M5毒蕈碱乙酰胆碱受体参与药物成瘾的研究进展

M5受体是毒蕈碱乙酰胆碱受体家族的一个新成员,是毒蕈碱乙酰胆碱受体家族(M1-M5亚型)最后一个被克隆出来的,属于G蛋白偶联受体。免疫沉淀和mRNA原位杂交实验表明M5受体在中枢神经系统中特定区域表达,包括海马、丘脑、黑质和中脑腹侧背盖区(VTA)部位)[1,2,3]。可是和其他M受体比     

有机磷类杀虫剂对毒蕈碱乙酰胆碱M2受体磷酸化的影响

目的：研究有机磷类杀虫剂（OPs）对G蛋白结合受体激酶-2（GRK2）介导的毒蕈碱乙酰胆碱M2受体磷酸化的影响,进一步揭示有机磷类杀虫剂可能存在的其他作用途径.方法：利用亲和层析方法从猪脑中纯化毒蕈碱乙酰胆碱M2受体;将纯化的毒蕈碱乙酰胆碱M2受体,G蛋白结合受体激酶-2,[γ-p^32]标记的ATP与不同浓度的对氧磷（PO）、氧毒死蜱（CPO）共同保温,聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶片干燥后放射性自显影检测M2受体磷酸化结果.之后将干燥凝胶片中放射性标记的磷酸化M2受体蛋白带剪下,同位素液体闪烁计数器计数.结果：氧毒死蜱（CPO）完全抑制毒蕈碱乙酰胆碱M2受体的磷酸化,其IC50为70 μM;毒死蜱（CPF）也抑制M2受体的磷酸化,而对氧磷（PO）与对硫磷（parathion）不抑制M2受体的磷酸化.结论：不同的OPs对GRK2介导的毒蕈碱乙酰胆碱M2受体的磷酸化有完全不同的作用;毒死蜱阻断M2受体的磷酸化,提示OPs的毒性作用存在其他的可能作用途径.     

对氧磷和氧毒死蜱对大鼠脑毒蕈碱乙酰胆碱M2受体磷酸化的影响

目的研究有机磷类杀虫剂对氧磷（PO）和氧毒死蜱（CPO）对大鼠脑G蛋白偶联受体激酶2介导的毒蕈碱乙酰胆碱M2受体磷酸化的影响。方法制备亲和层析柱;利用亲和层析方法从大鼠脑中纯化毒蕈碱乙酰胆碱M2受体;将纯化的毒蕈碱乙酰胆碱M2受体或β2-肾上腺素受体、G蛋白偶联受体激酶-2、[γ-p32]ATP与对氧磷（PO）、氧毒死蜱（CPO）共同保温,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,放射性自显影检测M2受体磷酸化结果。结果氧毒死蜱完全抑制大鼠脑M2受体的磷酸化,其半数抑制浓度为（IC50）70μmol/L;对氧磷不抑制毒蕈碱乙酰胆碱M2受体的磷酸化;氧毒死蜱和对氧磷都不抑制β-肾上腺素受体的磷酸化。结论氧毒死蜱有选择性地抑制大鼠脑毒蕈碱乙酰胆碱M2受体的磷酸化,说明某些有机磷杀虫剂的毒性作用存在其他靶分子或作用途径。     

长托宁在ICU应用

长托宁(盐酸戊乙奎醚注射液)是一种对中枢和周围神经均具有很强抗胆碱作用的,系新型选择性抗胆碱药,能通过血脑屏障进入脑内.它能阻断乙酰胆碱对脑内毒蕈碱受体(M受体)和烟碱受体(N受体)的激动作用;因此,能较好地拮抗有机磷毒物(农药)中毒引起的中枢中毒症状,如惊厥、中枢呼吸循环衰竭和烦躁不安等.同时,在外周也有较强的阻断乙酰胆碱对M受体的激动作用;因而,能较好地拮抗有机磷毒物(农药)中毒引起的毒蕈碱样中毒症状,如支气管平滑肌痉挛和分泌物增多、出汗、流延、缩瞳和胃肠道平滑肌痉挛或收缩等.它还能增加呼吸频率和呼吸流量,但由于本品对M2受体无明显作用,故对心率无明显影响;对外周N受体无明显拮抗作用.长托宁不但抗胆碱作用强,而且作用全面、持续时间长,同时具有高度选择性M1、M3受体拮抗作用,而对M2受体无明显作用,毒副作用较小,近年来我科在ICU主要用于:     

正常豚鼠胆囊平滑肌M受体亚型mRNA表达的研究

目的 研究M受体亚型mRNA在正常豚鼠胆囊平滑肌的表达.方法 10周龄白化豚鼠10只,RT-PCR检测胆囊平滑肌M受体亚型mRNA的表达.结果 豚鼠胆囊平滑肌有M受体4种亚型mRNA的表达,各亚型mRNA表达从强到弱顺序依次为M3、M2、M4及M1,无M5受体mRNA的表达.M3与M2受体mRNA的表达量差异无显著性(P＞0.05),M3、M2受体mRNA的表达量分别与M4和M1受体mRNA的表达量相比,差异均有显著性(P＜0.05).结论 胆囊平滑肌有4种M受体亚型mRNA表达即M1～M4,提示这4种亚型可能均参与迷走神经递质乙酰胆碱激发的胆囊收缩.     

NOS抑制剂和MK-801对吗啡依赖大鼠脊髓和脑干毒蕈碱型受体表达的影响

目的观察NMDA受体拮抗剂和NOS抑制剂对吗啡依赖大鼠毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型表达的影响.方法 RT-PCR方法检测m1-5mRNA水平.结果吗啡依赖大鼠脊髓注射纳洛酮1h后脊髓m1、m2、m3 和m4及脑干m1表达较依赖组减少,MK801(0.125 mg*kg-1)处理后脊髓m2 、m3和m5 以及脑干m2 和m5表达增加,脊髓和脑干m1 和m4表达减少;NOS抑制剂 L-NAME(10 mg*kg-1)处理后脊髓和脑干m1、m3 、m5受体表达减少.结论 NMDA受体拮抗剂以及NOS抑制剂对M 受体亚型基因调控是控制戒断症状的机制之一.     

NOS抑制剂和MK—80l对吗啡依赖大鼠脊髓和脑干毒蕈碱型受体表达的影响

目的　观察NMDA受体拮抗剂和NOS抑制剂对吗啡依赖大鼠毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型表达的影响。方法　RT PCR方法检测m1 5mRNA水平。结果　吗啡依赖大鼠脊髓注射纳洛酮 1h后脊髓m1 、m2 、m3和m4 及脑干m1 表达较依赖组减少 ,MK80 1 (0 .1 2 5mg·kg- 1 )处理后脊髓m2 、m3和m5以及脑干m2 和m5表达增加 ,脊髓和脑干m1 和m4 表达减少 ;NOS抑制剂L NAME(1 0mg·kg- 1 )处理后脊髓和脑干m1 、m3、m5受体表达减少。结论　NMDA受体拮抗剂以及NOS抑制剂对M受体亚型基因调控是控制戒断症状的机制之一。     

M受体亚型及消化道功能紊乱时的受体变化

1914年Dale根据胆碱能神经元末梢释放的神经递质乙酰胆碱对细胞表面受体作用的不同,将其分为毒蕈碱受体(M受体)和烟碱样受体(N受体)两类。N受体广泛分布于组织,在横纹肌、自主神经节及中枢神经系统中发挥N样调节作用。,由于N受体对阻断剂反应不同,N受体又分为N_1和N_2受体。M受体参与许多重要的生理过程,如神经-神经传导、平滑肌收缩及腺体分泌等,临床上它们在许多病理过程中发挥重要作用。M受体激动剂和拮抗剂在治疗疾病过     

慢性间歇性缺氧对海马齿状回神经再生的影响

目的 研究慢性间歇性缺氧对大鼠海马齿状回细胞增殖及突触形成的影响。方法 建立SD大鼠慢性间歇性缺氧模型,检测海马齿状回细胞增殖、突触素表达、乙酰胆碱M1受体及N-甲基-D-天门冬氨酸受体1(NR1)水平。结果 与正常对照组相比,慢性间歇性缺氧模型大鼠海马齿状回BrdU光密度值(OD值)、突触素OD值、乙酰胆碱M1受体OD值及N-甲基-D-天门冬氨酸受体10D值均显著增高(均P<0.05)。结论 慢性间歇性缺氧诱导了海马齿状回的细胞增殖,同时使突触素、乙酰胆碱M1受体和N-甲基-D-天门冬氨酸受体1表达增加,可能与缺氧诱导的海马齿状回神经细胞代偿性增加有关。     

胆碱能抗炎通路在消化系疾病方面的研究进展

胆碱能抗炎通路的分子机制是迷走神经受刺激,大量乙酰胆碱释放,并与免疫细胞表面的特异受体结合,从而发挥一系列抗炎效应。乙酰胆碱受体分为毒蕈碱(M)和烟碱(N)受体,其中N受体作为神经递质受体大家族之一,其α7亚单位是胆碱能抗炎通路下调细胞因子合成的关键受体亚单位,也是发挥抗炎效应的主要受体。胃肠道同样分布有胆碱能受体,研究其在胃肠疾病及损伤方面的作用和机制将为消化系病的药物开发和防治带来新的契机。     

新蛋白质合成介导知母活性成分对M2受体稳定性的调节作用

目的 探讨知母活性成分ZMS提高CHOm2细胞毒蕈碱样乙酰胆碱2型受体 (M2受体) mRNA表达的机制.方法 体外培养至80% ～90%融合的CHOm2细胞分为ZMS 1组(单纯添加1×10-5 mol/L ZMS作用24 h)、ZMS 2组(添加1×10-5 mol/L ZMS作用24 h后加入1 μg/mL环己酰亚胺作用12 h)、ZMS 3组(加入1 μg/mL 环己酰亚胺预处理4 h后加入1×10-5 mol/L ZMS作用24 h),以上各组分别设立对照组(以等体积DMSO替代ZMS,其他处理与相应ZMS组相同).各组细胞培养基中均加入放线菌素D抑制mRNA合成,于不同时间点收集CHOm2细胞,Real-time PCR检测M2受体mRNA相对表达量并计算半衰期.结果 与相应对照组比较,ZMS 1组和ZMS 2组CHOm2细胞M2受体mRNA的半衰期明显延长,分别为(4.75±0.54)h vs(2.13±0.23)h和(5.43±1.13)h vs (2.46±0.09) h(均P<0.05);添加1 μg/mL 环己酰亚胺预处理的ZMS 3组CHOm2细胞M2受体mRNA半衰期的(3.06±0.23)h与其相应对照组的(3.00±0.20)h比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 ZMS提高M2受体mRNA的稳定性需要有新蛋白质合成的参与.     

M受体亚型阻断剂对大鼠尾核痛抑制神经元放电的影响

目的 研究侧脑室注射M1、M3、M4受体亚型阻断剂对乙酰胆碱(ACh)引起的大鼠尾核痛抑制神经元(PIN)电活动的影响.方法 以电脉冲刺激左侧坐骨神经作为伤害性刺激,用玻璃微电极细胞外记录大鼠尾核PIN放电的变化,观察侧脑室注射不同M受体亚型阻断剂对其影响.结果 ①脑室注射ACh(20μg/10μL)加强了尾核痛抑制神经元的电活动;②M1受体阻断剂哌仑西平(10μg/10μL)可部分阻断ACh的作用.而M3受体阻断剂4-DAMP和M4受体阻断剂托品酰胺对ACh的镇痛效应无明显作用.结论 乙酰胆碱在尾核中起镇痛作用,其镇痛机制主要涉及M1受体.     

新蛋白质合成介导知母活性成分对M_2受体稳定性的调节作用

目的 探讨知母活性成分ZMS提高CHOm2细胞毒蕈碱样乙酰胆碱2型受体 (M_2受体) mRNA表达的机制.方法 体外培养至80% ～90%融合的CHOm2细胞分为ZMS 1组(单纯添加1×10~(-5) mol/L ZMS作用24 h)、ZMS 2组(添加1×10~(-5) mol/L ZMS作用24 h后加入1 μg/mL环己酰亚胺作用12 h)、ZMS 3组(加入1 μg/mL 环己酰亚胺预处理4 h后加入1×10~(-5) mol/L ZMS作用24 h),以上各组分别设立对照组(以等体积DMSO替代ZMS,其他处理与相应ZMS组相同).各组细胞培养基中均加入放线菌素D抑制mRNA合成,于不同时间点收集CHOm2细胞,Real-time PCR检测M_2受体mRNA相对表达量并计算半衰期.结果 与相应对照组比较,ZMS 1组和ZMS 2组CHOm2细胞M_2受体mRNA的半衰期明显延长,分别为(4.75±0.54)h vs(2.13±0.23)h和(5.43±1.13)h vs (2.46±0.09) h(均P<0.05);添加1 μg/mL 环己酰亚胺预处理的ZMS 3组CHOm2细胞M2受体mRNA半衰期的(3.06±0.23)h与其相应对照组的(3.00±0.20)h比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 ZMS提高M2受体mRNA的稳定性需要有新蛋白质合成的参与.     

应用放射性免疫方法建立抗早老性痴呆药的M1受体筛选模型

目的 :建立M1受体筛选模型 ,用于抗早老性痴呆药物的筛选。方法 :在人胚肾细胞上表达人源M1受体 ,通过检测胞内cAMP来监测受体的激动情况。使用外源性的3H cAMP竞争胞内的cAMP结合位点。使用氯化乙酰胆碱作为阳性药来确证模型的可靠性。结果 :初步建立了M1受体人胚肾细胞表达体系。使用不同浓度的氯化乙酰胆碱 (10 -9～ 10 -4mol/L) ,胞内的cAMP浓度有相关性变化 (10 3 43× 10 -4 ～ 3 3 75 4× 10 -4 pmol/ μl)。 结论 :本筛选模型对M1受体激动剂有阳性反应 ,可用于抗早老性痴呆药物的筛选     

有机磷类杀虫剂存在其他作用靶分子

目的：研究有机磷类杀虫剂对大鼠脑G蛋白偶联受体激酶2介导的毒蕈碱乙酰胆碱m2受体磷酸化的影响,揭示有机磷类杀虫剂存在的其他作用靶分子或作用途径.方法：制备亲和层析柱;利用亲和层析方法从大鼠脑中纯化毒蕈碱乙酰胆碱m2受体;将纯化的毒蕈碱乙酰胆碱m2受体或β-肾上腺素受体,G蛋白偶联受体激酶-2,[γ-p32]ATP与对氧磷（PO）、氧毒死蜱（CPO）共同保温,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,放射性自显影检测m2受体磷酸化结果.结果：氧毒死蜱完全抑制大鼠脑m2受体的磷酸化,其半数抑制浓度为（IC50）70μmol/L;对氧磷不抑制m2受体的磷酸化;氧毒死蜱和对氧磷都不抑制β-肾上腺素受体的磷酸化.结论：氧毒死蜱有选择性地抑制大鼠脑m2受体的磷酸化,说明某些有机磷杀虫剂的毒性作用存在其他靶分子或作用途径.     

人食管下括约肌毒蕈碱受体的表达

目的：研究毒蕈碱受体亚型在人食管下括约肌（LES）套索纤维和钩状纤维的表达,对LES胆碱能收缩机制作进一步分析．方法：选取高位食管中段癌,行食管大部切除术患者12例,取食管胃接合部标本分离套索纤维和钩状纤维．分别应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白印记（Western Blot）检测5种M受体亚型在两种肌纤维中mRNA和蛋白的表达．结果：不同M受体亚型mRNA在两种肌纤维的表达有统计学差异（P〈0．05）,从数据观察5种受体亚型mRNA表达从强到弱顺序依次为M2,M3,M1,M4,M5;同一受体mRNA在两种肌纤维间表达无统计学差异;不同M受体亚型蛋白在两种肌纤维表达有统计学差异（P〈0．05）,5种受体亚型蛋白表达强弱同mRNA;同一受体在两种肌纤维间蛋白表达无差异．结论：5种M受体亚型mRNA和蛋白在两种肌纤维均有表达,M2受体表达量最高,其它依次是M3,M1,M4和M5受体;相同受体在两种肌纤维间mRNA和蛋白的表达相同．     

乙醇对小鼠认知能力的影响及其与海马M1受体的关系

目的：研究乙醇对小鼠认知能力的影响及其与小鼠海马结构M1毒蕈碱型乙酰胆碱受体（M1受体）含量变化的关系,进一步揭示乙醇引起脑损伤的机制。方法将60只雌性小鼠随机分为对照组、8%、16%、32%乙醇给药组,以0.2 mL/10 g给药8周后,Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力,ELISA法检测各组小鼠海马结构中M1受体含量的差异。结果与各自第1天比较,各实验组小鼠第5天逃避潜伏期均值均明显缩短。各乙醇组小鼠第5天逃避潜伏期均值与对照组第5天均值比较,无统计学差异。16%、32%乙醇组小鼠在靶象限活动时间明显短于对照组。各乙醇组小鼠海马结构内M1受体含量与对照组比较明显下降,且与乙醇摄入量呈剂量依赖关系。结论海马结构M1受体含量降低是乙醇引起小鼠记忆能力下降的原因之一。     

乙酰胆碱和异丙肾上腺素在慢传输性便秘发生中的作用

目的　探讨慢传输性便秘病人乙状结肠中的M、β受体的变化 ,离体结肠肌条对乙酰胆碱和异丙肾上腺素的反应。方法　选择 9例慢传输性便秘病人为便秘组 ,对照组 7例 ,采用M、β受体的受体放射分析法 ,电刺激离体肌条收缩反应方法。结果　便秘组乙状结肠平滑肌细胞膜M、β受体的最大结合数目显著低于对照组 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1) ,解离常数无明显变化 (P >0 .0 5 )。便秘组病人乙状结肠肌条频率和振幅显著低于对照组 (纵行肌P <0 .0 5 ,环行肌P <0 .0 1)。应用乙酰胆碱和异丙肾上腺素后 ,慢传输性便秘病人纵行和环行肌收缩波振幅显著低于对照组 (P <0 .0 1)。而离体肌条的收缩频率与对照组相比无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论　慢传输性便秘病人结肠细胞膜M、β受体的变化 ,是引起慢传输性便秘病人结肠的动力学改变的重要因素之一。乙酰胆碱和异丙肾上腺素参与了慢传输性便秘结肠的动力学的调节     

乙酰胆碱及其受体亚型阻滞剂对大鼠皮层体感区Ca2+,Mg2+-ATP酶活性的影响

目的 观察脑室注射乙酰胆碱及其受体亚型阻滞剂对大鼠皮层体感区Ca2 ,Mg2 -ATP酶活性的影响,探讨乙酰胆碱中枢作用的可能机制.方法 脑室注射ACh及其受体亚型阻滞剂后,采用定磷法检测Wistar大鼠皮层体感区Ca2 ,Mg2 -ATP酶活性.结果 ①脑室注射20μg/10μl的乙酰胆碱可使Ca2 ,Mg2 -ATP酶活性由脑室注射等量生理盐水的(8.271±1.298)μmolpi/mgprot升高到(16.444±3.270)μmolpi/mgprot(P＜0.05,n=5);②两侧脑室同时分别注射6.4μg/10μl N受体阻滞剂维库溴铵和乙酰胆碱可使Ca2 ,Mg2 -ATP酶活性由脑室注射乙酰胆碱的(16.444±3.270)μmolpi/mgprot降低到(8.854±1.366)μmolpi/mgprot(P＜0.05,n=5);③两侧脑室同时分别注射3.5μg/10μl M1受体阻滞剂哌仑西平和乙酰胆碱或分别注射4.5μg/10μl M3受体阻滞剂4-DAMP和乙酰胆碱均可使Ca2 ,Mg2 -ATP酶活性不同程度降低,但与脑室单独注射乙酰胆碱相比无显著差异(P＞0.05,n=5).结论 乙酰胆碱在大鼠大脑皮层体感区的效应,主要是通过N型受体实现的.     

正常幼龄豚鼠巩膜组织毒蕈碱受体五种亚型的表达

目的 探讨正常幼龄豚鼠眼巩膜组织毒蕈碱受体(M受体)五种亚型的表达.方法 2周龄三色豚鼠6只,RT-PCR检测巩膜组织M受体亚型的mRNA的表达,免疫荧光法染色检测M受体的蛋白水平的表达.结果 豚鼠巩膜组织中有M受体五种亚型mRNA的表达,其中以M1亚型的表达最高.激光共聚焦显微镜观察发现,在巩膜基质中可见到M受体五种亚型的表达绿色荧光,围绕在成纤维细胞核周围.结论 豚鼠巩膜组织中存在M受体五种亚型,提示M受体参与调控眼球的生长.