CCl4诱导的肝纤维化小鼠和HSC-T6细胞miR-122水平变化及其意义探讨*

目的 研究微小RNA(miR)-122在肝星状细胞活化/增殖及肝纤维化发生过程中的水平变化及其可能的作用机制。方法 建立CCl₄诱导的C57BL/6小鼠肝纤维化模型,以10 ng/ml转化生长因子-β1(TGF-β1)处理HSC-T6细胞,分别在小鼠体内和肝星状细胞转染miR-122 激动剂和miR-122模拟物以过表达miR-122。采用RT-PCR和Western-blot法检测组织和细胞miR-122、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、I型胶原、金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)和血小板衍生生长因子(PDGF)表达,采用CCK-8法检测HSC-T6细胞增殖。结果 模型组小鼠肝组织α-SMA表达水平显著高于对照组(9.92±2.12对1.12±0.54,P＜0.01),而miR-122水平显著低于对照组(0.95±0.31对2.07±0.28,P＜0.01);在CCl₄诱导的肝纤维化小鼠,miR-122激动剂转染组肝组织miR-122水平显著高于miR-122激动剂对照组(6.27±1.73对2.78±0.21,P ＜ 0.01);miR-122 激动剂转染组肝组织α-SMA、I型胶原、TIMP-1和PDGF蛋白水平显著下降;在TGF-β1处理的HST-T6细胞,随着处理时间的延长,肝星状细胞α-SMA水平逐渐升高(0h:0.61±0.02,12 h:0.69±0.05, 24 h:0.75±0.01,48 h:1.01±0.03,P＜0.05),而miR-122水平随TGF-β1处理时间的延长而逐渐下降(0 h:0.72±0.05,12 h:0.45±0.01, 24 h:0.37±0.03,48 h:0.29±0.08, P＜0.05);与miR-122 阴性对照转染组比,miR-122模拟物转染组细胞miR-122水平显著增加(178.45±30.62对12.18±2.39,P ＜0.01);Western Blot检测发现miR-122模拟物转染组细胞α-SMA蛋白表达水平显著下调;采用TGF-β1处理HST-T6细胞,与miR-122 阴性对照转染组比,miR-122 模拟物转染组细胞增殖活力显著降低(P＜0.05)。结论 肝纤维化组织细胞miR-122水平下调,而过表达miR-122可抑制肝星状细胞的活化和增殖,从而可能抑制肝纤维化的发生和发展。     

Apocynin通过TGF-β1/Smad信号通路对脂多糖心肌纤维化小鼠的作用及其对ColⅠa1、ColⅢa1的影响

目的探讨Apocynin通过TGF-β1/Smad信号通路对脂多糖(LPS)心肌纤维化(MF)小鼠的作用及其对ColⅠa1、ColⅢa1的影响。方法将40只C57BL/6雄性小鼠随机分成正常对照组、Apocynin对照组、MF模型组和Apocynin干预组(n=10)。连续4周,每周一次腹腔注射LPS(10 mg/kg)的方法建立心肌纤维化模型。Apocynin干预组则于LPS(10 mg/kg)处理前0.5 h连续4周每周一次腹腔注射Apocynin(10 mg/kg)。各组小鼠于4周末颈椎脱臼处死后,心肌组织天狼星红染色检测心肌纤维化程度,采用免疫组织化学法检测各组小鼠心肌组织中TGF-β1,Smad2/3,p-Smad 2/3蛋白相对表达量;采用蛋白印记法检测小鼠心肌组织中ColⅠa1、ColⅢa1蛋白的表达量。结果 Apocynin对照组较正常对照组心肌组织胶原面积分数以及TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表达量和纤维化因子ColⅠa1、ColⅢa1表达量差异无统计学意义(P0.05);MF模型组较正常对照组心肌组织胶原面积分数以及TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表达量和纤维化因子ColⅠa1、ColⅢa1表达量增加(P0.01);Apocynin干预组较MF模型组心肌组织胶原面积分数以及TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表达量和纤维化因子ColⅠa1、ColⅢa1表达量降低(P0.01)。结论 Apocynin通过TGF-β1/Smad信号通路介导了纤维化因子ColⅠa1、ColⅢa1蛋白的下调,从而减轻了LPS诱导的小鼠心肌纤维化。     

蒙药额力根II号对肝纤维化大鼠的保护作用研究

目的 观察蒙药额力根II号对CCl₄诱导的肝纤维化大鼠的保护作用。方法 随机将58只SD大鼠分为对照组、模型组、蒙药额力根II号小、中、大剂量干预组,制备CCl₄肝纤维化模型,并给予蒙药干预。观察肝组织病理学变化,并采用免疫组化法检测肝组织α-SMA、I型胶原和III型胶原的表达。结果 与模型组比,中剂量药物处理组动物血清ALT、AST和透明质酸(HA)水平显著降低(P＜0.05),大剂量药物处理组血清ALT、AST、TBIL、HA、III型前胶原(PIIINP)和IV型胶原(CIV)水平降低更显著(P＜0.05);对照组、中和大剂量药物干预组肝组织α-平滑肌肌动蛋白表达水平分别为(0.0±0.0)、(4.9±1.0)、(3.4±0.9),显著低于模型组【(6.1±1.2),P＜0.05】,III型胶原蛋白分别为(2.4±1.3)、(5.0±2.4)和(3.7±1.8),显著低于模型组【(6.4±2.4),P＜0.05】;对照组和大剂量干预组肝组织I型胶原蛋白分别为(2.1±0.2)和(3.3±1.0),显著低于模型组【(6.0±2.5),P＜0.05】;与模型组比,中和大剂量药物处理组大鼠肝组织纤维化程度显著改善。结论 蒙药额力根II号对CCl₄诱导的肝纤维化大鼠具有保护作用,其机制可能与抑制了肝星状细胞活化,减少了细胞外基质的合成有关。     

人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）对肝纤维化小鼠模型的治疗作用及其机制分析

目的 探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)对肝纤维化小鼠的治疗作用及其机制。方法 选取18只SPF级6周龄C57BL/6小鼠,使用随机数字表法随机分为3组,分别为对照组、CCl₄模型组(CCl₄组)和h UC-MSC治疗组(MSC组),每组6只。CCl₄组和MSC组腹腔注射CCl₄溶液构建小鼠肝纤维化模型,对照组同时注射相同剂量玉米油,MSC组在注射CCl₄的过程经尾静脉注射hUC-MSC。于第8周末采取小鼠血清,处死小鼠,取小鼠肝脏固定。使用酶联免疫吸附法测定炎症因子水平,自动生化检测仪检测肝功能相关指标,HE染色、Masson染色、天狼星红染色及α-SMA免疫荧光用于评估肝纤维化情况;TGF-β刺激的肝星状细胞(HSC)分别在有无几丁质酶3样蛋白1(CHI3L1)添加的培养基中与hUC-MSC共培养,Western Blot试验检测蛋白表达水平。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用Dunnett-t检验。结果 Masson染色、天狼星红染色提示CCl...     

HIF-1α对非酒精性脂肪性肝病小鼠肝组织的影响*

目的 探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)进展中的作用。方法 将30只雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、高脂饮食模型组和蛋氨酸-胆碱缺乏饮食(MCD)模型组,每组10只,建立非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型,分别取肝组织行组织病理学检查,采用缺氧探针检测肝组织缺氧程度,采用Real-time PCR法检测肝组织HIF-1α mRNA水平,采用Western blot法检测肝组织HIF-1α蛋白表达。另取小鼠肝星状细胞JS-1细胞,分为对照组、腺病毒载体组和HIF-1α ShRNA腺病毒载体感染组,采用MTT法检测细胞活性,采用Real-time PCR法检测细胞1型胶原(COL1)和3型胶原(COL3)、TNF-α、IL-1β和TGF-β1 mRNA水平。结果 缺氧探针染色显示高脂饮食模型组和MCD模型组小鼠肝组织染色阳性率分别为85%和78%,显著高于对照组的7%(P<0.05);高脂饮食模型组和MCD模型组小鼠肝组织HIF-1α mRNA水平分别为对照组小鼠的2.1倍和1.6倍(P<0.05),HIF-1α蛋白表达水平也相应地增强;HIF-1α ShRNA腺病毒载体感染细胞活力仅为对照组的37%(P<0.05),细胞COL1、COL3、TNF-α、IL-1β、TGF-β1 mRNA水平也显著降低(P<0.05)。结论 HIF-1α能够促进小鼠NAFLD进展,抑制HIF-1α表达可能能延缓NAFLD进展,值得进一步研究。     

慢病毒介导的脯氨酰寡肽酶过表达对大鼠肝星状细胞功能的影响

目的探讨携带脯氨酰寡肽酶(prolyloligopeptidase,POP)基因的慢病毒转染大鼠肝星状细胞系-T6(hepatic stellate cellsT6,HSC-T6)对其生物学功能的影响,以揭示其在肝脏炎症与纤维化发生、发展中的作用。方法采用大鼠HSC-T6作为研究对象,设计合成携带大鼠POP基因的慢病毒,转染HSC-T6;通过ELISA方法检测各组HSC内Ac-SDKP水平;Real-time-PCR法检测各组HSC内相关基因表达量变化(POP、TGF-β1、α-SMA、MCP-1、Col I);Western blotting方法检测各组HSC中相关蛋白表达变化(POP、TGF-β1、α-SMA、Smad7、p-Smad2/3、PPAR-γ);CCK-8和流式细胞术检测转染POP对HSC增殖和凋亡的影响。结果慢病毒能高效感染HSC-T6并表达有活性的POP蛋白,与正常对照组及空病毒组相比,POP慢病毒感染的细胞内Ac-SDKP明显升高,Smad7、PPAR-γ蛋白表达显著升高,而α-SMA表达显著下降;POP慢病毒感染的细胞内MCP-1及α-SMA mRNA表达显著下调;此外,POP可促进HSC-T6增殖生长,而对HSC-T6凋亡无影响。结论 POP在HSC内可能发挥抗炎、抗纤维化作用,其机制可能通过促进Smad7及PPAR-γ的表达,抑制MCP-1及α-SMA的表达而发挥作用。     

生长抑素通过抑制内质网应激反应减轻肝纤维化小鼠肝损伤研究

目的 观察生长抑素(SST)对肝纤维化(LF)小鼠肝组织内质网应激(ERS)反应的影响。方法 将40只野生型小鼠随机分为对照组、模型组、小剂量SST干预组和大剂量SST干预组,给予小鼠腹腔内注射25% CCl₄ 橄榄油混合制剂制备肝纤维化模型,分别给予大、小剂量的SST进行干预。取肝组织行天狼猩红和免疫组化染色,对肝组织行Ishak评分,采用Western blot法检测肝组织Bcl-2、Bax、Casp-9、BiP和CHOP蛋白表达变化。结果 模型组肝组织炎症活动度评分为(12.2±2.7),显著高于对照组[(1.8±0.8),P＜0.01],肝纤维化程度评分为(5.4±0.5),显著高于对照组[(0.1±0.3),P＜0.01];血清AST 和ALT水平分别为(194.7±35.2)U/L和(121.8±26.6)U/L],均显著高于对照组[分别为(53.8±21.7)U/L和(35.3±12.9)U/L,P＜0.01];大、小剂量SST干预组小鼠肝脏炎症活动度评分分别为(7.7±2.1)和(6.9±1.97),肝纤维化程度评分分别为(4.3±1.0)和(3.9±0.9),较模型组显著改善(P＜0.05);模型组肝组织Bax、Casp-9、BiP和CHOP蛋白相对表达量显著强于对照组([P＜0.01),而SST干预组Bax、Casp-9、BiP和CHOP蛋白相对表达量均显著弱于模型组(F=26.36,F=14.81,F=25.11和F=30.31,P＜0.05)。结论 SST能够改善CCl₄诱导的肝纤维化小鼠肝组织炎症活动和纤维化程度,其机制可能与其抑制了肝组织ERS反应有关。     

Ang(1-7)对AngⅡ诱导的肝星状细胞Mas受体、TGF-β1/Smad3、CTGF的影响

目的体外培养大鼠肝星状细胞(HSC-T6),观察血管紧张素(1-7)(Ang1-7)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肝星状细胞Mas受体、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad3、结缔组织生长因子(CTGF)表达情况的影响,进而探讨Ang(1-7)在肝纤维化进程中的作用及可能的作用机制,为临床治疗肝纤维化提供理论依据。方法体外培养大鼠肝星状细胞(HSC-T6),分为正常对照组、不同浓度AngⅡ处理组、AngⅡ+Ang(1-7)组、AngⅡ+Ang(1-7)+Mas受体拮抗剂A779组。培养24 h后,流式细胞仪(Annexin V/PI)双染法检测各组细胞凋亡率;同时采用Real-time PCR及Western Blotting检测肝星状细胞中Mas受体、TGF-β1、Smad3及CTGF mRNA及蛋白的表达。结果 (1)与正常对照组相比,AngⅡ处理组肝星状细胞凋亡活性增加,TGF-β1、Smad3、CTGF、Mas受体mRNA及蛋白表达量较正常对照组增加(P0.05)。(2)与AngⅡ处理组相比,AngⅡ+Ang(1-7)组肝星状细胞的凋亡率增加,而TGF-β1、Smad3、CTGF mRNA表达降低,Mas受体表达增加(P0.05)。(3)与AngⅡ+Ang(1-7)组相比,AngⅡ+Ang(1-7)+Mas受体拮抗剂A779组,肝星状细胞的凋亡率、TGF-β1、Smad3、CTGF mRNA表达降低(P0.05),Mas受体表达增加(P0.05)。结论 (1)AngⅡ可诱导大鼠肝星状细胞活化,促使TGF-β1、Smad3、CTGF表达增加。(2)Ang(1-7)可促使AngⅡ诱导的肝星状细胞凋亡而发挥抗肝纤维化作用。(3)与AngⅡ+Ang(1-7)组相比,AngⅡ+Ang(1-7)+Mas受体拮抗剂A779组,肝星状细胞凋亡率、Mas受体表达下降(P0.05),TGF-β1、Smad3、CTGF mRNA表达增加(P0.05)。     

当归补血汤有效组分及其配伍对肝星状细胞TGF-β1/Smad信号通路的调控作用

目的观察当归补血汤有效组分及其配伍对大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)-T6转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)/Smad信号通路的调控作用.方法当归的有效成分阿魏酸、黄芪的有效成分黄芪甲苷单独应用及联合处理HSC-T6细胞24 h,收集细胞,Western blot检测HSC-T6细胞Ⅲ型胶原蛋白、Smad4和Smad7蛋白表达,实时定量PCR检测HSC-T6细胞Smad3和Ⅱ型TGF-β1受体mRNA表达.结果阿魏酸显著抑制HSC-T6细胞中Ⅲ型胶原蛋白和Smad4蛋白表达(均P0.05),抑制Smad3和Ⅱ型TGF-β1受体mRNA表达(均P0.05),对Smad7蛋白表达无显著性影响(P0.05),黄芪甲苷对这些指标均无显著性影响(均P0.05).与阿魏酸单独处理组比较,联合处理的作用效果无显著性提高(均P0.05).结论当归补血汤的有效组分阿魏酸通过TGF-β1/Smad信号通路抑制了肝星状细胞Ⅲ型胶原蛋白表达.     

E型前列腺素受体4对CCL4诱导的肝损伤小鼠肝组织肝纤维化相关蛋白表达的影响*

目的 探讨E型前列腺素受体4(EP4)在CCL₄诱导的肝损伤小鼠肝纤维化发生过程中的作用。方法 取30只C57BL/6N小鼠,随机分为对照组、模型组和CCL₄联合E7046处理组(n=10),采用CCL₄注射法建立肝损伤模型,分别给予甲基纤维素或EP4特异性拮抗剂E7046溶液灌胃干预。采用Western blot和qPCR检测小鼠肝组织EP4、α-SMA蛋白及其mRNA水平。常规行HE染色、Masson染色和天狼星红染色,鉴定小鼠肝组织病理学变化。结果 模型组小鼠肝组织EP4蛋白表达比对照组显著增高,经E7046干预后,肝组织EP4蛋白表达降低,同样地,模型组小鼠肝组织EP4编码基因Ptger 4 mRNA水平为(3.5±0.1),显著高于对照组【(1.0±0.1),P<0.05】,而CCL₄联合E7046处理组为(2.4±0.2),较模型组显著降低(P<0.05);模型组小鼠血清ALT和AST水平分别为(1753.5±328.6)U/L和(1586.2±204.1)U/L,显著高于对照组(P<0.05),而在CCL₄联合E7046处理组,两种酶水平较模型组显著降低【分别为(885.9±269.6)U/L和(892.4±208.6)U/L,P<0.05】;模型组小鼠肝组织α-SMA表达较对照组增高,而在CCL₄联合E7046组α-SMA水平较模型组降低,模型组小鼠肝组织Acta2和Col1a1 mRNA 水平较对照组显著上调,而CCL₄联合E7046组则较模型组显著降低(P<0.05)。结论 EP4在CCL₄诱导的小鼠肝纤维化发生过程中发挥重要作用,阻断EP4与其配体结合有助于改善肝纤维化。     

Testicular orphan receptor 4 induced hepatic stellate cells activation via the regulation of TGF-β receptor Ⅰ/Smad2/3 signaling pathway

Introduction and ObjectivesLiver fibrosis is a common pathological change in many chronic liver diseases. Activation of hepatic stellate cells (HSCs) is the core event in liver fibrosis. This study aimed to investigate the role of testicular orphan receptor 4 (TR4) in the activation of HSCs.Materials and MethodsIn vivo, bile duct ligation (BDL)-induced rat liver fibrosis model was established, and the expressions of TR4 and α-smooth muscle actin (α-SMA) in liver tissues were detected. In vitro, TR4 knockdown and overexpression in JS-1 cells using lentiviral vectors were constructed, and the expressions of TR4, α-SMA, Col-I, and TGF-β1/smads and retinoid X receptor (RXR) pathway-related genes were detected.ResultsTR4 was highly expressed in BDL-induced fibrotic liver, accompanied by increased expression of α-SMA. Knockdown of TR4 significantly inhibited the expressions of α-SMA, Col-I, p-TβRI, and p-Smad2/3, and up-regulated the expression of RXRα in HSCs in vitro. In contrast, TR4 overexpression significantly increased the expressions of α-SMA, Col-I, p-TβRI, and p-Smad2/3, and inhibited the expression of RXRα.ConclusionsTR4 may promote the activation of HSCs by up-regulating TβR I/Smad2/3 signaling pathway and down-regulating RXRα signaling, thereby promoting the progression of liver fibrosis. Our findings may provide a new therapeutic target against hepatic fibrosis.     

Histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid alleviates liver fibrosis by suppressing the transforming growth factor-β1 signal pathway

Background: Histone deacetylases(HDACs) inhibitors are new anti-fibrotic drugs that inhibit the activity of hepatic stellate cells. The present study focused on the anti-fibrotic function of HDAC inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid(SAHA) by suppressing transforming growth factor-β1(TGF-β1) signaling. Methods: Male Sprague-Dawley rats were used to induce liver fibrosis with carbon tetrachloride(CCl 4) and LX2 cell(human hepatic stellate cell line) was stimulated by TGF-β1. Both animals and cells were treated with SAHA. The Smad7 and connective tissue growth factor(CTGF) mRNA levels were detected by real-time polymerase chain reaction(PCR). Western blotting was used to examine the protein levels of CTGF, Histone H3(H3), Smad7, Smad2/3, Acetyl-Histone H3(AH3), HDAC2, α-smooth muscle actin( α-SMA), HDAC6, p-Smad2/3 and HDAC8. In addition, the TGF-β1 and liver enzyme levels from rat serum were detected. Histopathological changes were examined by hematoxylin and eosin(HE), Sirius red and Masson trichrome staining. The α-SMA expression was detected by immumohistochemical staining. Results: Compared with control group, the TGF-β1 and liver enzyme levels from rat serum, together with the mRNA levels of CTGF and protein levels of CTGF, HDAC2, α-SMA, HDAC6, p-Smad2/3 and HDAC8 were elevated in fibrotic rats( P 0.01). But the Smad7 mRNA and AH3 protein levels were notably suppressed in the fibrotic rats( P 0.01). Pathological examination showed the typical changes of liver fibrosis in the fibrotic rats. After the treatment with SAHA, the levels of liver enzymes, TGF-β1, CTGF, HDAC2, α-SMA, HDAC6, p-Smad2/3 and HDAC8 were reduced( P 0.01) and Smad7 and AH3 protein contents were elevated in liver fibrotic rats( P 0.01). Moreover, immumohistochemistry showed that SAHA significantly suppressed the α-SMA protein content in fibrotic liver( P 0.01). Conclusion: The HDAC inhibitor SAHA alleviated liver fibrosis by suppressing the TGF-β1 signaling.     

BMP-7过表达抑制大鼠肝星状细胞上皮-间叶转化

目的观察慢病毒介导的BMP-7高表达是否能抑制大鼠HSC-T6细胞发生上皮-间叶转化（epithelial to mesenchymal tran-sition,EMT）,并能拮抗TGF-β1的促EMT作用。方法构建大鼠BMP-7慢病毒表达载体,体外感染HSC-T6细胞株,将成功感染BMP-7重组慢病毒的细胞给予TGF-β1（5 ng/mL）或溶酶体处理。Real-time PCR检测α-SMA、S100A4、E-cadherin mRNA转录水平。Western blotting检测α-SMA、S100A4、E-cadherin、Ⅰ型胶原蛋白表达水平。结果 BMP-7慢病毒感染HSC-T6后,无论TGF-β1存在与否,real-time PCR检测到α-SMA、S100A4 mRNA转录下调,E-cadherin转录上调。Western blotting显示α-SMA、S100A4及Ⅰ型胶原蛋白表达下调,E-cadherin蛋白表达上调。实验组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）,空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义。结论 BMP-7能有效拮抗TGF-β1对HSC-T6的促EMT作用,可能成为肝纤维化治疗的新途径。     

五灵胶囊对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β／Smad及Ras／ERK信号通路蛋白的影响

目的探讨五灵胶囊对肝纤维化大鼠肝组织TGF-βSmad及Ras／ERK信号通路蛋白的影响,阐述五灵胶囊治疗肝纤维化的作用机制。方法SD大鼠以高脂低蛋白饲料饲养,饮用10％乙醇,并腹腔注射4．1mol／LCCl4制备肝纤维化模型,给予五灵胶囊进行治疗1个月。Westernblot检测肝组织中α-SMA、Ras、ERK、p-ERK、Smad2／3、p-Smad2／3、Smad7、TJ3RI、T13R1I;RT-PCR法检测肝组织中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1mRNA;酶法测定血清ALT、AST;ELISA测定血清COL-Ⅰ、COL-Ⅲ含量;肝组织masson和HE染色进行肝细胞变性程度与胶原纤维增生程度评分。结果五灵胶囊可显著降低血清AST、ALT水平,下调肝组织中Rasp21、α-SMA、p-ERK、T13RI蛋白与TGF-β1、COL-I、COL-Ⅲ mRNA表达（P〈0．01或0．05）,增加p-Smad2／3蛋白表达（P〈0．01）,使肝细胞变性程度与胶原纤维增生程度显著降低。结论五灵胶囊治疗肝纤维化的作用机制是显著降低肝纤维化大鼠组织肝细胞变性和胶原纤维增生的程度、抑制TGF-β／Smad及Ras／ERK信号通路TJ3RI、Rasp21、p-ERK蛋白表达及TGF-β1过量分泌。     

PAI-1引起2型糖尿病合并NAFLD小鼠肝脏炎性反应和纤维化的机制研究

目的探讨纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)对2型糖尿病(T2DM)合并非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠肝脏脂质沉积,炎性反应,纤维化等的影响。方法以C57BL/KSJ-Lepdb雄性小鼠作为T2DM合并NAFLD组(db/db组),同周龄C57BKS db/m雄性小鼠作为对照组(db/m组)。采用苏木素-伊红染色,油红О染色等方法检测小鼠肝组织切片脂质沉积;采用ELISA检测肝组织甘油三酯含量。以小鼠正常肝细胞NCTC1469作为研究对象,分为5组:对照组给予25 mmol/L葡萄糖(NG组)高渗对照组给予25 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇(HMA组)、高糖高脂组给予50mmol/L葡萄糖+0.75 mmol/L棕榈酸(HG+PA组)、高糖高脂+RNA干扰对照组(HG+PA+Si-NC组)用NC siRNA瞬时转染细胞并给予高糖高脂干预,高糖高脂+PAI-1沉默组(HG+PA+Si-PAI-1组)用PAI-1的siRNA瞬时转染细胞并给予高糖高脂干预。采用实时定量PCR和Western印迹方法检测炎性因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-1β(IL-1β),肝纤维化相关指标转化生长因子-B(TGF-3),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(Col I)以及PAI-1的表达情况。结果与db/m组相比,db/db组小鼠肝组织中出现明显脂质聚集和纤维组织增生,甘油三酯含量增加,且MCP-1,IL-1β、TGF-β,a-SMA,ColⅠ和PAI-1的mRNA和蛋白水平均明显上调(均P<0.05)。与NC组细胞相比,HG+PA组MCP-1、IL-1β、TGF-β、α-SMA、Col Ⅰ、PAI-1表达量均明显上调(均P<0.05);与HG+PA组相比,HG+PA+si-PAI-1组PAI-1、MCP-1、IL-β、TGF-β、α-SMA和ColⅠ等表达量均明显下调(均P<0.05)。结论T2DM合并NAFLD小鼠模型肝组织中PAl-1表达明显增加,抑制PAI-1表达可明显改善肝组织炎性反应和纤维化水平。     

脯氨酰寡肽酶抑制剂体外对肝星状细胞凋亡、增殖和肝纤维化相关基因表达的影响*

目的 体外探讨肝星状细胞（HSC）脯氨酰寡肽酶（POP）的生物学功能,以进一步阐述其在肝脏炎症和纤维化发生发展中的作用。方法 取HSC-T6细胞,经不同浓度的POP抑制剂（S17092）处理,采用ELISA法检测HSC-T6细胞N-乙酰基-丝氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-脯氨酸（Ac-SDKP）水平,使用流式细胞术和CCK8检测HSC-T6凋亡和增殖水平,采用实时定量-PCR法检测相关炎症和肝纤维化基因转化生长因子-β1（TGF-β1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、Ⅰ型胶原（Col I）水平,采用Western blot法检测相关蛋白（POP、TGF-β1、α-SMA、Smad7、p-Smad2/3、PPAR-γ）表达。结果 与对照组比,POP抑制剂干预组细胞内Ac-SDKP水平显著下降（P<0.05）;POP被抑制后对HSC-T6凋亡没有显著的影响（P>0.05）,但可抑制其增殖（P<0.05）;与对照组比,抑制剂组HSC内α-SMA蛋白表达显著升高（P<0.05）,而Smad7和PPAR-γ蛋白表达显著下降（P均<0.05）;抑制剂组HSC内MCP-1和α-SMA mRNA水平显著上调（P均<0.05）。结论 POP在肝星状细胞内可能发挥重要的抗炎抗纤维化作用,其机制可能与其调节Ac-SDKP及Smad7和PPAR-γ的表达有关。     

Smad3 shRNA抑制TGFβ1对HSC-T6细胞活化的抗肝纤维化作用

目的观察Smad3 shRNA对TGFβ1作用于大鼠HSC-T6细胞增殖、细胞周期以及分泌肝纤维化胶原的影响。方法Smad3 shRNA慢病毒感染HSC-T6,应用流式细胞仪检测其感染率,Real-time PCR检测对Smad3 mRNA表达的抑制作用;将HSC-T6对照、HSC-T6+TGFβ1(10 ng/ml)、Smad3 shRNA以及Smad3 shRNA+TGFβ1(10 ng/ml)这4组细胞进行如下检测:(1)MTT检测细胞增殖;(2)流式细胞仪检测TGFβ1作用24、36 h细胞周期分布;(3)Real-time PCR检测24、36 h时细胞周期、增殖及肝纤维化相关基因mRNA的表达变化;(4)ELISA检测24、36 h培养液上清中胶原蛋白(COL)Ⅰ、COLⅢ及α-SMA的含量。结果Smad3 shRNA慢病毒感染HSC-T6细胞至96 h,感染率为71.3%,对Smad3 mRNA的表达抑制率为50%。(1)MTT结果显示,TGFβ1促进HSC-T6增殖;与相应未感染Smad3 shRNA病毒组相比,Smad3 shRNA组以及Smad3 shRNA+TGFβ1组细胞增殖能力均下降。(2)细胞周期检测发现,24、36 h时,Smad3 shRNA+TGFβ1组与Smad3 shRNA组相比,细胞周期分布差异无统计学意义(P>0.05);(3)Real-time PCR显示,Smad3 shRNA+TGFβ1组较HSC-T6+TGFβ1组,Smad3、原癌基因(c-myc)、细胞周期依赖性激酶-2(CDK-2)、细胞周期素E(cyclin E)、表皮生长因子(EGF)、核因子-κB(NF-κB)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、COLⅠ及基质金属蛋白酶(MMP)14等基因的mRNA在24、36 h表达均下调,HGF mRNA及COLⅢmRNA在24 h时上调、36 h时下调,Bcl-2 mRNA、MMP1 mRNA及MMP9 mRNA在24 h和36 h两个时段均表达上调。(4)ELISA检测发现,同一时间点比较,分别在24、36 h,TGFβ1可促进HSC-T6细胞COLⅠ(P=0.00,P=0.02)、α-SMA(P=0.00,P=0.01)的分泌;与HSC-T6+TGFβ1组相比,Smad3 shRNA+TGFβ1组COLⅠ于36 h分泌减少(P=0.00)、而α-SMA在24、36 h两个时间点分泌减少(P=0.00)。结论 Smad3 shRNA抑制了TGFβ1对HSC-T6的活化,显示了抗肝纤维化作用。     

TGF-β1对大鼠HSC-T6细胞增殖、细胞周期和胶原分泌的影响

目的观察TGF-β1对大鼠肝星状细胞系HSC-T6增殖、细胞周期以及分泌肝纤维化相关胶原的影响。方法采用MTT法检测细胞增殖;使用流式细胞仪检测细胞周期;采用荧光定量RT-PCR法检测SMAD3、c-myc、cdk-2、cyclinE、EGF、HGF、Bcl-2、NF-κB、MMP1、MMP9、MMP14、TIMP-1、PAI-1、α-SMA、COLⅠ及COLⅢ等基因mRNA水平;采用ELISA法检测细胞培养液COLⅠ、COLⅢ和α-SMA含量。结果与对照组比,TGF-β1处理24h及36h时,细胞形态及生长状况均无明显变化;在24h和36h时,TGF-β1处理组细胞G0/G1期细胞比率均减少(24h:57.3±8.5%vs 60.6±9.7%;36h:53.0±2.2%vs 56.6±5.0%),S期细胞比例略高(24h:30.6±7.2%vs26.4±10.1%;36h:35.2±3.7%vs 30.8±2.5%),但差异无统计学意义(P>0.05);TGF-β1处理组SMAD3、c-myc、cdk2、cyclin E、EGF、Bcl-2、NF-κB、TIMP1、PAI-1、α-SMA及COLⅠmRNA在24h和36h表达均上调,HGF、MMP1、MMP9、MMP14及COLⅢmRNA在24h时表达下调,36h时表达上调;TGF-β1处理组HSC-T6细胞分泌COLⅠ[24h:(63.0±7.4ng/ml vs 33.2±10.8 ng/ml,P<0.05;36h:58.5±6.0ng/ml vs 42.2±6.3ng/ml,P<0.05];α-SMA[24h:20.6±2.6ng/ml vs 4.2±0.7ng/ml,P<0.05;36h:59.7±14.6ng/ml vs 36.8±5.6ng/ml,P<0.05)均显著增加。结论 TGF-β1对大鼠肝星状细胞系HSC-T6显示了促增殖作用,并能促进肝纤维化相关胶原的分泌。     

Interaction between insulin-like growth factor binding protein-related protein 1 and trans-forming growth factor beta 1 in primary hepatic stellate cells

BACKGROUND:We previously showed that insulin-like growth factor binding protein-related protein 1(IGFBPrP1) is a novel mediator in liver fibrosis.Transforming growth factor beta 1(TGFβ1) is known as the strongest effector of liver fibrosis.Therefore,we aimed to investigate the detailed interaction between IGFBPrP1 and TGFβ1 in primary hepatic stellate cells(HSCs).METHODS:We overexpressed TGFβ1 or IGFBPrP1 and inhibited TGFβ1 expression in primary HSCs for 6,12,24,48,72,and 96 hours to investigate their interaction and observe the accompanying expressions of α-smooth muscle actin(α-SMA),collagen I,fibronectin,and phosphorylated-mothers against decapentaplegic homolog 2/3(p-Smad2/3).RESULTS:We found that the adenovirus vector encoding the TGFβ1 gene(Ad TGFβ1) induced IGFBPrP1 expression while that of α-SMA,collagen I,fibronectin,and TGFβ1 increased gradually.Concomitantly,Ad IGFBPrP1 upregulated TGFβ1,α-SMA,collagen I,fibronectin,and p-Smad2/3 in a time-dependent manner while IGFBPrP1 expression was decreased at 96 hours.Inhibition of TGFβ1 expression reduced the IGFBPrP1-stimulated expression of α-SMA,collagen I,fibronectin,and p-Smad2/3.CONCLUSIONS:These findings for the first time suggest the existence of a possible mutually regulation between IGFBPrP1 and TGFβ1,which likely accelerates liver fibrosis progression.Furthermore,IGFBPrP1 likely participates in liver fibrosis in a TGFβ1-depedent manner,and may act as an upstream regulatory factor of TGFβ1 in the Smad pathway.