骨成形蛋白7对大鼠肝星状细胞增殖的抑制作用

目的 研究骨成形蛋白7 (BMP7)对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖的抑制作用.方法 体外培养HSC-T6细胞,分为对照组、TGFβ1组、TGFβ1+ BMP7组和TGFβ1+ BMP7+ Noggin组.RT-PCR法检测果蝇蛋白质1(smad1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、gremlin和纤维连接蛋白(FN)mRNA的表达,Western印迹法检测磷酸化smad1/5/8(P-smad1/5/8)、α-SMA、gremlin蛋白的表达.采用单因素方差分析、LSD检验、Dunnett T3检验和Pearson直线相关分析进行统计学处理.结果 对照组HSC-T6细胞中可见P-smad1/5/8、α-SMA、gremlin及FN的表达,TGFβ1刺激后表达量明显增加,差异有统计学意义(均P＜0.05).与TGFβ1组比较,TGFβ1+ BMP7组α-SMA、gremlin及FN表达下调,但P-smad1/5/8蛋白表达增加(1.613±0.031比2.503±0.014;t=34.89,P＜0.05).TGFβ1+ BMP7+ Noggin组α-SMA、gremlin及FN表达较TGFβ1+ BMP7组增加,而P-smad1/5/8蛋白表达下调(t=34.05,P＜0.05).smadl mRNA在各组表达均无显著变化.结论 BMP7对α-SMA、gremlin和FN均有较强的抑制作用.     

调控Notch信号对肝星状细胞活化的影响

目的 探讨肝星状细胞(HSC-T6)内是否存在功能激活的Notch信号分子以及调控Notch信号转导对HSC-T6活化的影响. 方法 用PCR方法检测Notch信号分子mRNA在HSC-T6细胞内的表达,TaqMan探针检测转化生长因子(TGF)β 1刺激HSC-T6后Notch信号分子的表达变化.细胞免疫荧光法检测Notch3和Jagged1在HSC-T6内的表达定位.用携带Notch3胞内域(ICD)的真核表达质粒pcDNA3.1-N3ICD和特异性干扰Notch3的siRNA(Notch3-siRNA)分别转染HSC-T6细胞,Western blot检测Notch3、α-平滑肌肌动蛋白(SMA)和Ⅰ型胶原的表达变化.对数据采用t检验和方差分析. 结果 HSC-T6细胞内存在功能激活的Notch信号转导.TGF β 1(2.0 ng/ml)刺激HSC-T6导致Jagged1、Notch3和HES-1的mRNA水平明显上调,分别提高了2.9、3.2、2.2倍,F值分别为2543.482,287.982和1719.851,P值均＜0.01.pcDNA3.1-N3ICD转染后促使HSC-T6合成α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白增加,较对照组分别提高了5.8倍和4.5倍,t值分别为13.157和9.810,P值均＜0.01;相反,Notch3- siRNA明显抑制HSC-T6表达α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白,较对照组分别下降了约90％和84％,t值分别为19.863和10.376,P值均＜0.01.而且,Notch3-siRNA能拮抗TGFβ1诱导HSC-T6表达α-SMA和Ⅰ型胶原的作用.结论 Notch信号通路可能通过调控肝星状细胞的活化参与肝纤维化的形成,选择性地干预Notch3信号转导可能成为抗肝纤维化的新途径.     

慢病毒介导的脯氨酰寡肽酶过表达对大鼠肝星状细胞功能的影响

目的探讨携带脯氨酰寡肽酶(prolyloligopeptidase,POP)基因的慢病毒转染大鼠肝星状细胞系-T6(hepatic stellate cellsT6,HSC-T6)对其生物学功能的影响,以揭示其在肝脏炎症与纤维化发生、发展中的作用。方法采用大鼠HSC-T6作为研究对象,设计合成携带大鼠POP基因的慢病毒,转染HSC-T6;通过ELISA方法检测各组HSC内Ac-SDKP水平;Real-time-PCR法检测各组HSC内相关基因表达量变化(POP、TGF-β1、α-SMA、MCP-1、Col I);Western blotting方法检测各组HSC中相关蛋白表达变化(POP、TGF-β1、α-SMA、Smad7、p-Smad2/3、PPAR-γ);CCK-8和流式细胞术检测转染POP对HSC增殖和凋亡的影响。结果慢病毒能高效感染HSC-T6并表达有活性的POP蛋白,与正常对照组及空病毒组相比,POP慢病毒感染的细胞内Ac-SDKP明显升高,Smad7、PPAR-γ蛋白表达显著升高,而α-SMA表达显著下降;POP慢病毒感染的细胞内MCP-1及α-SMA mRNA表达显著下调;此外,POP可促进HSC-T6增殖生长,而对HSC-T6凋亡无影响。结论 POP在HSC内可能发挥抗炎、抗纤维化作用,其机制可能通过促进Smad7及PPAR-γ的表达,抑制MCP-1及α-SMA的表达而发挥作用。     

瘦素对乙醛诱导肝星状细胞活化过程中Ⅰ型胶原及α-平滑肌肌动蛋白表达的影响

目的:观察瘦素对乙醛诱导肝星状细胞(HSC)活化过程中α-SMA和I型胶原表达的影响,旨在从体外探讨瘦素在酒精性肝病中的可能作用。方法:采用SD大鼠肝脏原位灌流消化的方法获得并原代及传代培养HSC,分乙醛(200μmol/L)处理组,瘦素(100nmol/L)处理组及联合处理组(乙醛200μmol/L加瘦素100nmol/L)。用实时荧光定量PCR方法检测各组细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原及α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)mRNA表达水平,Western blot检测各组细胞α-SMA表达量,ELISA法检测培养上清中TGF-β1及Ⅰ型胶原含量。结果:①乙醛处理组中TGF-β1和Ⅰ型胶原基因及蛋白表达量明显高于空白对照组(P<0.05),α-SMA表达量与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05);②瘦素处理组TGF-β1、Ⅰ型胶原及α-SMA表达量与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05);③联合处理组TGF-β1、Ⅰ型胶原及α-SMA表达量明显高于对照组(P<0.05),但TGF-β1、Ⅰ型胶原表达量与乙醛处理组相比差异无显著性意义(P>0.05)。结论:在乙醛诱导肝星状细胞活化过程中,瘦素能协同上调α-SMA的表达;但对TGF-β1及Ⅰ型胶原的表达无影响,Ⅰ型胶原和α-SMA的表达可能是依赖于不同的调控机制来实现。     

当归补血汤有效组分及其配伍对肝星状细胞TGF-β1/Smad信号通路的调控作用

目的观察当归补血汤有效组分及其配伍对大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)-T6转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)/Smad信号通路的调控作用.方法当归的有效成分阿魏酸、黄芪的有效成分黄芪甲苷单独应用及联合处理HSC-T6细胞24 h,收集细胞,Western blot检测HSC-T6细胞Ⅲ型胶原蛋白、Smad4和Smad7蛋白表达,实时定量PCR检测HSC-T6细胞Smad3和Ⅱ型TGF-β1受体mRNA表达.结果阿魏酸显著抑制HSC-T6细胞中Ⅲ型胶原蛋白和Smad4蛋白表达(均P0.05),抑制Smad3和Ⅱ型TGF-β1受体mRNA表达(均P0.05),对Smad7蛋白表达无显著性影响(P0.05),黄芪甲苷对这些指标均无显著性影响(均P0.05).与阿魏酸单独处理组比较,联合处理的作用效果无显著性提高(均P0.05).结论当归补血汤的有效组分阿魏酸通过TGF-β1/Smad信号通路抑制了肝星状细胞Ⅲ型胶原蛋白表达.     

Notch3表达下调在诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化中的作用

目的:探讨Notch3在心肌成纤维细胞(CFs)向肌成纤维细胞(MFs)转化中的作用。方法:用胶原酶消化法分离培养SD仔鼠的CFs,将其于不同浓度的转化生长因子-β1(TGF-β1)孵育24 h。用Western blot检测CFs中平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)及Notch3的表达量,用ELISA法检测细胞上清羟脯氨酸含量,用Real-Time PCR检测Notch3 mRNA表达量;利用RNAi法干扰CFs中Notch3的表达,用实时PCR及Western blot检测干扰效果;Western blot检测α-SMA蛋白表达量,ELISA检测各组细胞上清羟脯氨酸含量。结果:TGF-β1可浓度依赖性地诱导CFs细胞上清羟脯氨酸含量增加和α-SMA表达增加,同时使Notch3表达下降,其中2 ng/ml,5 ng/ml,10 ng/ml 3个浓度组与对照组相比有统计学差异(P0.05)。RNAi法干扰Notch3后,干扰组与对照组相比,Notch3 mRNA及蛋白表达均下降(P0.05),同时,干扰组细胞上清羟脯氨酸含量及α-SMA表达均增加(P0.05)。结论:Notch3表达下调能诱导CFs向MFs转化。     

四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠肝组织和HSC-T6细胞NOX4基因及其蛋白表达的变化

目的 探讨四氯化碳(CCl₄)诱导的肝纤维化小鼠和肝星状细胞(HSC-T6)还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶家族氧化酶4(NOX4)基因及其蛋白表达的变化。方法 采用腹腔注射四氯化碳(CCl₄)构建10只小鼠肝纤维化模型,采用qRT-PCR法和Western Blot法检测小鼠肝组织NOX4基因和蛋白表达水平。将肝星状细胞(HSC-T6)分为对照组、无意干预组和NOX4-siRNA干预组,后两组分别采用脂质体2000将无意义序列或NOX4-siRNA转染HSC-T6细胞,采用qRT-PCR法和Western Blot法检测HSC-T6细胞NOX4、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I 型胶原(Col1a I)、组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)、金属蛋白酶2(MMP-2)、转化生长因子 β1(TGF-β1)、Smad2和Smad3水平,采用DCFH-DA荧光探针法检测细胞活性氧(ROS)含量,采用MTT法检测细胞增殖,使用流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况。结果 模型小鼠肝组织出现明显的病理学损伤,有大量的胶原纤维沉积;模型组小鼠肝组织NOX4 mRNA水平显著高于对照组(P＜0.05);与对照组细胞比,NOX4-siRNA干预组细胞NOX4 mRNA及其蛋白、ROS、增殖活性、S期细胞比例、α-SMA、Col1a I、TIMP-1、MMP-2、TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3表达水平显著降低,而G0/G1期细胞比例和细胞凋亡率显著升高(P＜0.05)。结论 肝纤维化组织NOX4呈高水平,下调NOX4可抑制肝星状细胞的增殖和活化,并促进其凋亡,可能是通过下调TGF-β/Smad信号通路实现的。     

Smad3 shRNA抑制TGFβ1对HSC-T6细胞活化的抗肝纤维化作用

目的观察Smad3 shRNA对TGFβ1作用于大鼠HSC-T6细胞增殖、细胞周期以及分泌肝纤维化胶原的影响。方法Smad3 shRNA慢病毒感染HSC-T6,应用流式细胞仪检测其感染率,Real-time PCR检测对Smad3 mRNA表达的抑制作用;将HSC-T6对照、HSC-T6+TGFβ1(10 ng/ml)、Smad3 shRNA以及Smad3 shRNA+TGFβ1(10 ng/ml)这4组细胞进行如下检测:(1)MTT检测细胞增殖;(2)流式细胞仪检测TGFβ1作用24、36 h细胞周期分布;(3)Real-time PCR检测24、36 h时细胞周期、增殖及肝纤维化相关基因mRNA的表达变化;(4)ELISA检测24、36 h培养液上清中胶原蛋白(COL)Ⅰ、COLⅢ及α-SMA的含量。结果Smad3 shRNA慢病毒感染HSC-T6细胞至96 h,感染率为71.3%,对Smad3 mRNA的表达抑制率为50%。(1)MTT结果显示,TGFβ1促进HSC-T6增殖;与相应未感染Smad3 shRNA病毒组相比,Smad3 shRNA组以及Smad3 shRNA+TGFβ1组细胞增殖能力均下降。(2)细胞周期检测发现,24、36 h时,Smad3 shRNA+TGFβ1组与Smad3 shRNA组相比,细胞周期分布差异无统计学意义(P>0.05);(3)Real-time PCR显示,Smad3 shRNA+TGFβ1组较HSC-T6+TGFβ1组,Smad3、原癌基因(c-myc)、细胞周期依赖性激酶-2(CDK-2)、细胞周期素E(cyclin E)、表皮生长因子(EGF)、核因子-κB(NF-κB)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、COLⅠ及基质金属蛋白酶(MMP)14等基因的mRNA在24、36 h表达均下调,HGF mRNA及COLⅢmRNA在24 h时上调、36 h时下调,Bcl-2 mRNA、MMP1 mRNA及MMP9 mRNA在24 h和36 h两个时段均表达上调。(4)ELISA检测发现,同一时间点比较,分别在24、36 h,TGFβ1可促进HSC-T6细胞COLⅠ(P=0.00,P=0.02)、α-SMA(P=0.00,P=0.01)的分泌;与HSC-T6+TGFβ1组相比,Smad3 shRNA+TGFβ1组COLⅠ于36 h分泌减少(P=0.00)、而α-SMA在24、36 h两个时间点分泌减少(P=0.00)。结论 Smad3 shRNA抑制了TGFβ1对HSC-T6的活化,显示了抗肝纤维化作用。     

Notch1/Hes1通路活化通过抑制氧化应激改善高糖诱导的心肌细胞肥大

目的研究Notch1/Hes1信号通路活化对高糖诱导的心肌细胞肥大的影响,及其对氧化应激的作用。方法原代培养大鼠心肌细胞,采用图像分析法检测心肌细胞表面积,BCA试剂盒分析细胞总蛋白含量,采用RTq PCR和Western blot技术检测Notch1、Hes1、超氧化物歧化酶(SOD1)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达水平,相关试剂盒检测细胞匀浆中丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)含量。结果与对照组比较,高糖能明显诱导心肌细胞表面积及总蛋白含量的增加(P0.05),心肌细胞中Notch1、Hes1蛋白表达量也明显降低(P0.05),同时氧化应激产物MDA、NO明显升高(P0.05),并且SOD1显著降低、iNOS显著升高(P0.05);激活Notch1/Hes1信号通路能够显著降低高糖引起的心肌细胞肥大及氧化应激损伤(P0.05),而Notch1干扰慢病毒可阻断Notch1对心肌细胞肥大及氧化应激的上述改善作用(P0.05)。结论激活Notch1可以降低高糖诱导的心肌细胞肥大,其作用机制可能与降低细胞氧化应激损伤有关。     

蛋白酶体抑制剂抑制肾间质成纤维细胞细胞外基质表达及其机制

目的:本研究旨在观察蛋白酶体抑制剂MG132对转化生长因子β1(TGF-β1)刺激下的大鼠肾间质成纤维细胞的细胞外基质表达的影响并初步探讨其机制。方法:体外培养大鼠肾间质成纤维细胞(NRK/49F),利用实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR)分别观察MG132不同浓度直接刺激细胞和对TGF-β1(5ng/ml)诱导下产生的结缔组织生长因子(CTGF)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连结蛋白(FN)和III型胶原(ColIII)mRNA表达的影响。应用相同浓度的MG132(2.5μmol/L)预处理后,再加以TGF-β1分别刺激不同时间(0h,6h,12h,24h),同样用Realtime PCR检测上述因子的mRNA水平。利用Western blot观察MG132对TGF-β1诱导的FN和Smads蛋白表达的影响。ELISA方法观察MG132对TGF-β1诱导的FN蛋白分泌的影响。结果:MG132直接作用NRK/49F细胞即可明显降低CTGF、α-SMA和FN、ColIII的mRNA表达水平,随着MG132浓度(0.5、1、2.5、5μmol/L)增大,CTGF的mRNA表达均下降,分别为对照组的65%、46%、17%和20%;α-SMA的mRNA表达均下降,分别为对照组的10%、7%、4%和3%;FN的mRNA表达均下降,分别为对照组的54%、42%、25%和24%;ColIII的mRNA表达均下降,分别为对照组的30%、12%、5%和1%(均为P<0.05)。5ng/mlTGF-β1分别使CTGF、α-SMA和FN、ColIII mRNA表达增加为对照组的6.91、2.11、1.38和3.60倍(P<0.05),用MG132不同浓度(0.5、1、2.5、5μmol/L)预处理后,CTGF mRNA均下降,分别为对照组的3.30、2.84、1.06和0.74倍,α-SMA mRNA均下降,分别为对照组的0.50、0.31、0.28和0.19倍,FN mRNA均下降,分别为对照组的0.80、0.67、0.55和0.37倍,ColIII mRNA均下降,分别为对照组的0.57、0.35、0.28和0.05倍。MG132在各时间点均能使TGF-β1所引起的纤维化相关因子的mRNA表达水平下调。5ng/mlTGF-β1以时间依赖方式诱导p-Smad2、p-Smad3磷酸化增加,1h达到高峰。MG132预处理组p-Smad2、p-Smad 3及FN蛋白表达量与TGF-β1刺激组相比显著下降,各组Smad2/3蛋白表达无显著变化。MG132预处理组FN蛋白分泌量与TGF-β1刺激组相比显著下降。结论:MG132可下调肾间质成纤维细胞的纤维化相关因子的mRNA表达,它能够通过抑制Smad信号转导途径抑制TGF-β1介导的炎症反应,提示MG132在肾脏炎症中具有抑制间质纤维化的潜在作用。     

大鼠肝星状细胞CTGF、纤维连接蛋白和整合素的表达变化及肝复康的调节作用*

目的 观察乙醛激活的大鼠肝星状细胞（HSCs）结缔组织生长因子（CTGF）、纤维连接蛋白（FN）和整合素的表达变化,以及中药肝复康对它们表达的影响。方法 制备肝复康含药血清,体外培养HSC-T6细胞,用乙醛及肝复康含药血清干预HSCs,采用RT-PCR法检测HSCs中CTGF、FN、整合素α5、整合素β1和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA的相对光密度值。结果 乙醛刺激后HSC-T6细胞CTGF、FN、整合素α5、整合素β1和α-SMA mRNA水平分别为（1.06±0.02）、（1.28±0.23）、（2.13±0.09）、（1.57±0.50）和（2.84±0.14）,与空白对照组细胞[分别为（0.46±0.05）、（0.40±0.09）、（0.37±0.10）、（0.19±0.03）和（0.18±0.03）]相比,均显著升高（P＜0.01）,而肝复康干预能显著降低它们的水平[分别为（0.59±0.02）、（0.71±0.15）、（1.55±0.04）、（0.92±0.22）和（1.99±0.10）,P＜0.01]。结论 肝复康干预HSCs活化可能与抑制CTGF、FN、整合素α5、整合素β1和α-SMA水平有关。     

Fgl2基因对H9C2心肌细胞凋亡的影响

目的探讨纤维蛋白原样蛋白(Fgl)2基因对H9C2心肌细胞凋亡的影响及机制。方法空白试剂、阴性病毒和Fgl2 siRNA慢病毒感染H9C2心肌细胞,分别为空白对照组、阴性对照组、Fgl2-siRNA组,48 h后收集细胞,Western印迹检测各组细胞中Fgl2的蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western印迹检测酶切caspase3、Notch1、Hes1蛋白表达。结果空白对照组和阴性对照组Fgl2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),Fgl2-siRNA组Fgl2蛋白表达显著低于空白对照组(P<0.01);与空白对照组及阴性对照组比较,Fgl2-siRNA组H9C2细胞凋亡明显降低,酶切caspase3蛋白表达显著下调,Notch1、Hes1蛋白表达显著上调(P<0.01)。结论沉默Fgl2基因的表达可有效抑制H9C2心肌细胞凋亡,其机制与下调酶切caspase3蛋白表达、激活Notch1信号通路有关。     

中药肝复康对肝星状细胞mTOR/P70S6K信号通路的干预作用

目的观察中药肝复康含药血清对乙醛刺激的肝星状细胞mTOR/P70S6K信号通路的影响,以探讨肝复康抗纤维化的分子生物学机制。方法体外培养大鼠HSC-T6细胞,用肝复康对乙醛刺激的HSCs进行干预,采用RT-PCR法测定HSCs中Ⅰ、Ⅲ型胶原、mTOR、P70S6K的表达。结果空白对照组肝星状细胞各指标表达量呈相对较低水平,乙醛刺激组细胞Ⅰ型胶原、mTOR、P70S6K和Ⅲ型胶原表达量明显升高(P<0.05),而肝复康干预对于细胞Ⅰ型胶原、mTOR和P70S6K的升高有明显的抑制作用(P<0.01)。结论 mTOR/P70S6K信号通路在HSCs活化过程中起到重要作用,肝复康发挥抗纤维化的作用机制与阻断mTOR/P70S6K信号通路有关。     

Wnt3a对肝星状细胞增殖活化以及转化生长因子β/Smad表达的影响

目的 研究Wnt3a对肝星状细胞(HSC)的增殖、活化以及转化生长因子(TGF)β/Smad表达的影响. 方法 重组Wnt3a刺激HSC后,用EDU法测定其对HSC增殖的影响;用Westem blot法检测HSC表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TGFβ 1、Smad3和Smad7的蛋白水平并比较四者之间的关系,多组间数据的比较用单因素方差分析,双变量相关分析研究数据间相关性.结果 200 ng/ml Wnt3a刺激HSC24h后,其增殖率达到最大(63.00％±2.30％),显著高于未处理组、50 ng/ml、100 ng/ml及150 ng/ml组(P值均＜0.05),而和250、300ng/ml组的差异无统计学意义(P值均＞0.05);随着Wnt3a浓度的增加和刺激时间的延长,HSC表达α-SMA、TGFβ1和Smad3的蛋白水平也随之升高,均在300 ng/ml刺激48h后达到最大值(与3-磷酸甘油醛脱氢酶的灰度比值分别为1.0860±0.0101、1.0346±0.0118、1.0306±0.0122),而Smad7的蛋白水平却随之降低,在300ng/ml Wnt3a刺激48h后达到最小(与GAPDH的灰度比值为0.7736±0.0139),差异均具有统计学意义(P值均＜0.05),并且α-SMA的蛋白表达与TGFβ 1、Smad3的蛋白表达呈正相关(r=0.968,P＜ 0.05;r=0.997,P＜0.01),而和Smad7的蛋白表达呈负相关(r=0.960,P＜0.05).结论 重组Wnt3a能促进HSC的增殖、活化,并上调TGF β/Smad的表达,可能对肝纤维化的形成具有促进作用.     

脯氨酰寡肽酶抑制剂体外对肝星状细胞凋亡、增殖和肝纤维化相关基因表达的影响*

目的 体外探讨肝星状细胞（HSC）脯氨酰寡肽酶（POP）的生物学功能,以进一步阐述其在肝脏炎症和纤维化发生发展中的作用。方法 取HSC-T6细胞,经不同浓度的POP抑制剂（S17092）处理,采用ELISA法检测HSC-T6细胞N-乙酰基-丝氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-脯氨酸（Ac-SDKP）水平,使用流式细胞术和CCK8检测HSC-T6凋亡和增殖水平,采用实时定量-PCR法检测相关炎症和肝纤维化基因转化生长因子-β1（TGF-β1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、Ⅰ型胶原（Col I）水平,采用Western blot法检测相关蛋白（POP、TGF-β1、α-SMA、Smad7、p-Smad2/3、PPAR-γ）表达。结果 与对照组比,POP抑制剂干预组细胞内Ac-SDKP水平显著下降（P<0.05）;POP被抑制后对HSC-T6凋亡没有显著的影响（P>0.05）,但可抑制其增殖（P<0.05）;与对照组比,抑制剂组HSC内α-SMA蛋白表达显著升高（P<0.05）,而Smad7和PPAR-γ蛋白表达显著下降（P均<0.05）;抑制剂组HSC内MCP-1和α-SMA mRNA水平显著上调（P均<0.05）。结论 POP在肝星状细胞内可能发挥重要的抗炎抗纤维化作用,其机制可能与其调节Ac-SDKP及Smad7和PPAR-γ的表达有关。     

γ-分泌酶抑制剂干预对鼠心脏成纤维细胞平滑肌肌动蛋白-α及MMP-1/TIMP-1表达的影响

目的:探讨γ-分泌酶抑制剂(DAPT)抑制Notch信号通路对心肌成纤维细胞(CFs)平滑肌肌动蛋白-α(α-SMA)的表达及细胞外基质(ECM)降解平衡变化的影响。方法:采用胰酶消化法和差速贴壁法分离和纯化SD乳鼠CFs进行体外培养,将CFs分为正常组(N组,培养时不加干预药物)和尾加压素Ⅱ组(U组,加UⅡ10~(-8) mol/L)和DAPT+尾加压素Ⅱ组(D组,同时加入UⅡ10~(-8) mol/L和DAPT 75μmol/L),培养干预48h后采用RT-PCR法测基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、组织金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)、α-SMA和Notch蛋白胞内段(Notch1)mRNA的表达;Western Blot检测α-SMA及Notch1蛋白的表达。结果:U组TIMP-1、α-SMA及Notch1的mRNA表达水平明显高于N组(均P0.01),MMP-1mRNA的表达和MMP-1mRNA/TIMP-1mRNA比值低于N组(均P0.01);D组TIMP-1、α-SMA、Notch1的mRNA表达以及α-SMA和Notch1蛋白的表达均较U组下调(均P0.01),MMP-1mRNA的表达和MMP-1mRNA/TIMP-1mRNA比值较U组上调(P0.01);但D组上述指标与N组相比差异无统计学意义。结论:DAPT可通过阻断Notch信号通路抑制尾加压素Ⅱ诱导的CFs表型转换,激活胶原降解途径,并可重调MMP-1/TIMP-1平衡,此作用有助于抑制心肌纤维化。     

大鼠Smad7真核表达质粒的构建及在肝星状细胞中的表达

目的:构建并鉴定大鼠Smad7真核表达质粒,观察外源Smad7对肝星状细胞HSC-T6的转染.并进一步研究其对TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA达水平的影响.方法:采用基因重组技术将Smad7 cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1( ),构建大鼠Smad7真核表达质粒.脂质体介导转染HSC-T6细胞,分为正常对照组、空质粒组及转染组,G418筛选,挑取阳性细胞,运用Western blot检测Smad7蛋白表达情况,RT-PCR检测Smad7、TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达水平.结果:酶切和测序结果证实Smad7真核表达质粒构建成功.Smad7转染组与正常对照、空质粒组比较,Smad7 mRNA表达显著增加(1.053±0.009 VS 0.984±0.054,0.986±0.044,P<0.01或0.05),蛋白水平显著上调(0.083±0.02 VS0.058±0.050,0.056±0.064,均p<0.05:Smad7转染组TGF-β1、Ⅰ型胶原mRNA表达降低(0.961±0.013 VS 1.039±0.013,1.032±0.037;0.592±0.096 VS 0.767±0.085.0.770±0.090,均P<0.01);Ⅲ型胶原mRNA表达差异无统计学意义.正常对照、空质粒组Smad7 mRNA和蛋白水平、TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNAA达差异无统计学意义.结论:smad7可能参与TGF-β/smad信号转导,在一定程度上具有抗纤维化的生物学活性.     

尾加压素Ⅱ诱导肾成纤维细胞转分化的作用及机制

目的探讨尾加压素Ⅱ(UrotensinⅡ,UⅡ)对体外培养的大鼠肾间质成纤维细胞(RFB)发生肌成纤维细胞转分化的作用及相关分子机制。方法体外培养的大鼠肾间质成纤维细胞随机分为对照组和UⅡ刺激组。对照组不加任何刺激培养;UⅡ刺激组加入10-8 mol/L的UⅡ分别培养12、24和48 h。应用免疫荧光和免疫组化方法检测α-SMA的表达,应用RT-PCR和Western blotting分别检测结缔组织生长因子(CTGF)基因及蛋白表达。结果细胞培养24 h后正常对照组胞浆中仅见少量α-SMA表达,而经UⅡ作用后,α-SMA表达量明显增多。UⅡ干预RFB 12、24及48 h后α-SMA表达量逐渐增加。与对照组比较UⅡ刺激组CTGF基因及蛋白表达均明显增高(P<0.05)。结论尾加压素Ⅱ能诱导大鼠肾间质成纤维细胞发生肌成纤维细胞转分化,其作用可能与其促进CTGF基因及蛋白表达有关。     

Ang(1-7)对AngⅡ诱导的肝星状细胞Mas受体、TGF-β1/Smad3、CTGF的影响

目的体外培养大鼠肝星状细胞(HSC-T6),观察血管紧张素(1-7)(Ang1-7)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肝星状细胞Mas受体、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad3、结缔组织生长因子(CTGF)表达情况的影响,进而探讨Ang(1-7)在肝纤维化进程中的作用及可能的作用机制,为临床治疗肝纤维化提供理论依据。方法体外培养大鼠肝星状细胞(HSC-T6),分为正常对照组、不同浓度AngⅡ处理组、AngⅡ+Ang(1-7)组、AngⅡ+Ang(1-7)+Mas受体拮抗剂A779组。培养24 h后,流式细胞仪(Annexin V/PI)双染法检测各组细胞凋亡率;同时采用Real-time PCR及Western Blotting检测肝星状细胞中Mas受体、TGF-β1、Smad3及CTGF mRNA及蛋白的表达。结果 (1)与正常对照组相比,AngⅡ处理组肝星状细胞凋亡活性增加,TGF-β1、Smad3、CTGF、Mas受体mRNA及蛋白表达量较正常对照组增加(P0.05)。(2)与AngⅡ处理组相比,AngⅡ+Ang(1-7)组肝星状细胞的凋亡率增加,而TGF-β1、Smad3、CTGF mRNA表达降低,Mas受体表达增加(P0.05)。(3)与AngⅡ+Ang(1-7)组相比,AngⅡ+Ang(1-7)+Mas受体拮抗剂A779组,肝星状细胞的凋亡率、TGF-β1、Smad3、CTGF mRNA表达降低(P0.05),Mas受体表达增加(P0.05)。结论 (1)AngⅡ可诱导大鼠肝星状细胞活化,促使TGF-β1、Smad3、CTGF表达增加。(2)Ang(1-7)可促使AngⅡ诱导的肝星状细胞凋亡而发挥抗肝纤维化作用。(3)与AngⅡ+Ang(1-7)组相比,AngⅡ+Ang(1-7)+Mas受体拮抗剂A779组,肝星状细胞凋亡率、Mas受体表达下降(P0.05),TGF-β1、Smad3、CTGF mRNA表达增加(P0.05)。