应用几丁质胶原网架构建组织工程软骨

目的：探索利用几丁质胶原网架构建组织工程人工软骨的方法。 方法：取2周龄的新生兔关节软骨,经消化、传代培养后,将获得的软骨细胞与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合,将几丁质纤维网架浸入上述混合物中制成人工软骨培养物并在体外培养。将培养1周的组织工程培养物,植入同种异体动物皮下组织培养4周,观察组织工程软骨的形成情况。 结果：细胞在几丁质网架培养物中分布均匀,细胞多呈三角形或梭形,培养物体积收缩不明显,经体内培养存活的软骨细胞分泌Ⅱ型胶原,有血管和炎性细胞的侵入。结论：用胶原蛋白和人血纤维蛋白混合凝胶与几丁质纤维网架载体为支架植入软骨细胞以后,在体外和体内都可以培养构建出较大的组织工程软骨。     

利用PLGA细胞支架再生人关节软骨的实验研究

目的：研究人关节软骨细胞在PLCA三维支架上的贴附和生长情况，利用组织工程技术培养工程化关节软骨。方法：制作PLGA三维细胞支架。分离培养成人关节软骨细胞，体外扩增后种植到PLGA支架中。在体外和裸鼠体内分别培养软骨细胞一支架复合物，分期终止培养，进行组织学染色、扫描电镜、Ⅱ型胶原免疫组织化学及cDNA探针原位杂交检测。结果：体外培养发现，软骨细胞支架材料内贴附生长良好，长期培养仍保持软骨细胞特性，棵鼠体内培养8周后可形成软骨样组织。结论：PLGA三维支架适合软骨细胞贴附生长和分泌软骨外基质，可作为软骨组织工程的细胞载体。利用组织工程的方法可获得适于移植的工程化关节软骨。     

兔关节软骨细胞在纤维蛋白胶中体外培养

目的：研究关节软骨细胞在纤维蛋白胶中三维培养时的表现。方法：（１）通过硫酸铵沉淀法从兔血液中提取纤维蛋白原并制备纤维蛋白胶;（２）在纤维蛋白胶凝成的纤维蛋白中立体培养关节软骨细胞,观察其表现并测定生长曲线、倍增时间;（３）通过透射电镜、ＡＢ－ＰＡＳ染色、Ⅱ型胶原免疫组化检查等,了解细胞生长及软骨基质的分泌情况。结果：（１）关节软骨细胞在纤维蛋白中大部分保持卵圆形、小部分如贴壁细胞状;（２）细胞倍增     

人Ad-BMP-2基因转染兔骨髓基质干细胞对其Ⅱ型胶原和碱性磷酸酶表达的影响

目的：用人骨形态发生蛋白2腺病毒表达载体（Ad-BMP-2）转染兔骨髓基质干细胞（BMSC）,观察Ad-BMP-2转染对细胞分化的影响。 方法：将Ad-BMP-2转染体外培养的兔BMSC,7 d后利用原位杂交和免疫组化方法检测细胞内BMP-2及Ⅱ型胶原的表达,同时行碱性磷酸酶染色。 结果：BMP-2和Ⅱ型胶原原位杂交法显示实验组细胞胞浆中有棕黄色阳性杂交信号,对照组阴性。BMP-2和Ⅱ型胶原免疫组化法显示实验组细胞胞浆棕黄色阳性着色,胞核阴性表达,对照组阴性;碱性磷酸酶染色见实验组细胞胞浆呈棕黑色阳性着色,可见细小的棕黑色颗粒,对照组染色阴性。结论：Ad-BMP-2可高效转染BMSC,且促进其向成骨细胞和软骨细胞方向转化。     

体外家兔骺板软骨细胞和复合支架材料构建人工骺板软骨

目的：探讨采用复合支架材料构建人工骺板软骨的可行性。方法:分离获得骺板软骨细胞,加入0.3% Ⅰ型胶原酸性溶液、1 000 U·mL^-1凝血酶溶液及20 g·L^-1人血冻干纤维蛋白原混匀,成为胶冻样软骨组织培养物。定期取培养块固定,常规石蜡切片,行HE染色、甲苯胺蓝染色及免疫组化检查。结果：新制成的以胶原-纤维蛋白混合凝胶为支架材料的软骨细胞培养物呈浅粉红色胶冻样 ,细胞均匀分布于其中。培养3 d后悬浮物呈乳白色,透光度降低。逐渐缩小至直径约7 mm大小,硬度逐渐增加。HE染色见软骨细胞位于软骨陷窝内,软骨细胞培养物有一定层次感,但没有象骺板样排列成柱状。甲苯胺蓝染色显示胞体周围有丰富的软骨基质。免疫组织化学染色可见Ⅱ型胶原阳性细胞。结论：利用混合支架构建的人工骺板软骨在大小及可塑性等方面结果较满意。     

关节软骨损伤组织工程修复的实验研究

目的：（1）研究不同体外培养时间软骨的生物学特性，探讨运用于软骨组织工程中软骨种子细胞的最适宜培养时间和条件。（2）应用组织工程技术探讨运用自体关节软骨细胞修复关节软骨缺损的可行性。（3）应用组织工程技术探讨应用同种异体软骨细胞修复关节软骨缺损的可行性。（4）研究修复关节软骨缺损的软骨细胞来源。方法：（1）取新西兰兔关节软骨细胞体外培养，观察软骨细胞的形态学变化，生长曲线，酸性粘多糖及胶原分泌情况。（2）建立关节软骨缺损模型，应用自体关节软骨细胞复合生物支架Pluronic修复关节软骨缺损，观察修复效果。（3）应用同种异体软骨细胞复合生物支架Pluronic修复关节软骨缺损，观察修复效果。（4）应用3H－TdR放射自显影方法，确定修复关节软骨缺损的细胞来源。结果：（1）体外培养第四代软骨细胞的增殖能力达到高峰，而第二代软骨细胞分泌基质能力最强。（2）自体或同种异体软骨细胞复合Pluronic修复关节软骨缺损，12周后缺损表面较平滑，与正常软骨界面愈合较好，MASSON三色染色显示胶原分布已较均匀， 骨细胞呈柱状排列，II型胶原在细胞周围阳性表达，而空白对照和材料对照组未见明显修复。（3）3H－TdR放射自显影方法证实修复软骨组织的细胞来源于体外移植细胞，软骨细胞植入体内早期仍进行有丝分裂，而在中后期软骨细胞以分泌基质为主，植入的细胞与周围软骨细胞间存在物质交换。结论：（1）软骨细胞在体外培养2－3周左右是作为软骨组织工程种子细胞的最佳时机。（2）自体或同种异体组织工程化软骨是修复关节软骨缺损的较好方法。（3）组织工程化软骨修复关节软骨缺损的细胞来源于体外移植的软骨细胞。     

bFGF、IGF-Ⅰ对兔关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响

目的：研究碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、胰岛素样生长因子-Ⅰ（insuline-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）单独及联合应用对体外培养多次传代的兔关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响。探讨传代多次的软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法：第3、5、7代体外培养的兔关节软骨细胞，以常规培养组作为对照组，bFGF（5ns／m1）或和IGF-Ⅰ（100ng/ml）单独刺激及联合刺激作为实验组，免疫组化法测定Ⅱ型胶原的定性表达，并通过图像分析作半定量分析。结果：对照组细胞第5代以后无阳性表达。第3、5、7代细胞在bFGF或IGF-Ⅰ刺激下。Ⅱ型胶原表达强度显著高于对照组（P〈0．01）；bFGF和IGF-Ⅰ联合作用下，Ⅱ型胶原表达强度均显著高于单独以bFGF或IGF-Ⅰ刺激组（P〈0．05）。结论：bFGF、IGF-Ⅰ能促进多次传代软骨细胞Ⅱ型胶原的表达，且联合应用时促进作用更为明显。多次传代软骨细胞在生长因子刺激下，仍有再分化的能力。而有成为软骨组织工程种子细胞的可能。     

乳兔关节软骨细胞的分离、培养及生物学特性的观察

目的：建立乳兔软骨细胞分离及培养的方法,观察软骨细胞在体外培养中的生物学特性.方法：采用两步消化法,将乳兔关节软骨进行分离、培养.采用苏木精伊红染色和甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行鉴定,用MTT法绘制生长曲线、并在倒置显微镜观察各代软骨细胞形态、通过免疫组化染色、逆转录聚合酶反应（RT PCR）法观察其生物学特性.结果：通过两步酶消化法,成功分离出乳兔关节软骨细胞,培养24 h后细胞贴壁呈短梭形.培养2周左右软骨细胞聚集似“铺路石”样.MTT法显示细胞生长曲线近似“S”形.甲苯胺蓝呈阳性结果,并随代数增加阳性结果呈减弱趋势.通过免疫组化染色和RT PCR显示随代数增加软骨细胞Ⅰ型胶原表达增强,Ⅱ型胶原表达减弱.结论：本研究采用两步酶消化法,成功从乳兔软骨内获取大量活性好、纯度高的软骨细胞,3代以内软骨细胞生长良好,并保持其生物学特性,适于软骨组织工程的应用.3代以后开始出现去分化现象.     

生物蛋白胶/松质骨基质负载软骨细胞体外培养的实验研究

目的 探讨生物蛋白胶，松质骨基质作为软骨细胞培养支架的可行性。方法 ①取3周龄的新西兰幼兔的关节软骨细胞种植于生物蛋白胶，松质骨基质载体上作体外培养；②通过倒置显微镜、扫描电镜、透射电镜、AB-PAS染色、Ⅱ型胶原免疫组化检查等，了解细胞生长及软骨基质的分泌情况，并观察载体降解情况。结果 ①生物蛋白胶，松质骨基质载体中大部分保持卵圆形，小部分在支架表面如贴壁细胞状；②于第9天以后，支架内的细胞数均开始明显增加。软骨细胞活性达95％以上；③AB-PAS染色（＋）、Ⅱ型胶原免疫组化检查（＋）；④电镜观察显示软骨细胞较好地附在支架上并分泌细胞外基质。结论 生物蛋白胶，松质骨基质是一种较好的软骨细胞培养支架。     

体外构建可注射性组织工程软骨的初步研究

目的利用关节软骨细胞复合壳聚糖-磷酸甘油(chitosan/glycerophosphate, C/GP)凝胶,体外构建可注射性组织工程软骨,为微创方式治疗关节软骨缺损提供依据.方法以体外培养扩增的兔关节软骨细胞为种子细胞,以自制温固化可注射C/GP凝胶为支架,按5×107/ml细胞浓度复合体外培养.于倒置显微镜下观察细胞形态与分布,四甲基偶氮唑盐(MTT)法计算培养1周时种子细胞存活率,培养4周时样本进行组织学及扫描电镜观察.结果软骨细胞在7:1(体积分数)C/GP凝胶中保持球形,细胞存活率95%以上;HE染色可见软骨较为典型的陷窝样结构、软骨囊及同源细胞群等现象;甲苯胺蓝异染及免疫组化Ⅱ型胶原染色呈强阳性.结论软骨细胞在C/GP凝胶中可存活并保持分泌软骨基质的功能,形成类软骨组织.温固化可注射性C/GP凝胶能作为软骨组织工程的载体材料.     

体外诱导骨髓间充质干细胞构建纤维蛋白胶软骨模块

目的:探讨体外构建骨髓间充质干细胞、改良纤维蛋白胶及生长因子的组织工程软骨模块的可行性。方法:分离兔骨髓间充质干细胞,种植在改良纤维蛋白胶支架内。实验组培养液中加入TGF-β1和BMP-6,对照组未加入诱导因子。体外进行形态组织学观察。1、2、3和4周取材作Masson染色、Ⅱ型胶原染色和扫描电镜观察。结果:细胞在支架上贴附,增殖。实验组中Masson染色可见胞浆及细胞周围有胶原形成;Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。结论:TGF-β1和BMP-6可诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化,在改良纤维蛋白胶支架内体外成功构建组织工程软骨模块。     

退变腰椎软骨终板细胞生物学特征实验研究

目的 通过对人腰椎软骨终板细胞的培养,观察细胞的形态学和生物学性状,探讨影响其生物学行为的因素.方法 取腰椎退变和未退变终板软骨细胞,在加10%灭火胎牛血清的DMEM培养液中培养.建立体外终板软骨细胞培养模型,采取HE染色、绘制细胞生长曲线、Annexin-V/PI法、免疫组织化学染色、real-time PCR等方法,对细胞形态、活力、生长情况、凋亡、及软骨细胞基质合成进检测.结果 软骨终板细胞可以在体外进行培养;终板软骨细胞的生长情况及细胞表型类似关节软骨,有Ⅱ型胶原表达.退变软骨终板较未退变软骨终板活性及增殖能力降低.细胞凋亡增加,Ⅱ型胶原合成减少.结论 体外成功培养了人腰椎终板软骨细胞,并证明了退变软骨终板细胞凋亡增加,而活性降低,基质合成减少.该研究也为进一步研究终板软骨的生物学性状奠定基础.     

透明质酸凝胶中肌源性干细胞与透明软骨联合培养的实验研究

 摘　要：目的 探讨肌源性干细胞与软骨细胞混和培养体外成软骨的可行性。方法 分离培养、扩增传代兔MDSCs及关节软骨细胞,二者按一定比例混和,6×1010/L密度接种于5%浓度的透明质酸凝胶为共培养组,以相同密度的单纯MDSCs和单纯软骨细胞作为阴性与阳性对照。倒置相差显微镜下观察,10d后行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学检测,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan的mRNA表达。结果 5d后镜下见共培养组MDSCs形态由梭形向多边多角形转化,10d后细胞甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测与阳性对照组相同,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA呈阳性表达。阴性对照组在体外培养过程中未分化为软骨细胞. 结论:软骨微环境在MDSCs成软骨分化过程中具有重要作用,软骨细胞能有效地诱导MDSCs向软骨样细胞分化,透明质酸凝胶可以作为软骨组织工程的良好载体。     

氟浓度对体外培养大鼠软骨细胞糖胺多糖和Ⅱ型胶原分泌的影响

目的 探讨氟浓度对体外培养软骨细胞糖胺多糖（GAG）和Ⅱ型胶原分泌的影响.方法 取2月龄雌性SD大鼠下肢髋关节及膝关节软骨,分离、培养出软骨细胞后,接种于细胞培养瓶,经鉴定后,分为空白对照组和NaF受试组（6.25 μmol/ml、12.50μmol/ml、25.00 tmol/ml、50.00 μmol/ml和100.00 μmol/ml）,孵育6d后,分别进行GAG含量测定、阿利新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色.结果 NaF受试6d后,大鼠软骨细胞培养液GAG含量各组无显著性差异（P＞0.05）;阿利新蓝染色显示,大鼠软骨细胞内的糖原异染颗粒亦无明显差异;Ⅱ型胶原免疫组化染色则显示,不同剂量NaF可引起对软骨细胞外Ⅱ型胶原染色积分随剂量的升高逐渐上升（P＜0.05）.结论 NaF对大鼠软骨细胞GAG分泌可能无影响,但可能影响Ⅱ型胶原的分泌.     

低强度脉冲超声对兔关节软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原表达的影响

目的 探讨低强度脉冲超声(LIPUS)对体外培养兔关节软骨细胞增殖及其合成Ⅱ型胶原的影响.方法 选取生长状况良好的第3代兔膝关节软骨细胞,随机分为空白组及3种强度的LIPUS干预组,其超声强度分别为40、50、80mW/cm2,其余作用参数相同,中心频率:1.0 MHz,脉冲重复频率:1.0 KHz,脉冲宽度:200 μs,作用周期:50.各LIPUS干预组每日照射20 min,连续照射3d后,采用CCK-8比色法检测软骨细胞增殖情况,免疫组化染色分析Ⅱ型胶原表达量的变化.结果 强度50、80 mW/cm2的LIPUS干预组软骨细胞增殖较空白组显著增多(P＜0.01),且50 mW/cm2LIPUS的作用最为明显,而40 mW/cm2 LIPUS促软骨细胞增殖效应与空白组相比差异无统计学意义(P =0.249);各强度LIPUS组Ⅱ型胶原表达量均高于空白组(P＜0.01),尤以50 mW/cm2 LIPUS组Ⅱ型胶原表达量增加最为显著,优于40、80 mW/cm2 LIPUS的效应(P＜0.01).结论 LIPUS能够促进体外培养关节软骨细胞增殖,增加软骨细胞Ⅱ型胶原的分泌,且强度为50 mW/cm2时效应较为明显.     

体外培养人胎儿软骨细胞的生物学特性

目的建立人胎儿软骨细胞分离培养、扩增技术体系,研究其体外单层培养条件下的生长特性,探讨胎儿软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性.方法酶消化法获取胎儿软骨细胞,体外培养扩增,经测定细胞生长曲线、群体倍增时间及累计倍增数目,观察细胞生长动力学并确定体外生长规律.通过免疫组织化学检测Ⅱ型胶原分泌,阿利辛蓝比色法测定基质糖胺多糖(GAG)含量.P1细胞接种于聚羟乙酸(PGA)纤维支架,观察两者生物相容性及细胞体外成软骨能力.结果关节软骨细胞形态呈典型的多角形,随着传代的次数增加,逐渐变成"成纤维细胞样"的条梭形.平均倍增时间为74 h.细胞连续培养5代,累计倍增数目为7.83±0.42.P1～P5间接免疫组化Ⅱ型胶原表达阳性,P6不表达.GAG含量P1细胞低于P0细胞,随体外培养时间延长逐渐增加.P1细胞接种于PGA纤维支架,体外培养14 d,组织学观察显示有软骨组织形成.结论胎儿软骨细胞经常规体外培养,至第6代失去分泌软骨特异性基质的功能.P1细胞接种PGA纤维展现良好的生物相容性,初步证实胎儿软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性.     

软骨细胞培养过程中细胞反分化的研究

软骨细胞化生与反分化是关节软骨损伤病理及修复过程中的重要现象,本文主要是研究培养软骨细胞的反分化现象。结果显示:(1)培养的软骨细胞有反分化,传至4代时多数细胞由园形变为棱形,硫酸软骨素丧失。(2)反分化为一渐进过程,传代时,以Ⅱ型胶cDNA探针与培养细胞mRNA原位杂交证明细胞内Ⅱ型前胶原渐减少;Ⅲ型胶原单抗荧光染色显示Ⅲ型胶相反渐增多。(3)Ⅱ、Ⅲ型胶原抗体对培养的软骨细胞有抑制合成DNA、粘多糖及胶原的作用。     

髋关节发育不良髋臼软骨中Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶7表达的改变

目的 检测Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶7(MMP-7)在发育性髋关节发育不良(DDH)早期髋臼软骨中表达的改变情况,探讨Ⅱ型胶原、MMP-7与软骨退变的相关性.方法 兔左下肢作为实验侧,膝关节伸直位、长腿管形石膏固定;右下肢作为对照侧,5周后经X线证实构建DDH动物模型8只.观察实验组和对照组髋臼软骨形态学改变;免疫组化两步法、免疫印迹方法检测Ⅱ型胶原、MMP-7在髋臼软骨中表达的改变.结果 实验组可见有局部软骨细胞簇集,细胞外基质甲苯胺蓝染色有失染现象.免疫组化染色结果显示实验组Ⅱ型胶原和MMP-7阳性染色细胞明显高于对照组.免疫印迹结果显示实验组Ⅱ型胶原和MMP-7蛋白表达量均升高,组间比较差异均有统计学意义(t=2.18,t=2.334,P<0.05).结论 DDH早期髋臼软骨发生退行性变,Ⅱ型胶原、MMP-7高表达,提示Ⅱ型胶原、MMP-7的数量和强度可能与软骨退行性变的程度差异有关.     

体外培养人胎儿软骨细胞的生物学特性

目的 建立人胎儿软骨细胞分离培养、扩增技术体系,研究其体外单层培养条件下的生长特性,探讨胎儿软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法酶消化法获取胎儿软骨细胞,体外培养扩增,经测定细胞生长曲线、群体倍增时间及累计倍增数目,观察细胞生长动力学并确定体外生长规律。通过免疫组织化学检测Ⅱ型胶原分泌,阿利辛蓝比色法测定基质糖胺多糖(GAG)含量。P1细胞接种于聚羟乙酸(PGA)纤维支架,观察两者生物相容性及细胞体外成软骨能力。结果 关节软骨细胞形态呈典型的多角形,随着传代的次数增加,逐渐变成“成纤维细胞样”的条梭形。平均倍增时间为74 h。细胞连续培养5代,累计倍增数目为7.83±0.42。P1-P5间接免疫组化Ⅱ型胶原表达阳性,P6不表达。GAG含量P1细胞低于P0细胞,随体外培养时间延长逐渐增加。P1细胞接种于PGA纤维支架,体外培养14 d,组织学观察显示有软骨组织形成。结论 胎儿软骨细胞经常规体外培养,至第6代失去分泌软骨特异性基质的功能。P1细胞接种PGA纤维展现良好的生物相容性,初步证实胎儿软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。     

胶原凝胶复合CPPf/PLLA支架与软骨细胞的相容性研究

目的研究软骨细胞与胶原凝胶复合CPPf／PLLA支架的细胞相容性,为软骨组织工程提供适宜的种子细胞载体。方法将胶原凝胶包埋的软骨细胞整合入CPPf／PLLA三维支架并进行体外培养,采用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞在支架上粘附、生长和增殖等情况,从组织学和Ⅱ型胶原免疫组化对复合组织进行评价。结果软骨细胞能良好地在支架上粘附、生长和增殖,新形成的组织为透明软骨样组织、细胞外基质有Ⅱ型胶原分布。结论胶原凝胶复合CPPf／PLLA支架具有良好的细胞相容性,可作为软骨细胞栽体。