膜上皮细胞、羊膜间充质细胞和脐带间充质细胞可以促进巨噬细
胞向M2型分化,但其效果和机制存在不同。
     

3 种不同组织来源的间充质干细胞促内皮祖细胞血管形成作用的比较

目的：比较人骨髓、脂肪和脐带来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)促进内皮祖细胞 (endothelial progenitor cells,EPCs)形成血管以及维持血管稳定的能力。方法：采用体外共培养成血管试验比较3种来 源的MSCs促EPCs形成管状结构的能力;采用体内基质胶Matrigel成血管试验、免疫组织化学染色比较3种MSCs促进 EPCs在体内形成功能血管的能力。结果：EPCs在脂肪MSCs单层上形成的管状结构长度和节点数均高于在骨髓和脐带 MSCs单层上的形成数;EPCs与脂肪MSCs在Matrigel上共培养时形成的毛细血管样结构稳定性高于骨髓和脐带MSCs; 脂肪MSCs与EPCs在体内Matrigel中形成大量有血流灌注的功能血管,脐带MSCs与EPCs在体内Matrigel中形成少量有血 流灌注的功能血管,而骨髓MSCs与EPCs在体内Matrigel中只形成有血细胞渗漏的不完整血管。结论：脂肪MSCs在体 内、体外促EPCs形成血管结构并维持其稳定的能力高于骨髓和脐带MSCs。     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

人类胚胎干细胞向造血干细胞分化的微环境研究

目的 探讨胎肝基质细胞和骨髓基质细胞在诱导胚胎干细胞向血液血管干细胞分化中的作用,分析基因表达差异.方法 通过将分化4 d的EBs分别接种到以下两组中:(1)胎肝基质细胞层+细胞因子;(2)骨髓基质细胞层+细胞因子:诱导结束后,流式细胞术检测各组中血液血管干细胞标志KDR阳性细胞数以及造血干细胞标志CD34阳性细胞数,计数细胞分化过程中形成的造血干细胞样的集落数,比较诱导分化效果;收集胎肝基质细胞和胚胎骨髓基质细胞,采用cDNA芯片分析基因表达差异.结果 流式细胞术检测发现,两组中KDR+细胞的比例为分别为:(1.06±0.20)%、(8.8±1.49)%;CD34+细胞比例为分别为:(1.25±0.16)%、(9.19±2.10)%;血岛样集落数量分别为0.9±0.36、10.6±0.63;上述结果均以骨髓基质细胞联合细胞因子诱导方法效率最高.基因芯片(hBMSCs/hFLSCs)中总共有240条基因在骨髓基质细胞中高表达,397条基因的在肝脏基质细胞中高表达.对细胞因子、细胞黏附分子以及细胞外基质蛋白的基凶加以分析,结果发现在hBMSCs高表达的相关的21条基因,推测可能与造血分化相关.结论 人类胚胎十细胞向造血干细胞分化过程中,涉及到细胞与细胞之间的相互作用,相关的细胞因子、细胞黏附分子、细胞外基质蛋白等可能起重要的作用.     

SEM observation on LAK cells killing the human rectal adenocarcinoma cells in vitro

ＳＥＭｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｎＬＡＫｃｅｌｌｓｋｉｌｌｉｎｇｔｈｅｈｕｍａｎｒｅｃｔａｌａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏＤｉｎｇＹａｎｑｉｎｇ（丁彦青）；ＬｉＣｈｕｎｄｅ（李春德）；ＺｈａｎｇＪｉｕｈｕａ（张进华）；ｚｈｕＭｅｉ...