基于多链结构的CD30 CAR-T细胞的抗肿瘤作用研究

目的 基于衔接蛋白DAP12的多链嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)开发靶向CD30的CAR-T细胞药物,研究CD30 CAR-T对霍奇金淋巴瘤肿瘤细胞的体外和体内临床前药效。方法 通过基因合成和分子克隆技术,设计构建靶向CD30的CAR质粒,进行慢病毒包装,将得到的慢病毒转染T细胞,其中靶向CD30的多链CAR-T为CD30-KIRS2/Dap12-BB组,单链二代CAR-T为CD30-41BBζ组,未做病毒侵染的T细胞为NTD组,利用流式细胞术检测CAR阳性率情况,通过乳酸脱氢酶(LDH)释放检测细胞的杀伤活性,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子干扰素γ(IFN-γ)的分泌水平,进一步通过小鼠异种移植瘤模型检测CD30 CAR-T在小鼠体内抗肿瘤活性。结果 靶向CD30的多链CAR-T和单链二代CAR-T进行对比,研究发现多链CAR-T与单链CAR-T的杀瘤作用相似。但值得注意的是,多链CAR-T的IFN-γ分泌水平更高(P<0.001)。更重要的是,在小鼠的肿瘤模型实验中,多链CAR-T实现了肿瘤的完全消退。结论 靶向CD30的多链CAR-T在抗肿瘤活性方面优于传...     

嵌合抗原受体修饰T细胞免疫治疗食管癌的实验研究

目的 观察嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T)对人食管癌细胞EC109的体内外抗肿瘤作用。方法 以表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)为分子靶点、EC109-EGFRvⅢ为靶细胞，将二代CAR表达框克隆入慢病毒表达载体中，制备慢病毒并转染人外周血T细胞，采用乳酸脱氢酶(LDH)活性及干扰素γ(IFN-γ)等方法检测体外抗肿瘤作用，通过NSG小鼠移植瘤模型观察体内抗肿瘤作用。结果 表达质粒pEGFRvⅢ/CAR经限制性内切酶片段分析、基因检测及NCBI/Blast同源性分析确认各功能单位核苷酸序列准确无误、基因片段连接正确，流式细胞术检测慢病毒转染后T细胞EGFRvⅢ/CAR表达率为82%。效应细胞(EGFRvⅢ/CAR-T)和靶细胞(EC109-EGFRvⅢ)混合培养，LDH细胞毒性检测结果显示靶细胞裂解死亡与效/靶比呈正相关(E∶T为5∶1、10∶1、20∶1、40∶1),IFN-γ在E∶T为5∶1时与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。NSG小鼠皮下移植模型提示EGFRvⅢ/CAR-T对移植瘤有肿瘤抑制作用。结论 体外和体内实验显示CAR-T细胞对EC109-E...     

钠碘转运体报告基因共表达对嵌合型受体T细胞体外增殖及杀伤能力的影响

目的 探讨钠碘转运体（NIS）报告基因的共表达对嵌合型受体T（CAR-T）细胞体外增殖和杀伤活性的影响。方法 慢病毒感染法制备CAR-T细胞（仅表达CD19 CAR的T细胞）、NIS-T细胞(仅表达NIS报告基因的T细胞)和NIS-CAR-T细胞（共表达NIS和CD19 CAR的T细胞）,然后按T细胞蛋白表达情况分为4组∶T细胞组（未转染的T细胞）、CAR-T组、NIS-T组、NIS-CART组。流式细胞术检测各组NIS和CAR转染率。各组细胞常规培养24、48、72 h,CCK-8法检测增殖能力。各组T细胞为效应细胞,Nalm6肿瘤细胞为靶细胞,按效靶比0.5∶1、1∶1、2∶1、4∶1共培养24、48、72 h,乳酸脱氢酶细胞毒性检测法（LDH）检测各组细胞对肿瘤细胞的杀伤率,酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测共培养上清液中各组细胞因子人干扰素-γ（IFN-γ）和人肿瘤坏死因子-β（TNF-β）释放水平。摄碘实验检测表达NIS蛋白各组细胞的NIS功能。结果 CAR-T细胞、NIS-CAR-T细胞的CAR转染率分别为91.91%、99.41%,NIS-T细胞、NIS-CAR-T细胞的NIS转染率分别为47.83%、50.24%。常规培养24、48、72 h CAR-T细胞与NIS-CAR-T细胞增殖率差异无统计学意义（P>0.05）。0.5∶1、1∶1、2∶1和4∶1效靶比作用24 h时CAR-T细胞杀伤率（%）均高于NIS-CAR-T细胞（P<0.05）,作用48 h和72 h时两组杀伤率差异均无统计学意义（P>0.05）。CAR-T细胞与NIS-CAR-T细胞均存在IFN-γ和TNF-β释放现象,释放水平均高于对照组（P<0.05）。NIS-T细胞与NIS-CAR-T细胞均具有特异性摄碘能力,二者间摄碘能力差异无统计学意义（P>0.05）,但均高于对照组T细胞（P<0.05）。结论 NIS报告基因的共表达不影响CAR-T细胞中CAR转染率,对细胞增殖和杀伤活性无抑制现象。     

靶向前列腺干细胞抗原的嵌合抗原受体T细胞构建及其抗肿瘤作用

目的 制备表达靶向前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen,PSCA)的嵌合抗原受体修饰的T细胞(chimeric antigen receptor T-cell,CAR-T),研究其嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)的表达及其对肿瘤细胞的体内外杀伤作用.方法 基因合成靶向PSCA的单克隆抗体的轻链和重链可变区(PSCA ScFv),利用酶切将其插入慢病毒载体中.病毒感染T淋巴细胞后,通过流式细胞术检测PSCA-CAR在T淋巴细胞中表达的阳性率.利用体外杀伤实验及ELISA实验分别检测PSCA-CAR-T细胞对PSCA阳性的HeLa细胞及PSCA阴性的T24细胞的杀伤效果、特异性及其细胞因子分泌情况.利用NOG小鼠背部皮下注射HeLa细胞建立移植瘤模型.结果 酶切结果表明慢病毒载体pL-PSCA-G4H-28TM-28 BBζ构建成功,DNA测序结果表明PSCA-CAR的载体序列正确;病毒感染T淋巴细胞后CAR表达阳性率为53.9％;获得的PSCA-CAR-T细胞不管是在高效靶比短时作用条件下还是低效靶比长时作用条件下,其对PSCA阳性肿瘤细胞的杀伤作用均明显强于PSCA阴性肿瘤细胞(P＜0.01);同时获得的PSCA-CAR-T在受到PSCA阳性肿瘤细胞刺激时,分泌的细胞因子量显著高于对照的T细胞(P＜0.01),而在受到PSCA阴性肿瘤细胞刺激时几乎不分泌细胞因子.体内实验证实PSCA-CAR-T细胞在体内有显著的肿瘤抑制效果(P＜0.01).结论 成功制备了靶向PSCA的CAR-T细胞,该CAR-T细胞能特异杀伤PSCA阳性的肿瘤细胞.     

表达靶向癌胚抗原的嵌合受体的慢病毒载体构建及初步应用

目的构建表达靶向癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)的慢病毒载体LV-EF1 α-CEA-2A-GFP-WPRE,研究该载体感染T淋巴细胞后嵌合抗原受体的表达以及对CEA阳性肿瘤细胞系的杀伤作用.方法 利用常规分子克隆技术从含靶向CEA的单链化抗体的载体上得到抗CEA抗体的编码序列,通过测序鉴定,采用酶切将基因片段插入慢病毒载体中.慢病毒载体感染T淋巴细胞后,通过非变性非还原Western blot、流式细胞术检测CEA-CAR在T淋巴细胞中的表达,体外杀伤实验检测对CEA阳性肿瘤细胞系的杀伤效果.结果 测序结果显示CEA-CAR的序列正确,酶切结果显示慢病毒载体LV-EF1α-CEA-2A-GFP-WPRE构建正确;感染T淋巴细胞后CEA-CAR阳性表达率为62.8％;可有效杀伤CEA阳性肿瘤细胞系(P＜0.01).结论成功构建了表达靶向CEA的嵌合抗原受体LV-EF1 α-CEA-2A-GFP-WPRE的慢病毒载体,该嵌合抗原受体可在T细胞中正确表达,并有效杀伤CEA阳性肿瘤细胞.     

靶向Trop-2 CAR-T细胞的制备及其体外对卵巢癌细胞杀伤作用的研究

目的：制备靶向人滋养层细胞表面抗原2（human trophoblast cell surface antigen 2 , Trop-2)的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell , CAR-T）,观察Trop-2 CAR-T细胞在体外对卵巢癌细胞增殖的影响。方法：运用分子克隆及基因重组技术构建Trop-2 CAR;采用Western blot检测Trop-2 CAR在293T细胞中的表达;CCK-8法检测Trop-2 CAR-T细胞对卵巢癌细胞增殖的影响;ELISA检测细胞因子分泌的变化。结果：酶切鉴定及测序分析结果表明,Trop-2 CAR各基因片段连接正确;Western blot检测结果显示,该质粒能够在293T细胞中有效表达;CCK-8结果显示,制备的Trop-2 CAR-T细胞在体外能明显抑制表达Trop-2的卵巢癌细胞的增殖（P＜0.05）;ELISA检测结果表明Trop-2 CAR-T细胞与表达Trop-2的卵巢癌细胞共培养后,干扰素（interferon-γ,IFN-γ)、白介素（interleukin-2,IL-2)细胞因子分泌增加（P＜0.01）。结论：该研究成功制备了Trop-2 CAR-T细胞,可有效抑制Trop-2表达阳性的卵巢癌细胞的增殖。     

ROR1 CAR-T疗法在肿瘤免疫治疗中的研究进展

免疫疗法在肿瘤治疗学领域的发展突飞猛进,已成为多种恶性肿瘤的潜在治疗方法。其中,过继性细胞疗法是肿瘤免疫疗法中研究的热点,尤其是嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor engineered T cells,CAR-T)疗法。受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(recombinant receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1,ROR1)重组蛋白是一类高表达于多种肿瘤细胞的膜受体蛋白,与肿瘤的发生、发展密切相关,是肿瘤免疫疗法的理想靶标。目前,靶向ROR1的CAR-T疗法日益兴起,已广泛应用于白血病、三阴性乳腺癌、肉瘤、卵巢癌、肺癌等多种肿瘤的免疫治疗。现拟通过对ROR1 CAR-T疗法在多种肿瘤中的研究进展进行综述,以期更全面地评估ROR1 CAR-T疗法的实际疗效,同时为ROR1 CAR-T的改善设计提供参考依据,以期进一步推动ROR1 CAR-T疗法的临床应用。     

靶向黏蛋白1嵌合抗原受体修饰的Jurkat T细胞特异杀伤肝癌细胞

目的探讨靶向黏蛋白1(mucin 1,MUC1)的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞株(CAR-T)对MUC1高表达肝癌细胞的特异杀伤能力。方法分别构建第1代与第3代靶向MUC1的CAR基因表达框(MUC1-CAR与G3MUC1-CAR),并将其装入慢病毒载体,利用获得的重组慢病毒感染Jurkat细胞,通过CCK-8法、ELISA法、乳酸脱氢酶释放实验,分别检测在MUC1抗原存在条件下,CAR-T细胞的增殖、IL-2分泌量、杀伤作用。结果成功构建2种靶向MUC1嵌合抗原受体表达框的重组慢病毒Jurkat CAR-T细胞株。两种Jurkat CAR-T细胞均能特异识别MUC1分子,杀伤MUC1高表达的肝癌细胞QGY-7701,而对MUC1低表达的正常肝细胞基本不杀伤;第3代CAR修饰的Jurkat T细胞接触MUC1分子后,其增殖速度、IL-2分泌量和杀伤效率均优于第1代MUC1修饰细胞(P<0.05或P<0.01)。结论靶向MUC1的Jurkat CAR-T细胞能特异杀伤MUC1高表达的肝癌细胞。     

稳定高表达RORα基因的人胃癌MGC803细胞系的构建与鉴定

目的 构建维甲酸相关孤核受体α(RORα)基因的真核表达载体,并建立稳定高表达RORα的人胃癌MGC803细胞,为研究RORα的功能奠定基础。方法根据RORα基因的cDNA全序列,设计一对带有限制性酶切位点的引物。从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作为模板合成RORα cDNA第一链,并用上述引物扩增目的基因全序列,然后经双酶切插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DH5α;用氨苄青霉素筛选pcDNA3.1(+)-RORα的阳性菌株,双酶切和测序进行鉴定。用经鉴定的重组质粒pcDNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞,G418筛选获得RORα/MGC803细胞株;Real-time PCR和Western blot检测该细胞株RORα的表达情况。结果经双酶切鉴定,构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα包含有大约1 640 bp的插入片段,与预期大小一致;表达载体经测序鉴定,其插入片段碱基序列与RORα基因的cDNA序列完全一致。用构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞后,筛选到可稳定传代的RORα/MGC803细胞株。Real-time PCR与Western blot检测显示,RORα/MGC803细胞RORα mRNA和蛋白表达增高。结论成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα和建立高表达RORα基因的RORα/MGC803细胞。     

一种靶向HER2嵌合抗原受体CAR THP-1细胞系的构建

目的 获得稳定转染靶向人类表皮生长因子2(HER2)的嵌合抗原受体巨噬细胞(CAR-M)。方法 构建靶向HER2的CAR慢病毒载体并感染人单核细胞白血病细胞系(THP-1)。通过分选流式细胞仪分选出含有绿色荧光标记的CAR THP-1细胞并在体外继续培养。将此靶向HER2的CAR THP-1细胞与HER2表达阴性(-)及阳性(+)的子宫内膜癌细胞系Ishikawa分别共培养，通过成像流式细胞仪检测其对HER2表达阳性肿瘤细胞的靶向吞噬，通过流式细胞仪检测其对HER2表达阳性肿瘤细胞的靶向吞噬比例。结果 CAR慢病毒感染THP-1细胞效率较低；与癌细胞共培养后，流式细胞术及成像流式细胞术结果显示，CAR THP-1组与空载体组相比，CAR THP-1细胞对HER2阳性的Ishikawa细胞吞噬能力增强(P<0.01)。结论 通过构建CAR慢病毒载体并转染THP-1细胞，成功建立了靶向HER2的CAR THP-1细胞系，且其能通过特异性靶向吞噬HER2阳性Ishikawa细胞。     

人生长激素释放激素变异受体1型基因绿色荧光蛋白真核表达载体1的构建及体外表达

目的构建人生长激素释放激素变异受体1型（GHRHR-SVT1）基因绿色荧光蛋白真核表达载体1（pEG—FP—N1）并在鼠成纤维细胞株NIH-3T3细胞中的表达。方法GHRHR-SVT1基因是由人胃癌细胞株AGS中扩增出的DNA片段,克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,用高效转染试剂将pEGFP-N1／GHRHR—SVT1转染NIH-3T3细胞,NIH-3T3细胞分3组：非转染组（对照组）,只加转染试剂不加质粒;转染空质粒组（pEGFP-N1组）,加转染试剂与空质粒;重组质粒转染组（pEGFP-N1／GHRHR-SVT1组）,加转染试剂与重组质粒。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法和流式细胞仪检测各组转染后各组NIH-3T3细胞的生长情况。结果（1）pGEFP—N1／GHRHR-SVT1经限制性内切酶XhoⅠ和BarnHⅠ双酶切产生约1080bp和4700bp2条带。（2）构建的GHRHR-SVT1cDNA序列与GHRHR—SVT1原始序列（AF-282259）进行对比,第54位碱基突变（A突变为T）,为无义突变。（3）重组质粒转染组NIH-3T3细胞增殖率明显高于对照组（P〈0．01）。（4）重组质粒转染组NIH-3T3细胞增殖指数明显高于对照组（P〈0．01）。结论在适当浓度GHRH（10μmol／L）的培养基中,GHRHR—SVT1能够促进NIH-3T3细胞增殖,并为肿瘤的治疗提供新的思路。     

pLIVE—IL-1β表达载体的构建及在Hepal- 6细胞的表达

目的构建应用于体内表达和研究的小鼠IL-1β肝癌细胞特异性表达载体，观察其在小鼠HE—PA1-6细胞中的表达水平。方法分离BALB／c小鼠外周血淋巴细胞，LPS刺激后提到总RNA，RT—PCR扩增IL-1β基因，与pLIVETM连接构建pLIVE-IL-1β重组表达载体，并通过菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列分析进行鉴定。利用TransITTM将pLIVE-IL-1B转染至Hepa1-6肝癌细胞，RT—PCR分析IL-1β的表达水平。结果从小鼠腹腔巨噬细胞中RT-PCR扩增得到一822bp的片段，纯化的PCR产物与pLIVETM同时经XhoⅠ和NheⅠ双酶切后连接，菌落PCR鉴定获得多个阳性克隆，经质粒XhoⅠ4-NheⅠ限制性酶谱分析，酶解出822bp的条带，DNA序列分析证实重组载体中的DNA序列与GeneBank登录的小鼠IL-1β基因一致。将该载体转染Hepal-6细胞，RT．-PCR证实，与转染pLIVETM的对照细胞相比，IL-1β的表达水平明显升高。结论成功构建了小鼠IL—1β肝癌组织特异性表达载体pLIVE-IL—1β，该载体能够在小鼠肝癌细胞中稳定高效表达IL-1β。     

人caspase-1真核表达载体的构建及表达

目的构建人caspase-1真核表达载体,观察其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法分离人外周血淋巴细胞,LPS刺激提取细胞总RNA,RT-PCR方法分别扩增caspase-1两片段S1、S2,利用重叠延伸PCR方法（SOE）获得caspase-1全长序列,将其克隆入pIRES2-EGFP载体,进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染HepG2肝癌细胞,倒置相差荧光显微镜下观察其表达情况,RT-PCR分析caspase-1的表达水平。结果份外周淋巴细胞中经RT-PCR分别扩增出365bp和883bp片段,纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一1234bp的条带,与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接,菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆,质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ限制性酶谱分析酶解出1234bp条带,DNA序列分析证实重组载体中的DNA序列与GenBank中人caspase-1序列完全一致。将该载体转染至HepG2细胞中,经RT-PCR证实,与转染pIRES2-EGFP空载体的对照组细胞相比,caspase-1水平明显升高。结论本研究成功构建人caspase-1表达载体pIRES2-EGFP-caspase-1,该载体能够在人肝癌细胞中高效表达外源基因。     

转录因子RORγt对T细胞亚群产生IFN-γ的调控作用

目的:探讨转录因子维A酸相关孤独受体γt(RORγt)对T细胞亚群产生IFN-γ的调控作用。方法:健康成人外周血单个核细胞用CD3单克隆抗体和IL-2激活和扩增T细胞,活化T细胞用脂质体法转染人工合成的RORγt基因特异性短干扰RNA(siRNA)序列3个片段(RORγt-siRNA-982,-1026,-1197),RT-PCR半定量法检测活化T细胞转染siRNA后RORγt基因表达,流式细胞仪检测不同T细胞亚群产生IFN-γ细胞的比例。结果:活化T细胞转染RORγt-siRNA后,对RORγt基因表达的检测显示,RORγt-siRNA-982序列无抑制作用,而RORγt-siRNA-1026和-1197序列均有明显抑制作用。活化T细胞转染RORγt-siRNA-1026后,产生IFN-γ细胞百分数在CD4+ T细胞(32.78±3.41)中,明显低于未转染组(44.54±1.75)(P<0.01)。结论:转录因子RORγt对T细胞,特别是对CD4+ T细胞产生IFN-γ有正调控作用。     

嵌合抗原受体修饰T细胞在实体肿瘤治疗中的应用

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)是一种人工修饰的T细胞表面受体,它可以模拟天然的T细胞受体(T cell receptor,TCR)的功能.使用转基因技术可以在T细胞表面稳定表达CAR.CAR修饰T细胞(CAR-T细胞)利用抗体的肿瘤特异性识别能力,靶向发挥T细胞的效应功能.目前CAR-T细胞在临床治疗白血病、淋巴瘤、黑素瘤等恶性肿瘤中取得了令人鼓舞的效果.但由于实体肿瘤的某些特点,CAR-T细胞在临床治疗实体肿瘤的实践中存在部分障碍.随着研究的深入,三代CAR-T细胞、双重特异性CAR-T细胞等的应用将为CAR-T细胞临床治疗实体肿瘤开拓道路.本文就近年来CAR-T细胞在实体肿瘤中的应用作一综述.     

短发夹状干扰RNA沉默信号传导和转录激活子3基因表达对大肠癌细胞的影响

目的构建携带信号传导和转录激活子3（STAT3）基因短发夹状干扰RNA（shRNA）的真核表达载体,观察干扰STAT3表达对大肠癌细胞HT-29细胞增殖的影响。方法从GenBank STAT3mRNA上寻找到3条符合特征的靶序列,合成靶序列的DNA寡核苷酸链,合成双链DNA,并和BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/Neo载体质粒连接产生重组质粒,行PCR和测序鉴定。重组质粒瞬时转染大肠癌HT-29细胞,实时定量PCR、Western blot检测STAT3的表达。筛选出最佳重组质粒,转染大肠癌细胞后,MTT检测细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果成功构建了携带有STAT3基因的shRNA的重组质粒,PCR和测序证实重组质粒构建正确。3种重组质粒对大肠癌HT-29细胞STAT3的表达有明显的抑制作用。筛选出的最佳重组质粒转染大肠癌细胞后,细胞增殖能力明显减弱;细胞周期分析显示,G0/G1期细胞占（74.80±1.85）%,S期细胞占（15.72±2.26）%,与对照组差异显著（P〈0.01）。结论干扰STAT3基因的表达可以有效抑制大肠癌HT-29细胞的生长。     

由mTERT启动子驱动m4-1BBL基因的腺病毒载体的构建

目的构建由具有肿瘤特异性启动作用的端粒酶逆转录酶启动子（mTERT-promotor）驱动m4-1BBL（CD137Ligand）基因的腺病毒载体。方法用PCR和RT-PCR的方法,分别从C57BL/6小鼠组织中克隆mTERT启动子和共刺激分子m4-1BBL基因,通过T载体和转移载体将目的基因亚克隆到腺病毒载体上,293A细胞包装成病毒颗粒rAD-mTERT-m4-1BBL,流式细胞仪检测m4-1BBL基因在Hepa1-6及L929细胞上的表达。结果通过PCR检测、直接测序证实目的基因克隆成功并亚克隆到表达载体上,细胞免疫化法证实病毒包装成功,流式细胞仪检测发现重组腺病毒载体rAD-mTERT-m4-1BBL能特异性地在肿瘤细胞Hepa1-6上高表达m4-1BBL。结论由mTERT-promotor驱动m4-1BBL基因的具有肿瘤特异性的腺病毒载体构建成功,为下一步进行体内外抗肿瘤实验打下了基础。     

肿瘤归巢肽-近红外荧光蛋白融合蛋白的制备及其荧光特性

目的 构建肿瘤归巢肽（THPs）-近红外荧光蛋白（NIRFP）miRFP670- LyP1融合蛋白的原核表达载体,纯化融合蛋白,研究融合蛋白的近红外荧光特性。 方法 采用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和Not Ⅰ对pmiRFP670-N1质粒和pET-28a质粒进行双酶切,构建pET-miRFP670原核表达载体,通过点突变引入LyP-1的DNA序列,构建重组表达载体pET-miRFP670-LyP1;将测序正确的重组表达载体转化至大肠杆菌BL21细胞中,SDS-PAGE电泳法检测不同温度（16 ℃和37 ℃）、不同异丙基硫代半乳糖苷浓度（0.1、0.5和1.0 mmol·L^－1）诱导下融合蛋白原核表达量;采用Ni-NTA树脂亲和纯化融合蛋白,检测miRFP670-LyP1蛋白原核表达量;采用荧光显微镜观察乳腺癌4T1细胞中miRFP670-LyP1融合蛋白的细胞内吞形态表现。 结果 检测到长度约为5 343和973 bp的DNA条带,与pET-28a载体及miRFP670基因片段大小相符。DNA测序,LyP1序列成功插入至pET-miRFP670表达载体中。在16 ℃时miRFP670-LyP1融合蛋白的可溶性蛋白表达量较37 ℃时更高。采用Ni-NTA树脂纯化得到了高纯度的miRFP670-LyP1融合蛋白。荧光成像,miRFP670-LyP1融合蛋白可被乳腺癌4T1细胞高效内吞。 结论 成功构建了pET-miRFP670-LyP1原核表达载体,融合蛋白在低温（16 ℃）较常温（37 ℃）诱导的可溶性蛋白表达量更高,亲和层析得到了高纯度的融合蛋白,融合蛋白被乳腺癌4T1细胞高效内吞并显示出近红外荧光。