稳定表达EGFP的不同转移特性骨肉瘤细胞亚株建立及其生物学特性

目的：建立经绿色荧光蛋白基因转染的骨肉瘤细胞亚株并研究其生物特性。方法：利用脂质体转染pEGFP人人骨肉瘤MG63细胞系，通过细胞电泳，获得两株细胞克隆M6和M8，经体外细胞增殖、软琼脂形成、生长曲线、裸鼠成瘤试验综合分析其生物学行为改变。应用组织形态学观察、染色体分析、软琼脂克隆形成法研究癌细胞的生物学特性。结果：发现M6和M8两株均保持人类染色体核型，所形成肿瘤显示人成骨肉瘤上皮样组织形态，其中M6的群体倍增时间为38．4h，软琼脂形成率为18．7％，M8群体倍增时间为23．0h，软琼脂形成率为29．3％。裸小鼠背部皮下接种M6和M8，发现M8成瘤时间短，细胞增殖快，但在4周内两者均不发生转移。结论：骨肉瘤细胞亚系有不同的转移特性，GFP的整合及表达未对MG63细胞的生长状态造成明显影响，可作为报告基因进一步了解骨肉瘤细胞转移的差异性分析。     

两株人成骨肉瘤克隆细胞株的建立及其生物学特性

通过克隆技术及体内移植,从自建的成骨肉瘤细胞 Ｌ Ｔ Ｈ Ｏ Ｓ（简称 Ｓ）中获得两株细胞克隆 Ｓ１ 和 Ｓ２,应用组织形态学观察、染色体分析、软琼脂克隆形成法以及裸小鼠体内成瘤试验研究癌细胞的生物学特性。结果发现 Ｓ１ 和 Ｓ２ 两株均保持人类染色体核型,所形成肿瘤显示人成骨肉瘤上皮样组织形态,其中 Ｓ１ 的细胞电泳率高达１．０, Ｓ２ 为０．７０, Ｓ１ 的群体倍增时间为２２．４ ｈ,软琼脂形成率为３３．５％ , Ｓ２ 群体倍增时间为２４．０ ｈ,软琼脂形成率为２３．１％ 。裸小鼠右后肢皮下接种 Ｓ１ 和 Ｓ２,发现 Ｓ１ 成瘤时间短,细胞增殖快,但在４ 周内两者均不发生转移;通过尾静脉注射 Ｓ１ 和 Ｓ２ 细胞,发现４ 周时,接种 Ｓ１ 细胞的裸鼠出现广泛的实验性肺转移,接种 Ｓ２ 细胞的裸鼠肺部仅见几个分散的癌细胞。     

人卵巢癌OVCAR3细胞系中侧群细胞的分离及其成瘤性、侵袭性的实验研究

目的  分离卵巢癌细胞系OVCAR3中的侧群(SP)细胞,并观察其成瘤性和侵袭性。 方法  利用流式细胞荧光激活分选法将卵巢癌OVCAR3细胞系分成SP和非侧群(non-SP)细胞两个亚群。对两个亚群细胞分别采用软琼脂克隆形成实验和细胞球形成实验观察其体外成瘤能力;Transwell小室法检测两个亚群细胞的体外侵袭力。  结果  OVCAR3细胞株中外排Hoechst33342的SP细胞占13.1％,加入维拉帕米SP细胞的比例为1.8%。SP细胞的体外克隆形成率为(46.17±23.27)％,non-SP细胞仅为(6.17±3.06)％,SP细胞克隆形成率高于non-SP细胞(P<0.05);细胞球形成实验结果显示,SP细胞能在无血清的培养液中形成细胞球,而non-SP细胞则不能;Transwell侵袭实验结果显示,SP表型细胞穿过Matrigel基底膜的细胞数为(215.9±30.9)个,non-SP表型细胞仅为(60.9±10.5)个。  结论  卵巢癌OVCAR3细胞系中存在外排Hoechst33342荧光染料的SP细胞,其成瘤性、侵袭力均强于non-SP亚群细胞,表明SP表型的肿瘤细胞在卵巢癌的生长、侵袭及转移中具有重要的地位。     

不同转移潜能乳腺癌细胞亚系的建立与生物学特性的分析

目的探讨利用细胞穿透人工基质膜能力的差异筛选不同转移潜能乳腺癌细胞的可行性,并分析二者生物学特性差异。方法人乳腺癌细胞系MDA-MB-435s经过连续人工基质膜侵袭试验后获得高、低转移潜能细胞株,并应用细胞生长曲线测定、侵袭力、黏附率实验,促血管形成实验分析所筛选出的不同转移潜能乳腺癌细胞的生物学性质的差异。结果获得2株转移潜能不同的乳腺癌细胞株,它们具有差异明显的体外生长速度、侵袭力、黏附力和促血管形成能力。结论利用细胞穿透人工基底膜能力的差异能够筛选出高、低转移潜能的乳腺癌细胞。     

c—erbB—2基因对小鼠成纤维细胞生长特性的影响

为探讨ｃ－ｅｒｂＢ－２基因对细胞增殖的影响。本实验通过构建ｃ－ｅｒｂＢ－２基因的表达载体一转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，观察了转染细胞的生长特性。发现其对数生长期提前，群体倍增时间缩短，并且其克隆形成率，软琼脂集落形成能力，及裸鼠致瘤能力均明显高于对照组。     

食道鳞状上皮细胞癌转移体外细胞模型的建立

目的建立一个适宜的食道鳞状上皮细胞癌（ESCC）体外转移研究模型。方法将ESCC细胞系HK2置于未处理细胞培养皿中培养、传代,筛选出具有非锚定依赖生长能力的细胞株。以体外侵袭实验。软琼脂克隆形成实验比较、验证筛选细胞系与母代细胞的侵袭能力和非锚定依赖生长能力。利用比较蛋白质学的方法分析筛选细胞与母代细胞间的蛋白表达图谱差异。结果成功筛选出具有较高转移能力并可传代培养的HK2-AD细胞株。HK2和HK2-AD细胞侵袭至小室膜反侧的细胞数分别为（16．7±2．5）和（28．7±7．4）,软琼脂集落生成实验表明,HK2和HK2-AD细胞形成的集落数分别为（16．8±3．2）和（25±5．1）,差异均有统计学意义（P〈0．05）。HK2-AD细胞中一些与细胞运动、细胞无氧代谢及抑制凋亡相关的蛋白质分子表达明显上调。结论利用肿瘤细胞的非锚定依赖生长特性建立了一个高转移能力、呈三维生长的HK2-AD细胞株,为ESCC肿瘤转移机制研究和药物筛选提供了一个有价值且易于操作的食道癌转移体外细胞模型。     

MHCC97中边缘群细胞的成瘤性及其侵袭性观察

目的:分离肝癌细胞系MHCC97中边缘群细胞并观察其成瘤性和侵袭性.方法:利用流式细胞荧光激活分选法将肝癌细胞系MHCC97分成边缘群(SP)和主群(MP)细胞两个亚群. 对两个亚群细胞分别采用软琼脂克隆形成实验和裸鼠成瘤试验观察其体内外成瘤能力;Transwell小室法检测两个亚群细胞的体外侵袭力.结果:SP细胞的体外克隆形成率为57%,MP细胞仅为13%;1×103个SP细胞可在4 wk后形成明显的皮下移植瘤(2/8),MP细胞则需1×105个才能成瘤(2/8). Transwell侵袭试验结果显示,SP表型细胞穿过人工基底膜的细胞数为(66.6±4.0)个,MP表型细胞仅为(18.2±1.9)个.结论:肝癌细胞系MHCC97中SP亚群的成瘤性和侵袭性均强于MP亚群细胞,表明SP表型的细胞在肝细胞癌的生长、转移中具有重要的地位.     

Boyden小室侵袭试验测定膀胱癌细胞的体外侵袭力

目的 :用Boyden小室侵袭试验测定膀胱癌细胞的体外侵袭力 ,并探索肿瘤细胞侵袭与其它生物学习性之间的关系。方法 :采用人工基底膜构建侵袭小室。测定EJ、T2 4、BIU 873个膀胱癌细胞株的体外侵袭力 ,并测定细胞的生长曲线、集落形成率、体外趋化运动性等指标 ,分析这些指标与体外侵袭力的关系。用扫描电镜观察侵袭过程中癌细胞的形态变化。结果 :EJ、T2 4、BIU - 87的侵袭细胞数分别为 :39 2 6± 13.90、77 0 0± 13 2 8、166 53± 2 7 2 0 ,癌细胞的体外侵袭力分别与细胞的体外运动性和生长曲线有密切关系。电镜下可见细胞通过变形运动穿过微孔 ,并伸出丝状伪足来协助运动。结论 :Boyden小室侵袭试验为测定体外癌细胞侵袭力较可靠的方法。肿瘤的侵袭力与细胞的某些生物学习性有关 ,因而测定有关指标也可间接判断肿瘤的侵袭力。     

TMSG-1基因转染对肿瘤转移表型的影响

目的：研究肿瘤转移抑制基因TMSG-1对肿瘤转移表型的影响。方法：将含TMSG-1全长开放阅读框架的1.5kb cDNA克隆于pcDNA3，构建正义及反义TMSG-1 cDNA真核表达载体，以脂质体转染人肺巨细胞癌PG的高转移亚系BE1，挑选G418抗性克隆，RT-PCR检测正义或反义TMSG-1cDNA在转染细胞中的表达，进行转染细胞体外肿瘤生物学行为检测。结果：RT-PCR显示正义TMSG-1cDNA转染的BE1细胞（BE1-S）中TMSG-1表达明显高于BE1及空载体对照细胞，反义TMSG-1cDNA转染细胞（BE1-AS）中TMSG-1表达低于空载体对照细胞。与BE1及空载体对照细胞（BE1-V）相比，BE1-AS细胞体外生长较快，软琼脂克隆形成能力明显增强；而BE1-S细胞体外生长能力没有显著改变，但其穿越Matrigel的能力及软琼脂克隆形成能力明显减弱。流式细胞仪分析结果显示BE1-S的G0、G1期的细胞较BE1-V细胞比例增多，并且BE1-S出现了细胞凋亡峰。结论：实验结果表明反义TMSG-1基因转染可增强BE1细胞的体外生长、体外侵袭能力及克隆形成能力。而正义TMSG-1基因转染则使BE1细胞的侵袭能力及软琼脂克隆形成能力减弱，而对细胞体外生长能力无明显影响。结论支持TMSG-1是一个肿瘤转移抑制基因。     

血管内皮生长因子过度表达促进卵巢癌浸润转移的机制

为研究血管内皮生长因子 (VEGF)过度表达在卵巢癌转移中的作用及可能机制 ,以脂质体介导 VEGF c DNA转染 2株卵巢癌细胞系 Ca OV- 3、COC1,经逆转录聚合酶链式反应 (RT- PCR)、Western blot检测转染 VEGF c DNA前后癌细胞 VEGF、明胶酶 A(MMP- 2 ) m RNA及蛋白表达水平 ;Boyden小室体外侵袭实验比较 VEGF c DNA转染 2株癌细胞前后通过人工重组基底膜的能力变化。结果显示 :VEGF c DNA转染后 2株卵巢癌细胞 VEGF、MMP- 2在 m RNA及蛋白表达水平均较转染前明显增强。Boyden小室体外侵袭实验表明转染 VEGF c DNA的 Ca OV- 3和 COC1穿过人工重组基底膜的相对百分率为 (42 .5± 4 .1) %、 (2 6 .8± 2 .4 ) % ,较对照组穿膜细胞相对百分率 (2 4 .7± 1.9) %、 (8.6±1.1) %明显增加。提示微环境中 VEGF参与了卵巢癌浸润、转移 ,其机制可能与诱使 MMP- 2合成及分泌增加有关     

SGC-7901/HCPT裸鼠皮下移植瘤的建立和鉴定

目的:建立多药耐药人胃癌细胞裸鼠移植瘤模型并探讨移植瘤的耐药特性。方法:将人胃癌细胞株SGC-7901和耐药细胞株SGC-7901/HCPT分别接种于裸小鼠左侧背部皮下和右侧背部皮下,在SPF级动物合格环境下饲养,观察肿瘤细胞成瘤情况,用MTT法比较移植瘤细胞对羟基喜树碱的敏感性及免疫组化测定其耐药基因TOPO-Ⅰ表达的变化。结果:SGC-7901和SGC-7901/HCPT裸小鼠移植成瘤率为100%,无自行消退现象。MTT法测定SGC-7901/HCPT和SGC-7901/HCPT/nude的IC50分别为4.686μg/mL和4.381μg/mL,与移植前细胞比较,差异无统计学意义。耐药基因TOPO-Ⅰ表达分别为2.964±0.162和2.953±0.172,差异无著性意义。结论:以SGC-7901/HCPT细胞建立的裸鼠皮下耐药移植瘤模型,仍保持体外的耐药活性和基因表型,为耐药机制和逆转的研究提供了良好的动物模型。     

TIMP—2基因转染对高转移性人巨细胞肺癌细胞系生物学行为的影响

探讨金属蛋白酶组织抑制因子ＴＩＭＰ－２对肿瘤恶性表型的逆转作用及其在肿瘤基因治疗上的意义。方法利用基因重组技术构建了含全长ＴＩＭＰ－２ｃＤＮＡ的真核表达载体，用脂质体法转染高转移性人肺癌细胞（ＰＧ），检测转染后ＰＧ细胞的金属蛋白酶（ＭＭＰｓ）活性、体外侵袭、裸鼠体内成瘤性及转移能力等多项生物学行为的变化。并以ＴＩＭＰ－２基因转染前后ＰＧ细胞的裸鼠皮下移植瘤为研究对象，利用免疫组织化学和原位杂交方法，研究在整体环境下ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９和ＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２的ｍＲＮＡ及蛋白表达情况。结果转染细胞较母系细胞ＴＩＭＰ－２ｍＲＮＡ表达增强，ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９的产生及活性无明显变化，体外增殖能力增强，但体外侵袭和软琼脂集落形成能力以及裸鼠体内成瘤性及自发转移能力下降。此外，ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－９和ＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２在ＰＧ细胞之裸鼠皮下移植瘤的间质细胞及肿瘤细胞均有表达，阳性的肿瘤细胞主要位于肿瘤和间质交界处。结论特异性上调ＴＩＭＰ－２基因的表达可在一定程度上逆转ＰＧ细胞的恶性表型。     

B16M高低转移株的筛选及其生物学异质性的分析

目的 筛选B16M高低转移株,以探讨B16M的转移异质性及机制.方法 通过B16M自发肺转移模型筛选出转移性能不同的细胞株,并用实验性和自发性肿瘤转移模型验证其在体内生长、转移性. 通过细胞增殖、3H-TdR参入实验、流式细胞技术、细胞侵袭离散实验研究了高、低转移B16M细胞株体外增殖能力、侵袭能力以及对离散因子的反应的差异,Western印迹实验研究细胞c-met表达及活化水平. 结果在所筛选出的3株可疑高转移B16M细胞株中,H3 B16M细胞接种于同系C57BL/6小鼠体内所形成的原发瘤重量、实验和自发性肺转移结节数明显高于其他细胞株;该细胞株增殖能力、侵袭性及对离散因子的反应能力的也明显高于其他细胞株.c-met表达及磷酸化水平也升高.结论成功的筛选出B16M 高、低转移细胞株,两者在细胞增殖、侵袭能力、离散能力等方面有差别.这种差异可能与c-met有关.     

小肾癌的临床病理特征:单中心1276例经验总结

目的:研究小肾癌(≤4.0 cm)的临床病理特点.方法:回顾性分析2002年1月至2012年6月间初诊于北京大学第一医院泌尿外科的肾肿瘤患者,记录肿瘤大小、病理亚型、Fuhrman分级(G1 ～ G4)、TNM分期及肿瘤是否存在脉管侵犯、肉瘤样分化、是否具有多灶性,并分组进行比较.结果:共有1 276名患者被纳入研究进行分析,其中306例(24.0％)肿瘤直径≤2.0 cm,526例(41.2％)在2.0～3.0 cm之间,444例(34.8％)＞3.0 cm.从病理亚型来看,有1 158例(90.7％)透明细胞癌、49例(3.8％)乳头状癌、32例(2.5％)嫌色细胞癌、33例(2.6％)多房囊性肾细胞癌及4例其他亚型,病理亚型在不同肿瘤直径组间差异无统计学意义.在直径≤2.0 cm组和＞2.0 cm组,肿瘤分级为G3/4者分别有15例(4.9％)和98例(10.1％),差异有统计学意义(P=0.007);T3a及以上分期者分别有1例(0.3％)和32例(3.3％),差异亦有统计学意义(P=0.004).存在同时性远处转移者共6例,均出现在＞2.0 cm组,且存在肉瘤样分化、脉管癌栓及多灶性的肿瘤也多见于＞2.0 cm组,但两组间差异无统计学意义.结论:小肾癌中直径＞2.0 cm者的肿瘤分级、分期与≤2.0 cm者相比有明显差异且更易发生转移,提示对于直径＞2.0 cm且影像学显示肾恶性肿瘤者不宜选取非手术干预的治疗策略.     

肾癌组织中微血管密度检测及其临床意义

目的探讨肾癌微血管密度(MVD)与其组织学类型、肿瘤分级及转移之间的关系;评价MVD对肾癌预后估价的意义.方法应用Ⅷ因子相关抗原(FⅧ-R Ag)单克隆抗体进行免疫组化SABC法染色,检测49例原发性肾癌根治性切除术标本中MVD.结果49例肾癌组织中平均MVD为58.62±23.86,明显高于正常肾组织(P＜0.01).MVD与其局部淋巴结转移无相关性(P＜0.05),而与肾癌的分级及远处转移呈正相关(P＜0.01),与5年生存期呈负相关(P＜0.01).结论肾癌组织中MVD与其组织学类型、肿瘤分级、远处转移及生存期均密切相关,检测肿瘤组织中MVD可作为估介肾癌预后的一项重要指标.     

RON变异体RONA1-70对结肠癌细胞株HT29的抑制作用

目的研究受体型酪氨酸激酶RON的剪切变异体△170对结肠癌细胞株HT29生长和移动浸润能力的抑制作用。方法HT29细胞转染质粒pcDNA3．1-RON△170,建立稳定表达RON△170的HT29-RONA170细胞株;免疫沉淀法检测细胞RON的酪氨酸磷酸化;软琼脂培养法观察RON△170对HT29细胞生长能力的作用;体外跨室趋化运动实验检测RONA170对HT29细胞移动浸润能力的作用。结果成功建立HT29-RONA170细胞株,流式细胞仪胞膜蛋白检测法证明其稳定表达RONA170蛋白;免疫沉淀试验结果显示RONA170能抑制HT29的RON酪氨酸磷酸化;软琼脂生长实验示转染组细胞生长克隆数为33．0±6．0,而未转染组和载体对照组分别为55．7±65和49．3±87（P〈0．01）;体外跨室趋化运动实验结果示转染组穿膜细胞数为231．5±27．6,而未转染组和载体对照组分别为3845±23．3和360．0±156（P〈0.01）。结论受体型酪氨酸激酶RON的变异体RONA170可抑制HT29细胞生长,并显著抑制其移动浸润能力,具有显性抑制变异体特性。     

反义核酸药物癌泰得对乳腺癌细胞株的体外杀伤作用

目的探讨反义核酸药物癌泰得对乳腺癌细胞株的体外杀伤作用。方法1）MTT法测定不同浓度癌泰得对乳腺癌细胞株BT474的抑制率。2）Annexin/PI双染法,流式细胞仪检测细胞凋亡比率。结果MTT法观察到癌泰得对BT474细胞的杀伤作用,流式细胞仪检测到BT474细胞凋亡率达16.82%,以晚期凋亡为主。结论癌泰得对BT474细胞有抑制作用,抑制率与浓度呈线性相关。     

临床T1期肾细胞癌肾窦侵犯的危险因素

目的: 总结临床T1(cT1)期肾细胞癌的临床影像学特点,探究影响cT1期肾细胞癌患者发生肾窦侵犯的危险因素。方法: 回顾性分析2016年1月至2019年8月于北京大学第三医院泌尿外科住院行肾部分切除术或根治性肾切除术,术前诊断为cT1期肾细胞癌的患者,收集患者的临床、影像学和病理学资料。采用卡方检验、Mann-Whitney U检验、多因素Logistic回归,对cT1期肾细胞癌发生肾窦侵犯的相关危险因素进行分析。结果: 共纳入507例患者,其中男性354例(69.8%),女性153例(30.2%),中位年龄59岁,中位体重指数25.5 kg/m²。术前有肉眼血尿者18例(3.6%),中位肿瘤直径3.5 cm。cT1a期322例(63.5%),cT1b期185例(36.5%),中位R.E.N.A.L.评分为8分。肿瘤边界规则者359例(70.8%),肿瘤边界不规则者148例(29.2%)。所有患者均行手术治疗,包括186例(36.7%)肾部分切除术和321例(63.3%)根治性肾切除术。术后病理提示肾窦侵犯75例(14.8%),其中cT1a期侵犯肾窦18例,占cT1a期总数的5.6%;cT1b期侵犯肾窦57例,占cT1b期总数的30.8%。单因素分析发现,年龄(P=0.02)、R.E.N.A.L.评分(P<0.001)、肿瘤边界状态(P<0.001)是cT1期肾细胞癌发生肾窦侵犯的相关危险因素。多因素Logistic回归显示,R.E.N.A.L.评分(P≤0.020)和肿瘤边界状态(P=0.001)是cT1期肾细胞癌发生肾窦侵犯的独立危险因素。结论: 对cT1期肾细胞癌,术后接近15%的患者存在肾窦侵犯现象;R.E.N.A.L.高评分和肿瘤边界不规则,均可以提示cT1期肾细胞癌有发生肾窦侵犯的风险。     

微血管密度在判断肾细胞癌Robson分期中的作用

目的用免疫组织化学的方法，染色肾癌组织中的微血管，探讨血管形成（血管密度）与临床分期的关系。方法用第八因子相关抗原（FS－relatedantigen）的单克隆抗体，对41例肾细胞癌石蜡切片行免疫组化染色，分别计数×200视野和格子内染色的微血管数。结果Robson分期为Ⅰ期的血管数平均为421，Ⅱ期为56．3，Ⅲ-Ⅳ期为84．4。血管计数与临床分期相关（P＜0．05）。结论随着肿瘤恶性程度的增加，血管密度也增加，血管形成可作为判断肾细胞进展、估计预后的可靠指标。     

nm23-H1在口腔鳞癌中的表达及意义

目的：研究ｎｍ２３－Ｈ１表达与口腔鳞癌转移间的关系。方法：应用免疫组化ＳＰ法检测了４０例口腔鳞癌ｎｍ２３－Ｈ１的表达。结果：ｎｍ２３－Ｈ１在口腔鳞癌中有较高的表达,阳性率为６７．５％（２７／４０）;淋巴结转移组ｎｍ２３－Ｈ１的阳性率为４０％（４／１０）;非淋巴结转移组ｎｍ２３－Ｈ１的阳性率为７６．７％（２３／３０）,两组差异有显著性（Ｐ＜０．０５）。结论：ｎｍ２３－Ｈ１在抑制口腔鳞癌转移中具有一定的作用并可望成为指示口腔鳞癌淋巴结转移的一个新指标。