几丁质支架对体外间质干细胞成软骨分化的影响

目的鉴定间充质干细胞诱导分化为软骨细胞后,其在单层培养和几丁质支架上培养的差别。方法密度梯度离心兔股骨骨髓,分离BMSCs,用TGF-β1诱导第3代的BMSCs向软骨方向分化,2周后检测Ⅱ型胶原表达情况。将分化后的软骨样细胞传代,用无TGF-β1的培养基分别进行单层培养和接种在几丁质支架上培养2周,再用免疫组化检测Ⅱ型胶原表达情况。结果BMSCs经TGF-β1诱导后向软骨细胞方向分化,诱导后的细胞在无TGF-β1的培养中,采用单层培养方式的软骨细胞很快出现去分化表型,而接种在几丁质支架上的细胞仍能较好表达Ⅱ型胶原。结论几丁质支架在延缓软骨细胞去分化和老化方面有积极作用。     

转化生长因子β1缓释载体诱导骨髓基质干细胞成软骨分化

目的探讨转化生长因子β1（TGF—β1）缓释对骨髓基质干细胞诱导成软骨分化的影响。方法乳化交联法制备TGF—β1壳聚糖缓释微球并将其与壳聚糖支架复合，将骨髓基质干细胞置于复合载体中立体培养，通过HE染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、扫描电镜观察复合载体对细胞的增殖、分化及功能的影响。结果骨髓基质干细胞于复合载体中培养，细胞形态类似软骨细胞，并可见细胞增殖及细胞外基质分泌，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示基质中有Ⅱ型胶原表达，其细胞增殖率及Ⅱ型胶原分泌功能均较对照组明显增强。结论复合载体能够控制TGF-β1的释放并保持其活性，可促进骨髓基质干细胞的增殖并诱导其向软骨细胞分化。     

转导人端粒酶逆转录酶基因致人骨髓间充质干细胞永生化并向软骨细胞诱导分化的研究

目的 建立永生化人骨髓间充质干细胞系并向软骨细胞诱导分化,以供软骨组织工程基础研究及临床应用.方法 原代培养人骨髓间充质干细胞(hMSC),用含有人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的逆转录病毒转染hMSC,G418筛选得到阳性克隆,体外连续培养,检测端粒酶的表达及活性.TGF-β1和地塞米松对转化后的hMSC-hTERT细胞诱导,使其向软骨细胞分化,并用原位杂交和免疫组化检测II型胶原.结果 外源性hTERT在转染细胞中稳定表达并传至第50代,永生化的hMSC细胞经TGF-β1和地塞米松诱导在体外分化为软骨细胞.结论 外源性hTERT基因可以有效地在体外使hMSC永生化,永生化的hMSC细胞经诱导可在体外分化为软骨细胞,从而作为软骨组织工程研究的细胞来源.     

重组hTGF-β1腺病毒转染BMSCs及其转录增强因子TAZ mRNA表达变化的研究

目的 探讨Ad-hTGF-β1转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)并诱导其向成软骨细胞分化的可行性及其相关转录因子TAZ mRNA表达的变化.方法 全骨髓法获取和培养大鼠骨髓间充质干细胞,取第三代细胞接种于细胞培养板.实验分成三组:Ad-hTGF-β1转染组、Ad-EGFP转染组、空白对照组,前两组分别使用含Ad-hTGF-β1与Ad-EGFP的无血清培养基,空白对照组使用不做任何处理的完全培养基.7 d后,运用实时荧光定量PCR与Western blot检测TGF-β1的表达,利用免疫组织化学方法与Western blot检测CollagenⅡ的表达,采用实时荧光定量PCR检测TAZ mRNA的表达.结果 转染后7 d,实时荧光定量PCR结果显示TGF-β1表达量的平均相对比值分别为:Ad-hTGF-β1转染组0.863、Ad-EGFP转染组0.183、空白对照组0.180;TAZ表达量的平均相对比值分别为:Ad-hTGF-β1转染组0.810、Ad-EGFP转染组0.416、空白对照组0.366.TGF-β1和TAZ的表达差异有统计学意义(P＜0.05).Western blot和免疫组化发现Ad-hTGF-β1转染组的细胞内Collagen Ⅱ表达呈强阳性,而Ad-EGFP转染组及空白对照组细胞内的Collagen Ⅱ表达很弱.结论 Ad-hTGF-β1能够成功且稳定的诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化.同时,在骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化过程中,转录增强因子TAZ的mRNA水平随之上调,认为TGF-β1可能通过TAZ的作用促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化.     

永生化人骨髓间充质干细胞系的建立及致瘤性的检测

目的构建永生化的人骨髓间充质干细胞系并对其分化能力及其安全性进行评估,以供骨科基础研究及临床应用。方法原代培养人骨髓间充质干细胞,外源性hTERT导入人骨髓间充质干细胞激活端粒酶,获得永生化的人骨髓间充质干细胞。TGF-β_1和地塞米松诱导,使其向软骨细胞分化,并用原位杂交和免疫组化检测Ⅱ型胶原将永生化的人骨髓间充质干细胞和原代培养的人骨髓间充质干细胞按一定密度接种于双层软琼脂培养基中,观察2周后克隆形态并计算克隆形成率。两种细胞接种于裸鼠背部皮下,分别在术后3天、1个月和3个月肉眼观察。结果原代培养人骨髓间充质干细胞和永生化的人骨髓间充质干细胞在向软骨细胞分化的能力上,无显著差异。原代培养的间充质干细胞不能在软琼脂中形成克隆,而永生化的间充质干细胞形成两种克隆,其克隆形成率0.3%。永生化的间充质干细胞接种裸鼠后3天、1个月、3个月后未见明显肿物形成。结论永生化的间充质干细胞可在体外分化为软骨细胞,且无致瘤性。     

胰岛素样生长因子-1基因转染脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的研究

目的 观察胰岛素样生长因子(IGF)-1基因转染的脂肪间充质干细胞(ADSCs)向软骨细胞分化的效果.方法 原代培养兔ADSCs,免疫荧光法检测细胞表面抗原CD44、CIM9;脂质体介导人IGF-1基因转染兔ADSCs联合低浓度血清培养基向软骨细胞分化诱导,RT-PCR及Western blot方法检测IGF-1的表达,MMT法绘制细胞增殖曲线、甲苯胺蓝染色软骨结节、免疫组织化学检测Ⅱ型胶原的表达.结果 脂肪间充质干细胞CD44、CD109表达阳性,基因转染后细胞IGF-1表达阳性,细胞增殖速度增快,出现软骨结节,Ⅱ型胶原表达增高.结论 从脂肪组织中能够分离出增殖旺盛的ADSCs,IGF-1在ADSCs内获得稳定表达,细胞增殖能力增强,促进其向软骨细胞分化.     

骨髓间充质干细胞在β3转化生长因子联合胰岛素样生长因子-1定向诱导下的软骨组织工程

目的探讨β3转化生长因子（TGF-β3）在诱导骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）向软骨细胞分化中胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的作用以及在软骨组织工程中的应用。方法在体外用TGF—β3或（和）IGF-1诱导藻酸钠微球中的MSCs向软骨细胞定向分化,免疫组织化学、逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖（aggrecan）的表达,Western印迹法检测Sox9蛋白的表达,激光共聚焦显微镜和扫描电镜观察该软骨细胞在壳聚糖支架上的生长。结果TGF-β3。能诱导藻酸钠微球中的MSCs表达软骨特异性的Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和Sox9,IGF-1能显著性地增强这种作用（P〈0．05）。Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖和Sox9之间的相关系数分别为0．95和0．91。诱导的软骨细胞能在壳聚糖支架上黏附、迁徙、增殖。结论在TGF-β3诱导MSCs分化成软骨细胞地过程中,IGF-1可能通过促进Sox9的表达起到协同作用。诱导分化后的软骨细胞与壳聚糖复合支架表现出良好的组织相容性。     

基因转染脂肪间充质干细胞作为软骨组织工程种子细胞的研究

目的 观察人转化生长因子(hTGF)β2基因转染诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞的定向分化能力,探讨脂肪间充质干细胞作为种子细胞和在基因增强的软骨组织工程中应用的可行性.方法 取3周龄Lewis大鼠的脂肪组织,消化法获得脂肪间充质干细胞,pcDNA 3.1(+)/hTGFD2通过脂质体介导转染脂肪间充质干细胞,用免疫化学染色、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测筛选的阳性克隆细胞中hTGFB2基因与软骨特异性蛋白-Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的情况;然后将基因转染的脂肪间充质干细胞与PLGA支架体外构建细胞-载体复合物,再将其植入裸鼠体内,12周后观察基因增强的组织工程软骨的形成情况.结果 从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪问充质干细胞,能大量稳定增殖传代.hTGFB2基因在脂肪间充质干细胞内能瞬时及稳定表达,并促使Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成;细胞.载体复合物在裸鼠体内经12周的培养,可以形成形态、结构接近正常软骨的组织工程软骨.结论 PODNA 3.1(+)/hTGFl32成功转染脂肪间充质干细胞,诱导其向软骨细胞分化,脂肪间充质干细胞可作为基因增强的软骨组织工程较理想的种子细胞.     

转化生长因子-β2体外诱导骨髓间充质干细胞表达软骨细胞表型的观察

目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)在转化生长因子(TGF-β2)诱导下向软骨细胞表型转化的能力,探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可能性。方法抽取兔髂骨骨髓液3～4ml,进行原代和传代培养,传代后实验组以高糖DMEM无血清特定培养液诱导,培养液含TGF-β210ng/ml、地塞米松10-7mol/L、维生素C50μmol/L;对照组以高糖DMEM无血清培养液培养,相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。结果诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色深而均匀。结论TGF-β2可有效诱导MSCs向软骨细胞表型转化,分泌软骨细胞特异性基质,有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源。     

TGF-β2体外诱导骨髓间充质干细胞表达软骨细胞表型的观察

目的：观察骨髓间充质干细胞（MSCs）在TGF-β2诱导下向软骨细胞表型转化的能力,探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可能性。方法：抽取兔髂骨骨髓液3-4ml,进行原代和传代培养,传代后实验组以高糖DMEM无血清特定培养液诱导f含TGF-β2 10ng／ml、地塞米松10^-7M、维生素C50μmol／L）,对照组以高糖DMEM无血清培养液培养,相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。结果：诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21天后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀。结论：TGF-β2可有效诱导MSCs向软骨细胞表型转化,分泌软骨细胞特异性基质,有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源。     

骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的：探讨分离骨髓间充质干细胞（MSCs）并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据。方法：抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[含转化生长因子（TGF-β2）10ng／ml、地塞米松10^7mol／L、维生素C50μmol／L,经7、14、21d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。将诱导细胞与软骨支架材料-聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸（CPP／PLLA）复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况。结果：诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀。诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长。结论：体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞。     

骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的:探讨分离骨髓间充质干细胞(MSCs)并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据.方法:抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[转化生长因子(TGF-β2)10ng/ml、地塞米松10-7mol/L、维生素C 50μmol/L],经7、14、21 d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.将诱导细胞与软骨支架材料--聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸(CPP/PLLA)复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况.结果:诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21 d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀.诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长.结论:体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞.     

不同相对分子质量透明质酸对兔骨髓来源间充质干细胞成软骨分化的影响

目的 观察不同相对分子质量透明质酸(HA)对兔骨髓来源间充质干细胞(MSCs)向软骨方向定向分化的影响.方法 取P3代未诱导的骨髓来源间充质干细胞,培养液中分别添加不同相对分子质量透明质酸做诱导剂,分为3个实验组,A组:相对低分子质量组(基础培养基+ HA 0.1 g/L,相对分子质量约1000×103),B组:相对中分子质量组(基础培养基+HA0.1 g/L,相对分子质量约1800×103),C组:相对高分子质量组(基础培养基+HA 0.1 g/L,相对分子质量约2000×103).同时设立阳性对照组[基础培养基+ 10 μg/L转化生长因子-β3( TGF-β3)]及空白对照组(基础培养基),观察细胞形态及增殖情况,分别于诱导后第7、14、21天行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,另外采用免疫组织化学染色及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测细胞Ⅱ型胶原表达.结果 经添加软骨诱导剂后,干细胞细胞增殖速度放缓,形态逐渐改变,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性.RT-PCR检测示实验组Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,诱导至21 d可见各实验组Ⅱ型胶原基因相对表达量分别为0.64±0.06、0.72±0.03、0.75±0.01,与阴性对照组(0.09±0.03)、阳性对照组(0.96±0.15)比较差异均有统计学意义,但B、C组间Ⅱ型胶原表达相似.结论 不同相对分子质量外源性HA诱导兔MSCs向软骨细胞分化的能力存在差异,相对高分子质量的HA的诱导能力较相对低分子质量HA的诱导能力强.证明透明质酸的相对分子质量与MSCs的软骨分化有关联性,但均比TGF-β3的诱导能力弱.     

MicroRNAs在骨髓间充质干细胞成软骨分化中的作用

软骨组织由细胞外基质与分散其间的软骨细胞共同构成，由于缺乏血管?神经和淋巴系统，损伤后自身修复能力差。目前各种促进软骨损伤修复的方法效果都不理想，诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化修复软骨损伤已成为当下研究的热点。多种MicroRNA参与并调控骨髓间充质干细胞成软骨分化过程，本文就MicroRNA调控骨髓间充质干细胞成软骨分化及其机制的研究进展做一综述。     

血管内皮生长因子对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响

[目的]探讨外源性血管内皮生长因子（VEGF）对人骨髓来源间充质干细胞（MSCs）增殖、向成软骨方向定向分化等生物学行为的影响及其机理，为MSCs构建组织工程化软骨奠定基础．[方法]取人骨髓来源间充质干细胞体外培养，将传代后的细胞分别置于含有800ng／ml和1600ng／ml VEGF的诱导培养基中进行培养，将具有促进细胞增殖分化及抑制多种炎性介质活性等多重生物学效应的TGF-β1以10ng／ml浓度配置无血清培养基诱导同组MSCs作阳性对照，观察细胞的增殖，分化。用Ⅱ型胶原免疫组化染色评价不同诱导因素下的软骨基质合成情况。[结果]所有细胞显示了良好的增殖能力，暴露于外源性血管内皮生长因子下的MSCs保持了良好的生长活性，并开始向软骨表型分化，与未添加诱导因子组细胞相比差异有显著性意义，不同浓度VEGF组的细胞合成软骨基质的能力无差异，但均不如阳性对照组。[结论]外源性VEGF具有诱导体外培养的人MSCs向软骨表型分化的能力，但与TGF-β1的诱导能力相比有差距。提示VEGF在MSCs来源的软骨修复过程中充当诱导信息提供者的角色。     

Ad-TGFβ1重组腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的研究

利用软骨组织工程修复人体关节面的软骨面缺损是自20世纪末以来人们探讨的研究方向，其中骨髓间充质干细胞作为种子细胞向软骨细胞分化的研究是具有优势的一个热点。我们利用重组腺病毒作为载体，将TGFβ1基因转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs），为其向软骨细胞表型的分化提供实验基础。     

不同浓度转化生长因子-β1对人骨髓间充质干细胞/海藻酸钠复合物体外软骨形成能力的影响

目的探讨人骨髓间充质干细胞（MSCS）体外定向分化为软骨样组织的可行性以及不同浓度TGF-β1对人MSCs／海藻酸钠复合物体外软骨形成能力的影响。方法将体外培养扩增的人骨髓间充质干细胞与海藻酸钠结合，制成MSCs／海藻酸钠复合物，诱导培养液中添加不同浓度TGF-β1，在培养的不同时间进行Ⅱ型胶原的免疫组织化学，原位杂交，蛋白多糖的特殊染色，以及蛋白多糖的定量检测。结果细胞在海藻酸钠中生长良好，可见细胞分裂增殖，形成同源细胞团。10μg／L诱导组Ⅱ型胶原表达阳性，基质中有红染的黏多糖物质的堆积，蛋白多糖定量检测均高于其他实验组（P〈0.05）。结论TGF-β1浓度过低不能诱导软骨形成，而浓度过高则不利于软骨形成，10μg／L是体外诱导软骨形成的适宜浓度。海藻酸钠是运载MSCs的理想载体和支架。     

人骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向分化的研究

目的探讨体外单层培养中诱导人骨髓间充质干细胞(Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells,hBMSCs)向软骨细胞定向分化的条件.方法采集志愿者骨髓3例,分离培养BMSCs,流式细胞仪分析表面标志.用含TGF-β1的无血清诱导培养基培养7d后,分别行Ⅱ型胶原免疫组化、原位杂交检测,碱性磷酸酶染色,3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入实验检测细胞的增殖情况.结果培养的BMSCs表达CD9,而CD34、CD38、CD45、CD61呈阴性.细胞经诱导培养7d后免疫组化、原位杂交可检测到Ⅱ型胶原的表达,碱性磷酸酶染色呈弱阳性,但细胞3H-TdR掺入量低于对照组(P<0.05).结论BMSCs在特定的诱导下能向软骨细胞方向分化,但在无血清培养基中无法有效的增殖.     

质粒修饰BMSC联合纳米支架促进软骨缺损修复的相关研究

目的探究慢病毒介导聚蛋白多糖(Aggrecan)过表达质粒转染骨髓间充质干细胞联合Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架向软骨细胞转化及软骨缺损修复的作用效果。方法构建慢病毒聚蛋白多糖过表达载体,培养骨髓间充质干细胞,构建兔模型软骨缺损模型,实验组造模后植入Gelatin/PLGA三维支架+转染聚蛋白多糖过表达载体骨髓间充质干细胞复合物;阴性对照组造模后植入Gelatin/PLGA三维支架+未转染骨髓间充质干细胞复合物;模型组造模后加入生理盐水处理。体外实验利用HE染色和免疫组织化学染色检测骨髓间充质干细胞联合Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架的联合培养体系向软骨细胞转化中聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达。构建兔膝关节软骨缺损模型,HE染色和免疫组织化学分析复合支架材料对软骨缺损的修复效果。结果 a)实验组(Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架+转染Aggrecan过表达载体骨髓间充质干细胞复合物)中支架表面黏附的细胞与对照组(Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架+未转染骨髓间充质干细胞)相比,细胞数明显增多;b)动物模型大体观察结果显示,实验组的修复效果要明显优于阴性对照组;c)动物模型HE染色结果显示,阴性对照组多为纤维性修复,而实验组多为细胞性修复;d)免疫组织化学染色结果显示,实验组修复软骨组织中Aggrecan和Ⅱ型胶原含量要明显优于阴性对照组。结论 Gelatin/PLGA三维支架加转染Aggrecan过表达载体骨髓间充质干细胞复合物可以促进BMSC向软骨细胞的分化,并且分泌更多的含Aggrecan和Ⅱ型胶原成分的细胞外基质,从而发挥其促进软骨缺损修复的作用。     

TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导兔脂肪基质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

[目的]分离培养兔脂肪基质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),观察在TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导下其生物学特性及向软骨细胞定向分化的能力.[方法]取4个月龄新西兰大白兔颈背部脂肪组织,分离、培养ADSCs.选取第3代,分为两组,实验组用软骨诱导液(含TGF-β1、bFGF、IGF)对细胞进行培养,对照组用普通高糖培养液培养,倒置显微镜观察两组细胞形态,MTT测定其增殖情况;14 d后行组织学观察(包括甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化),并实时荧光定量PCR检测两组细胞Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9基因的表达情况.[结果]实验组细胞逐渐变为软骨样细胞形态,增殖速度明显加快,14 d后实验组甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化阳性,对照组为阴性,荧光定量PCR结果显示实验组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9的基因转录水平明显高于对照组.[结论]在TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导条件下ADSCs增殖迅速,可高表达Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9,向软骨细胞定向分化.