人黑皮素4受体F261S突变基因的克隆和功能验证

目的　研究黑皮素 4受体(MC_4R)基因的新突变F261S是否造成了MC4R蛋白功能改变。方法　用携带F261S纯合突变的先证者及正常人的基因组DNA,PCR扩增突变型及野生型MC4R基因全长,克隆到topo -TA真核表达质粒载体,测序鉴定后转染人胚肾 293细胞。用浓度为 1×10-11 ~1×10-5 mmol/L的α -黑色素细胞刺激素(α- MSH)与表达的MC4R蛋白结合后,用双荧光素酶报告基因测试系统检测胞内cAMP,萤火虫荧光 /海洋腔肠荧光二者强度之比体现了cAMP浓度。结果　α- MSH浓度在 1×10-9 ~1×10-8 mmol/L时野生型胞内双荧光强度比值显著高于突变型细胞(P<0 .05),在 1×10-7 ~1×10-5 mmol/L时差异更为显著 (P<0 .01)。结论　F261S突变使MC_4R介导的信号转导能力下降,此突变与中国人早发性肥胖有关。     

正常豚鼠胆囊平滑肌M受体亚型mRNA表达的研究

目的 研究M受体亚型mRNA在正常豚鼠胆囊平滑肌的表达.方法 10周龄白化豚鼠10只,RT-PCR检测胆囊平滑肌M受体亚型mRNA的表达.结果 豚鼠胆囊平滑肌有M受体4种亚型mRNA的表达,各亚型mRNA表达从强到弱顺序依次为M3、M2、M4及M1,无M5受体mRNA的表达.M3与M2受体mRNA的表达量差异无显著性(P＞0.05),M3、M2受体mRNA的表达量分别与M4和M1受体mRNA的表达量相比,差异均有显著性(P＜0.05).结论 胆囊平滑肌有4种M受体亚型mRNA表达即M1～M4,提示这4种亚型可能均参与迷走神经递质乙酰胆碱激发的胆囊收缩.     

应用放射配基结合法研究黄连素对α~1和β肾上腺素能受体的作用

本文报告黄连素与放射配基3H-prazosin和3H-DHA竞争结合α_1受体和β_1受体的实验。结果显示黄连素对α-1受体具有很强的亲和力(IC50为4.15×10~(-7),其作用强度与经典的酚妥拉明相似(IC50为2.65×10~(-1)M);对β受体具有微弱的亲和力(IC50为1.59×10~(-5)M)。上述结果提示黄连素可通过α受体及β受体而产生药理作用。     

中药呆聪液对老龄痴呆大鼠模型脑组织M1,M3受体mRNA水平影响的研究

目的探讨呆聪液对痴呆大鼠模型脑内M1、M3受体基因表达的影响。方法选用22月龄的老龄大鼠，用海人酸破坏脑基底核法，造成学习和记忆功能障碍的痴呆动物模型，通过水迷宫法和反转录聚合酶链反应（RT-PCR）观察了呆聪液时痴呆模型大鼠学习记忆能力和脑内M1，M3受体基因表达的影响。结果老龄痴呆模型大鼠学习记忆能力下降，脑内M1，M3基因表达增强呆驱液中剂量组和高剂量组与痴呆模型组比较，差异有显著性（P〈0．05），都能明显提高学习记忆能力．提高脑内M1，M3受体mRNA含量，并有一定的量效关系。结论呆聪液能改善老龄痴呆大鼠的学习和记忆功能并提高M1，M3受体基因的表达。     

肌醇磷脂第二信使系统

<正> 1 引言最先发现的第二信使(ⅡM)是cAMP,近几年来又发现了新的第二信使系统一肌醇磷脂系统. 通常胞外界质中Ca~(2+)浓度约10~(-3)M,胞内Ca~(2+)总浓度也大约10~(-3)M,但大多数胞内游离Ca~(2+)浓度极低,仅有10~(-3)M.这是由于胞内Ca~(2+)一部分和蛋白质分子结合,另有一大部分贮存在细胞器内(内质网和线粒体为主).在相当多的细胞识别系统中,配体(基)和受体相互作用,首先     

M受体亚型阻断剂对大鼠尾核痛抑制神经元放电的影响

目的 研究侧脑室注射M1、M3、M4受体亚型阻断剂对乙酰胆碱(ACh)引起的大鼠尾核痛抑制神经元(PIN)电活动的影响.方法 以电脉冲刺激左侧坐骨神经作为伤害性刺激,用玻璃微电极细胞外记录大鼠尾核PIN放电的变化,观察侧脑室注射不同M受体亚型阻断剂对其影响.结果 ①脑室注射ACh(20μg/10μL)加强了尾核痛抑制神经元的电活动;②M1受体阻断剂哌仑西平(10μg/10μL)可部分阻断ACh的作用.而M3受体阻断剂4-DAMP和M4受体阻断剂托品酰胺对ACh的镇痛效应无明显作用.结论 乙酰胆碱在尾核中起镇痛作用,其镇痛机制主要涉及M1受体.     

稳定转染H3受体基因的HEK293细胞株的鉴定及新型非咪唑类H3受体拮抗剂的筛选

目的:鉴定转染大鼠组胺H3受体基因的HEK293细胞株受体表达情况,筛选具有H3受体拮抗活性的新型非咪唑类化合物。方法:利用RT-PCR和免疫印迹的方法检测转染细胞株组胺H3受体的表达,以阳性刺激物forskolin诱导细胞内cAMP含量升高为指标,初步筛选具有拮抗作用的化合物。结果:细胞鉴定结果显示,稳定转染H3受体基因的HEK293细胞株高表达大鼠H3受体。H3受体选择性激动剂(R)-α-甲基组胺可浓度依赖性抑制阳性刺激物forskolin(10μmol/L)诱导的cAMP含量升高(P<0.05),当(R)-α-甲基组胺浓度达到30 nmol/L时,抑制率接近平台值(P>0.05)。而H3受体拮抗剂噻普酰胺和新合成的非咪唑类化合物XHA23及XHA25则能够浓度依赖性阻断(R)-α-甲基组胺对forskolin诱导的cAMP含量升高的抑制作用(P<0.05),IC50分别为3.62μmol/L、0.49μmol/L、0.14μmol/L。结论:高表达H3受体的HEK293细胞株可用于有H3受体拮抗活性化合物的筛选,而非咪唑类化合物XHA23和XHA25具有一定的H3受体拮抗剂样活性。     

M5毒蕈碱乙酰胆碱受体参与药物成瘾的研究进展

M5受体是毒蕈碱乙酰胆碱受体家族的一个新成员,是毒蕈碱乙酰胆碱受体家族(M1-M5亚型)最后一个被克隆出来的,属于G蛋白偶联受体.免疫沉淀和mRNA原位杂交实验表明M5受体在中枢神经系统中特定区域表达,包括海马、丘脑、黑质和中脑腹侧背盖区(VTA)部位)[1,2,3].可是和其他M受体比较,M5受体表达水平较低,在脑内占M1-M5受体总表达不到2%.近来,M5受体在一些外周组织和细胞中也检测到.     

茛菪烷衍生物的合成及其活性研究

目的 设计、合成并筛选具有胆碱能活性,且对M1受体有选择性的莨菪烷衍生物.方法 以3α-羟基-6β-乙酰氧基莨菪烷为原料,通过酰化反应制备3α-烃氧基乙酰氧基-6β-乙酰氧基莨菪烷类衍生物,通过核磁共振及质谱鉴定所合成的化合物.运用豚鼠离体回肠纵肌M受体动力学实验方法以及人源M1,M2受体亚型基因转染的CHO细胞系放射配基受体结合法,对合成的化合物进行活性筛选.结果 制备了6个新的3α-烃氧基乙酰氧基-6β-乙酰氧基莨菪烷a～f.化合物d,e对M受体有良好的亲和力及内在活性,并对M1受体具有亚型选择性.结论 化合物d,e为具有M1受体亚型选择性的胆碱能活性化合物.     

毒蕈碱样乙酰胆碱受体信号转号转导机制研究进展

M受体是与G蛋白相偶联的受体。激动剂作用于M1、M3和M5受体亚型经Gq/11蛋白激活PLC-β，加速PIP2水解，激动剂作用于M2和M4受体亚型经Gi蛋白抑制腺苷酸环化酶活性，使cAMP产量降低。近来发现，激动剂持续作用可使M受体发生脱敏，内化等一系列生理反应，进而导致G蛋白介导的信号转导终止和M受体循环再利用。     

HEK293细胞上表达的人类超极化激活环核苷酸门控钾通道亚型2和亚型4的电生理

目的将人类超极化激活环核苷酸门控钾通道亚型2（hHCN2）和亚型4（hHCN4）的基因表达于HEK293细胞系上,观察其表达的通道的电生理特点。方法包含目的基因hHCN2或hHCN4的cNDA亚克隆到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,穿梭载体和病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌重组,病毒经过包装和扩增后分别转染HEK293细胞。利用全细胞膜片钳技术,记录分别转染了hHCN2和hHCN4的HEK293细胞上的超极化激活钾电流（If）。结果转染hHCN2和hHCN4的HEK293细胞上产生超极化激活的内向电流。两种通道的半数最大激活电压分别为-114．8mV±3．3mV和-125．9mV±2．9mV,反向曲线斜率分别为11．1mV±1．2mV和13．7mV±1．3mV。两者的激活动力学明显不同,刺激电压为一110mV时,通道的激活时间常数分别为0．99s±0．21s和8．47s±2．85s。两种通道对钠离子和钾离子的相对通透性分别为0．40和0．34。两种电流均可被2mmol／L的氯化铯（CsCI）阻断。结论目的基因hHCN2和hHCN4在HEK293细胞上成功表达,形成的两种通道具有明显不同的激活动力学。     

大鼠GPR17基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

目的:构建大鼠GPR17(rGPR17)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并对其功能进行初步研究.方法:从大鼠脑组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增rGPR17 cDNA,与载体pcDNA3.1(+)连接,并转化到大肠杆菌DH5α以获得重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,以PCR、双酶切和测序鉴定;将重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17通过脂质体转染方法,转染HEK293细胞,RT-PCR、免疫荧光法检测rGPR17的表达,Fluo-4测定激动剂LTD_4处理后细胞内钙变化.结果:RT-PCR、双酶切和测序证明,重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17构建成功,并在HEK293细胞获得表达,加入外源性激动剂LTD_4可诱导细胞内钙的增加.结论:成功构建了rGPR17的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并在HEK293细胞功能性表达,为GPR17受体及其拮抗剂的研究提供了基础.     

过表达TrxR1重组HEK293细胞株的构建和鉴定

目的 构建稳定过表达硫氧还蛋白还原酶1（TrxR1）的HEK293细胞株,为TrxR1的功能研究以及靶向TrxR1药物筛选提供细胞模型。方法 通过PCR扩增,连接转化以及Sanger双脱氧测序构建并筛选出TrxR1的重组慢病毒表达载体pLVX-PuroTXNRD1,转染HEK293细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定转染细胞株。后续研究分为3组进行：①TrxR1过表达HEK293细胞：pLVX-Puro-TXNRD1载体稳定转染细胞;②对照HEK293细胞：pLVX-Puro空载病毒载体稳定转染细胞;③正常HEK293细胞;通过RT-qPCR、Western blot实验检测上述3组细胞中TrxR1的mRNA以及蛋白表达情况;通过胰岛素终点法以及TRFS-green探针成像检测上述3种细胞内TrxR1的酶活力;通过CCK8实验检测上述3种细胞对TrxR1特异性抑制剂auranofin的敏感性。结果 构建载体经DNA测序,成功获得插入TrxR1的重组慢病毒表达载体pLVX-Puro-TXNRD1。与HEK293以及HEK293-NC细胞相比,HEK293-TrxR1-OE细胞中TrxR1的mRNA和蛋白高表达,且酶活力也同样显著上升（P<0.005）;而与HEK293以及HEK293-NC细胞相比,auranofin对HEK293-TrxR1-OE细胞中TrxR1酶活力以及细胞增殖的抑制效率均显著下降（P<0.005）。结论 通过构建pLVX-Puro-TXNRD1慢病毒载体,成功获得过表达TrxR1酶的HEK293细胞株,该细胞对特异性靶向TrxR1的抑制剂的抗增殖作用具有抵抗,因而可用于靶向TrxR1药物的筛选。     

呼吸道合胞病毒感染大鼠脊髓背根节信号转录因子的研究

目的：研究反复呼吸道合胞病毒（RSV）感染大鼠脊髓背根节感觉神经细胞转录因子的活化状态变化。 方法：1～2周龄 SD大鼠幼鼠共80只,区组随机分为对照组和RSV感染组,每组40只。 RSV感染组采用每周1次RSV(浓度5 ×105 U/mL)滴鼻法制作RSV慢性感染模型,对照组采用无病毒培养上清液滴鼻。8周后每组取5只大鼠进行气道反应性测定。原位杂交检测肺组织RSV RNA以证明呼吸道合胞病毒感染模型的可靠性。用TranSignal蛋白质/DNA活性芯片筛选C7~T5脊髓背根节组织中活性改变的转录因子。Western印迹对筛选结果中改变最明显的因子进行验证。结果：RSV感染组气道阻力增幅显著大于对照组(P＜0.05)。原位杂交显示RSV感染组肺组织有大量呼吸道合胞病毒存在,HE染色示肺部存在明显炎症细胞浸润,说明呼吸道合胞病毒感染模型建立成功。TranSignal蛋白/DNA组合芯片检测筛选：RSV反复感染大鼠背根节55个转录因子活性上调(RSV感染组/对照组>2),43个活性下调(RSV感染组/对照组<0.5)。Western印迹验证结果与芯片结果一致,并进一步明确蛋白/DNA组合芯片筛选的IRF转录因子是IRF-1,而不是IRF-2。结论：反复RSV感染可引起气道反应性增高和脊髓背根节感觉神经细胞内多种转录因子活性发生改变,可能与气道反应性增高的神经调控异常有关。     

表达AQP4不同亚型的细胞系检测AQP4抗体敏感性的研究

【目的】 研究表达不同亚型的AQP4细胞系检测中国人群视神经脊髓炎患者血清中AQP4抗体的敏感性? 【方法】 根据纳入标准共获取血清205例,其中包括视神经脊髓炎40例,长节段性脊髓炎39例,复发性视神经炎39例,多发性硬化47例,另设40例健康对照?使用稳定表达水通道蛋白4的四种细胞系HEK293/pcDNA3.1(+)-M23-AQP4?HEK293/pcDNA3.1(+)-M1-AQP4、HEK293/pEGFP-N3-M23-AQP4?HEK293/pEGFP-N3-M1-AQP4通过细胞间接免疫荧光法分别检测以上血清中的AQP4抗体?【结果】 NMO-IgG普遍存在于视神经脊髓炎疾病谱中?AQP4抗体同AQP4两种亚型结合敏感性比较发现,M23-AQP4的敏感性高于M1-AQP4?同时绿色荧光蛋白作为标签蛋白,可能干扰抗体同AQP4的结合?【结论】M23-AQP4作为靶抗原检测血清中AQP4抗体优于M1-AQP4, 临床中采用细胞间接免疫荧光法对抗体进行检测时应首选表达M23-AQP4亚型的细胞系进行检测?     

二型谷氨酸羧肽酶口服基因疫苗的制备及其降低大鼠麻醉药用量的初步研究

目的　研制携带二型谷氨酸羧肽酶 (GCPⅡ )的口服疫苗 ,探讨该疫苗对大鼠麻醉药用量的影响。方法　采用聚合酶链反应、酶切连接和蓝白筛选的方法 ,构建GCPⅡ的表达载体 ;用磷酸钙共沉淀的方法转染HEK2 93细胞 ,G4 18筛选阳性细胞克隆 ;逆转录聚合酶链反应和免疫荧光细胞染色的方法鉴定阳性细胞株 ;氯化钙法制备携带GCPⅡ表达载体的减毒鼠伤寒沙门氏菌口服疫苗(SL GCPⅡ ) ;采用原代培养的巨噬细胞吞噬SL GCPⅡ的方法 ,观察疫苗的体外表达情况 ;将 5 0只雄性SD大鼠随机分为A、B 2组 ,每组 2 5只 ,2组鼠的体重分别为 ( 174 g±13g)和 ( 172 g± 11g) ,差异无显著意义 (P =0 0 72 )。A组胃内灌注 6 0 0 μL、OD2 60 0 6SL GCPⅡ ,两周内 4次给药 ;B组为对照组 ,给予SL32 6 1,剂量和方法与A组相同。采用免疫荧光的方法检测大鼠循环中GCPⅡ抗体滴度 ,观察麻醉药戊巴比妥钠的用量。结果　扩增GCPⅡ基因并构建了含有GCPⅡ基因的表达载体———pCDNA3 1 GCPⅡ ;建立了细胞株HEK 2 93 GCPⅡ ;体外实验证明培养的巨噬细胞吞噬SL GCPⅡ后 ,能够有效表达GCPⅡ基因。体内实验发现口服疫苗能够激活 2 2 / 2 5只SD大鼠产生GCPⅡ抗体 ,实验组麻醉药戊巴比妥钠的用量 ( 36 9mg/kg± 1 6mg/kg)显著低于对照组 ( 4 0 8m     

半胱氨酰白三烯受体2拮抗剂筛选方法的建立及化合物初筛

目的:建立半胱氨酰白三烯受体2(CysLT_2受体)拮抗剂筛选的细胞模型及方法,初筛系列合成化合物.方法:选用高表达CysLT_2受体的大鼠C6胶质瘤细胞,激动剂LTD_4攻击后检测细胞内钙浓度变化,作为CysLT_2受体拮抗剂的筛选方法,初步筛选有拮抗剂活性的化合物.采用CysLT1/CysLT_2受体非选择性拮抗剂Bay u9773和CysLT_2受体选择性拮抗剂AP-100984作为参照.结果:RT-PCR鉴定表明C6细胞高表达CysLT_2受体.LTD_4 1 μmol/L能显著升高C6细胞内钙,其作用约为阳性对照ATP的37 5%.CysLT_2受体拮抗剂抑制LTD_4诱导的C6细胞内钙升高,CysLT_1受体选择性拮抗剂无抑制作用.化合物中DXW-1、2、13、23、29、30能抑制LTD_4诱导的细胞内钙升高.结论:LTD_4诱导的C6细胞的钙信号变化可作为CysLT_2受体拮抗剂的筛选方法;化合物DXW-1、2、13、23、29、30具有CysLT_2受体拮抗活性.     

人干细胞因子受体膜外区1～3免疫球蛋白样结构域的表达、纯化及活性

目的在原核和真核细胞中表达人干细胞因子受体(c-Kit)配体结合区膜外N端1~3免疫球蛋白样结构域(c-Kit/Ig1~3),研究其配体结合活性。方法采用重叠延伸PCR定点诱变法合成c-Kit/Ig1~3双突变片段(c-Kit/Ig1~3DM),构建pET16b-c-Kit/Ig1~3DM表达质粒,转化E·coliBL21(DE3)诱导表达,稀释复性,镍柱纯化。将C端添加组氨酸标签的c-Kit/Ig1~3基因克隆入真核表达载体pEAK12中,转染HEK293ET细胞构建c-kit/Ig1~3高效表达细胞株,从细胞培养上清中使用镍金属螯合柱收集纯化蛋白。His-tag pull-down和酶联免疫结合实验检测融合蛋白配体结合活性。结果在大肠杆菌中c-Kit/Ig1~3DM以包涵体形式表达,复性后配体结合活性很低。在HEK293ET细胞中筛选到2个高效表达c-Kit/Ig1~3的细胞株,上清表达量为2μg/ml,融合蛋白相对分子质量为58000;受体配体结合实验显示真核表达的c-Kit/Ig1~3有明显的干细胞因子特异结合活性,解离常数Kd值为9·39nmol/L。结论获得了具有较高配体结合活性的c-Kit/Ig1~3融合蛋白。     

TLR4-2242 T→C variant increases transcriptional activity of its promoter

Objective： To investigate the effects of-2242, 1892 and -1837 single nucleotide polymorphisms （SNPs） on toll-like receptor 4 （TLR4） promoter activity. Methods： Polymerase chain reaction （PCR） and site direct mutation technology were used to construct TLR4 basic promoter and -2242C, -1892A and -1837G mutate promoter plasmids. Dual-Luciferase Reporter assay system was used to detect the activity of constructed promoter following human embryonic kidney （HEK） 293 cells were transiently cotransfected with the constructed plasmids and the control plasmid pRL-CMV. Results： In HEK293 cells, the activity of-2242C mutate promoter was higher than -2242T promoter, and there was no significant difference when both -1892A and -1837G mutate promoter compared with -1892G and -1837A promoter, respectively. Conclusion： It is implied that -2242T→C base variation can enhance the activity of TLR4 promoter, while -1892 and -1837 SNPs have no effect on TLR4 promoter activity.