金钗石斛生物碱抗老年痴呆基础研究

研究目的：探究金钗石斛生物碱（Dendrobium nobil Lindl Alkaloids,DNLA）抗老年痴呆作用及作用机制。方法：采用右侧脑室注射脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）或Aβ25-35 制备大鼠学习记忆功能减退模型、APP/PS1 转基因阿尔茨海默病模式小鼠动物模型,以及Aβ25-35 或氧糖剥夺诱导的大鼠原代神经元损伤细胞模型,通过行为学、组织形态学、免疫荧光、PCR、Western blot等技术手段,围绕学习记忆改变、炎症、tau 蛋白磷酸化、Aβ清除、自噬等评价DNLA 的抗老年痴呆作用及作用机制。结果：在LPS 诱导的大鼠学习记忆减退模型,预防性给予DNLA（20,40,80 mg·kg-1）,大鼠逃避潜伏期和搜索距离缩短,神经元坏死凋亡显著改善,其机制可能与降低海马caspase3/8 mRNA 表达、减少Aβ1 -42 产生、减轻海马Tau 蛋白磷酸化有关,值得注意的是DNLA
（80 mg·kg-1）的作用与甾体类抗炎药布洛芬相似,提示DNLA 的改善记忆作用与抗炎作用有关,后续研究发现DNLA 可抑制p-p38 MAPK 和NF-κB 通路降低炎症因子TNF-α及其受体TNFR1 的表达。在Aβ25-35 诱导的大鼠痴呆模型,给予DNLA 后可改善大鼠空间学习成绩,明显减少海马组织Aβ1-42 的含量,降低β- 淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）和BACE1 蛋白在海马组织的表达,另外,DNLA 可预防Aβ25-35 诱导的小鼠海马神经元及其突触缺失,该效应至少与增加其海马与皮质脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子及睫状神经营养因子等有关。在APP/PS1 转基因阿尔茨海默病模式小鼠,DNLA 可通过诱导神经元自噬改善模式小鼠空间学习记忆能力。离体细胞实验发现DNLA 抑制氧糖剥夺诱导的大鼠神经元细胞活力降低,减轻细胞凋亡,降低细胞膜通透性,改Aβ25-35 诱导的神经元轴突变性,作用机制与降低［Ca2+］i、增高MMP水平、下调caspase-3/12 基因表达、诱导自噬有关。结论：DNLA 可改善LPS 或Aβ25-35 诱导的大鼠学习记忆功能减退模型、APP/PS1 转基因阿尔茨海默病模式小鼠的学习记忆功能,作用机制与抗炎、抗凋亡、诱导自噬,减少Aβ沉积和tau 蛋白磷酸化等有关。     

异氟醚对缺锌APP/PS1转基因阿尔茨海默病模型小鼠海马神经元凋亡的影响

目的：研究吸入麻醉药异氟醚对缺锌APP/PS1转基因小鼠海马神经元凋亡的影响,探讨其相关作用机制。方法：8和9月龄APP/PS1转基因小鼠随机分为常锌组、常锌+异氟醚组、缺锌组和缺锌+异氟醚组,每组24只。常锌组小鼠给予正常锌含量饮食2个月;常锌+异氟醚组小鼠给予正常锌含量饮食2个月后接受1.4%异氟醚麻醉2 h;缺锌组小鼠给予低锌饮食1个月;缺锌+异氟醚组小鼠给予低锌饮食1个月后接受1.4%异氟醚麻醉2 h。分别在麻醉后6和24 h杀鼠取海马组织,采用免疫荧光双染法检测海马神经元凋亡率,Western blotting法检测海马β淀粉样蛋白（Aβ）、活化型半胱氨酸天门冬氨酸特异性蛋白酶3（Cleaved caspase-3）表达水平和Bax/Bcl-2比值。结果：与常锌组比较,常锌+异氟醚组小鼠麻醉后6 h海马神经元凋亡率、Cleaved caspase-3表达水平和Bax/Bcl-2比值升高（P<0.05或P<0.01）,麻醉后24 h海马神经元凋亡率总Aβ、Aβ40和Aβ42表达水平无明显改变（P>0.05）;缺锌组和缺锌+异氟醚组小鼠麻醉后6和24 h海马神经元凋亡率、Aβ42表达水平、Cleaved caspase-3表达水平和Bax/Bcl-2比值升高（P<0.05或P<0.01）。与缺锌组比较,缺锌+异氟醚组小鼠麻醉后6和24 h海马神经元凋亡率、Aβ42和Cleaved caspase-3表达水平及Bax/Bcl-2比值进一步升高（P<0.05或P<0.01）。结论：10月龄常锌APP/PS1转基因小鼠给予1.4%异氟醚麻醉2 h能够短暂加重其海马神经元凋亡;1.4%异氟醚麻醉2 h能够明显加重缺锌APP/PS1转基因小鼠海马神经元凋亡,其作用机制可能与促进海马Aβ42聚集、增强Bax表达、抑制Bcl-2表达和激活Caspase-3有关。     

沉默信息调节因子1 对抗APP 高表达转基因小鼠脑组织及β- 淀粉样肽寡聚体处理的原代培养神经元中氧化应激水平升高的作用

目的：由于氧化应激水平升高是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的可能性发病机制之一，而沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）的功能与抗氧化有关，本文试图了解SIRT1 是否能对抗β- 淀粉样肽前体蛋白（APP）高表达的小鼠大脑或经β- 淀粉样肽寡聚体（AβOs）处理的神经元中氧化应激水平的升高。方法：APP/PS1 双转基因种鼠与野生型（WT）雌鼠合笼繁殖，筛选出APP/PS1 双转基因小鼠，分别饲养至4 月龄或8 月龄时，用白藜芦醇（RSV，SIRT1 激活剂）或苏拉明（SIRT1 抑制剂）通过灌胃方法处理转基因小鼠，每次20 mg·kg-1 体重/ 天，时间2 个月；采用原代海马神经元培养，用0.5 μmol·L-1 AβOs 处理48 小时后分别用20 μmol·L-1RSV 或300 mg·mL-1 苏拉明处理细胞24 小时。采用CCK-8 方法检测细胞存活率，筛选最佳药物处理浓度；用蛋白印记及实时定量PCR 方法分别检测SIRT1 蛋白和mRNA 表达水平；用免疫组织化学方法检测APP 高表达转基因小鼠脑组织内老年斑分布情况；用激光共聚焦显微镜及流式细胞术检测原代海马神经元中活性氧（ROS）水平；用生物化学方法检测小鼠脑组织及细胞中OH-、H2O2、O2.- 水平，丙二醛（MDA）含量，以及超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。结果：与WT 小鼠或未经处理的原代神经元相比，APP/PS1 小鼠大脑或经AβOs 处理的神经元中SIRT1 的表达显着降低；小鼠脑组织中老年斑数量明显增加；脑组织及培养神经元中氧化应激水平明显升高，抗氧化酶水平明显降低。APP/PS1 小鼠大脑或经AβOs 处理的神经元中这些异常改变可通过RSV 处理后减弱，而用苏拉明处理后则使其增强。结论：SIRT1 可以降低APP 高表达小鼠大脑及经AβOs 处理的神经元中的氧化应激水平，具有神经保护作用。     

异氟醚对转APP基因小鼠脑内海马神经元蛋白质损伤和蛋白聚集的影响

目的：观察吸入麻醉药异氟醚对转APP基因小鼠脑内海马神经元蛋白质损伤和蛋白聚集的影响,并探讨海藻糖对异氟醚诱导的神经毒性的干预作用。方法：60只12月龄转APP基因小鼠随机分为对照组、异氟醚组（Iso组）和海藻糖组（Tre组）,每组20只。对照组小鼠不给予任何药物,将其置于持续通入2 L·min^-1氧气的麻醉箱中2h;Iso组和Tre组小鼠于麻醉前30 min分别经腹腔注射2 mL生理盐水或海藻糖（400 μg·kg^-1）稀释液,然后给予1.4%异氟醚吸入麻醉2 h。麻醉后6 h 取小鼠海马组织制备脑组织匀浆,应用 DCFH-DA荧光法检测小鼠海马组织中活性氧（ROS）水平;麻醉后24 h应用免疫组织化学法和Western blotting法检测小鼠海马组织中蛋白羰基化合物、硝基化酪氨酸和β-淀粉样蛋白（Aβ）_1-42蛋白表达水平,应用透射电镜检测海马神经元中蛋白聚集物的形成,应用TUNEL染色法观察小鼠海马组织中神经元凋亡率。结果：与对照组比较,Iso组小鼠海马组织中ROS水平、氧化蛋白羰基化合物、硝基化酪氨酸、Aβ_1-42蛋白表达水平和神经元凋亡率均明显增加（P < 0.05）;与Iso组比较,Tre组小鼠海马组织中ROS水平、氧化蛋白羰基化合物、硝基化酪氨酸、Aβ_1-42蛋白表达水平和神经元凋亡率均明显降低（P < 0.05）。结论：异氟醚能诱导转APP基因小鼠海马神经元蛋白质损伤和蛋白聚集,加剧氧化应激反应,增加脑内海马神经元凋亡,海藻糖能够拮抗异氟醚诱导的神经毒性。     

复方丹参片对老年痴呆症合并焦虑障碍的研究

目的：探讨复方丹参片对老年痴呆症合并焦虑障碍的作用及机制。方法：4 月龄野生型小鼠和APP/PS1 转基因小鼠分别灌胃给予溶剂或复方丹参片60 天后,采用Morris 水迷宫实验、新物体识别实验、新奇抑制摄食实验和高架十字迷宫实验评价复方丹参片对APP/PS1 转基因小鼠学习记忆功能和焦虑样行为的影响;应用ELISA 检测小鼠海马淀粉样蛋白Aβ40、Aβ42、γ- 氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）和脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）的含量;Real time PCR 和Western Blot 分别检测IDE/NEP 的mRNA 和蛋白水平变化。结果：复方丹参片720 mg·kg-1 明显短缩小鼠在水迷宫实验中找到平台的潜伏期,360 mg·kg-1 和720 mg·kg-1 明显增加小鼠原有平台象限的探索时间;复方丹参片720 mg·kg-1 可显著性增加APP/PS1 转基因小鼠对新物体的识别指数;复方丹参片360 mg·kg-1、720 mg·kg-1 显著性增加APP/PS1 转基因小鼠在高架十字迷宫中开臂的时间百分比和进入开臂的次数;复方丹参片360 mg·kg-1、720 mg·kg-1 显著性缩短APP/PS1 转基因小鼠摄食潜伏期;复方丹参片360 mg·kg-1、720 mg·kg-1 显著性降低APP/PS1 转基因小鼠海马Aβ40、Aβ42 的浓度和增加GABA 和BDNF 含量;复方丹参片720 mg·kg-1 显著性上调APP/PS1 转基因小鼠海马IDE、NEP mRNA 的表达;复方丹参片720 mg·kg-1 显著性增加小鼠海马IDE 蛋白表达。结论：复方丹参片改善APP/PS1 转基因小鼠的学习记忆损伤和焦虑样行为,可能与增加脑组织GABA 和BDNF 含量、IDE 的蛋白表达及降低Aβ40、Aβ42 水平有关。     

淫羊藿次苷II抗慢性脑低灌注诱导的大鼠学习记忆减退及机制研究

目的：观察淫羊藿次苷II（ICS II）对慢性脑低灌注诱导的大鼠学习记忆减退模型的作用,并探索其可能的作用机制。方法：成年雄性Sprague Dawley（SD）大鼠随机分为6组：假手术组、假手术给ICS II高剂量组、模型组、ICS II低剂量组、ICS II中剂量组、ICS II高剂量组,每组13只。模型组大鼠经双侧颈总动脉结扎诱导慢性脑低灌注,制备大鼠学习记忆减退模型,假手术组同法操作,但不结扎双侧颈总动脉。手术后第十天开始给药,ICS II低、中、高剂量组每日分别灌胃ICS II 4、8、16 mg/kg,假手术组和模型组灌胃等体积生理盐水,连续给药28天。制模后第33天Morris水迷宫检测大鼠学习记忆功能,连续5天。水迷宫检测结束后,取材,HE、Nissl染色观察海马神经元的形态及存活情况;ELISA检测海马PDE 4、PDE 5蛋白水平;Western blot检测海马Aβ1-40、 Aβ1-42蛋白水平,APP、BACE1、ADAM10、IDE、TGF-β1、PPAR-α、PPAR-β、PPAR-γ、BDNF、TrkB蛋白表达,Smad2、Akt、CREB 磷酸化水平。结果：模型组较假手术组大鼠的平均逃避潜伏期明显延长,目标象限停留时间百分比和目标象距离百分比明显降低;海马区神经元排列紊乱,细胞变性,尼氏体数量明显减少;海马PDE 4、PDE 5、Aβ1-40、Aβ1-42蛋白水平及APP、BACE1、TGF-β1蛋白表达明显增高,ADAM10、IDE、PPAR-α、PPAR-γ、BDNF、TrkB蛋白表达明显降低,PPAR-β无明显变化,Smad2磷酸化水平明显增加,Akt、CREB 磷酸化水平明显减少。然而,ICS II中、高剂量组较模型组大鼠的平均逃避潜伏期明显缩短,目标象限停留时间百分比和目标象距离百分比明显增高;海马神经元排列较整齐,细胞少有变性,尼氏体数量增加;海马PDE 4、PDE 5、Aβ1-40、Aβ1-42蛋白水平及APP、BACE1、TGF-β1蛋白表达明显降低,ADAM10、IDE、PPAR-α、PPAR-γ、BDNF、TrkB蛋白表达明显增高,PPAR-β无明显变化,Smad2磷酸化水平明显减少,Akt、CREB 磷酸化水平明显增加。假手术给ICS II高剂量组较假手术组大鼠上述指标没有明显差异。结论：ICS II明显减轻慢性脑低灌注大鼠模型的空间学习记忆减退及海马神经元的形态学损伤,其机制可能与下调APP、BACE1的蛋白表达和上调ADAM10、IDE的蛋白表达从而抑制Aβ产生和促进Aβ代谢,阻遏TGF-β1的过度表达和Smad2磷酸化,激活PPAR-α和PPAR-γ,上调BDNF、TrkB蛋白表达和抑制Akt、CREB 磷酸化有关。     

远志汤有效成分对APP/PS1 小鼠氧化损伤的保护作用机制研究

目的 通过观察远志汤有效成分即β- 细辛醚+ 远志皂苷（TEN）对APP/PS1 双转基因小鼠磷脂酰肌醇3- 激酶（PI3K）/ 蛋白激酶B（Akt）/ 糖原合成激酶3β（GSK-3β）信号通路的调控,探讨远志汤防治阿尔茨海默病（AD）的作用机制。方法 将3 月龄APP/PS1 双转基因小鼠分为模型组、盐酸多奈哌齐组（0.33 mg/kg·d）、β- 细辛醚+TEN 低、中和高剂量组[18.5、37.0 和74.0 mg/（kg·d）],选同月龄C57BL/6 小鼠为空白对照组,采用Morris 水迷宫法和新物体识别实验检测小鼠的学习记忆能力,采用分光光度法检测超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、过氧化氢酶（CAT）活性,以及丙二醛（MDA）含量。采用Western blot 检测GSK-3β、Akt,以及两者磷酸化蛋白表达。结果 β- 细辛醚协同TEN 可增强APP/PS1 双转基因小鼠的学习记忆功能,同时还能升高SOD、CAT 和GSH-PX 的活性,降低MDA 含量,诱导Akt 的蛋白表达,抑制GSK-3β 的表达。结论 远志汤有效成分即β- 细辛醚+TEN 可通过调控PI3K/Akt/GSK-3β 信号通路,对APP/PS1 双转基因小鼠氧化应激损伤发挥保护作用。     

文冠果壳苷对APP/PS1 转基因小鼠突触可塑性的作用及其机制研究

目的：阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）被认为是突触相关的一类疾病,因此又把它叫做突触失效,最终导致中枢神经系统网络联系受损,认知功能及记忆能力的下降。神经元的损伤和异常信号转导是神经退行性疾病的关键性指标。因此,改善突触结构和功能障碍是改善认知缺陷和阻止阿尔茨海默病发展的一个重要目标。文冠果壳苷是从文冠果果壳中提取的一种三萜皂苷类化合物,前期研究发现其对多种AD 模型动物的学习记忆障碍具有显著的改善作用,并可增加海马突触素及PSD95 蛋白表达,提示文冠果壳苷可能具有保护突触或提高突触可塑性的作用。方法：本实验通过对行为学、透射电镜、Golgi-Cox 染色、免疫组化、电生理和突触相关蛋白表达的考察,验证文冠果壳苷对APP/PS1 转基因小鼠学习记忆障碍的改善作用及对突触结构和功能可塑性的影响。结果：Morris 水迷宫结果表明,与APP/PS1 小鼠相比,文冠果壳苷可以显著缩短逃避潜伏期,提高穿台次数;Y 迷宫结果表明,文冠果壳苷可以显著提高APP/PS1 小鼠的自发交替反应率;提示文冠果壳苷可以改善APP/PS1 小鼠的空间记忆和工作记忆障碍。透射电镜结果表明,与APP/PS1 小鼠相比,给予文冠果壳苷后CA1 区突触间隙清晰可见,突触前区内有较多的突触小泡,突触前后膜清晰均匀;Golgi-Cox 染色结果表明,文冠果壳苷可以显著改善APP/PS1 小鼠海马树突棘密度降低;文冠果壳苷可以对抗Aβ25-35 导致的原代海马神经元树突长度降低及多级树突分枝减少;提高APP/PS1 小鼠突触结构可塑性相关蛋白（BDNF-TrkB 通路相关蛋白）的表达;提示文冠果壳苷对突触结构具有保护作用。电生理实验结果表明,文冠果壳苷可以显著改善APP/PS1小鼠LTP 降低;CamKⅡ和GluR1 蛋白的表达对于LTP 的维持至关重要,Western Blot 结果表明,文冠果壳苷可以显著提高APP/PS1 小鼠海马突触上和突触外p-CamKⅡ蛋白的表达,促进突触上GluR1 蛋白的磷酸化;提示文冠果壳苷对APP/PS1 小鼠突触功能可塑性具有保护作用。结论：文冠果壳苷对APP/PS1 小鼠的学习记忆障碍具有显著改善作用。其机制可能与调节突触结构相关蛋白BDNF-TrkB 及功能维持相关蛋白CamKⅡ-GluR1,进而提高海马突触结构和功能可塑性有关。     

新型小分子化合物OAB-14 改善AD 模型动物认知障碍作用及机制研究

目的：阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）发病机制复杂，相关假说众多。尽管存在争议，Aβ毒性假说仍是最为公认的主要致病机制之一。据报道，抗肿瘤药贝沙罗汀能够快速清除AD 模型小鼠脑内Aβ并改善学习记忆障碍，但其不良反应严重。我们参考贝沙罗汀合成了一系列化合物，并从中筛选出一个新型小分子化合物OAB-14。本研究旨在考察OAB-14 对AD 模型小鼠学习记忆障碍的改善作用及对神经元和突触可塑性的影响，并从Aβ生成、清除两个方面考察OAB-14 对Aβ的作用。方法：采用8 月龄APP/PS1 双转基因小鼠，灌胃给予OAB-14（50、100 和200 mg·kg-1）、贝沙罗汀（100 mg·kg-1）或溶剂，连续给药15 天。给药第6 天开始依次进行新物体辨别、Y 迷宫、Morris 水迷宫实验。采用Western Blot 方法考察OAB-14 对Aβ生成相关蛋白、Aβ降解酶、突触相关蛋白、M1/M2 型小胶质细胞标志物、神经炎症因子、ApoE 通路相关蛋白及ApoE亚型的影响；采用非变性凝胶电泳考察酯化ApoE 的水平；采用免疫组化和Thio-S 检测Aβ沉积；ELISA 法测定可溶和不溶性Aβ1-40、Aβ1-42 含量；采用免疫荧光对小胶质细胞和Aβ进行共定位；透射电镜检测海马CA1 区神经元细胞核、线粒体、突触超微结构。结果：模型组小鼠在新物体辨别、Y 迷宫、Morris 水迷宫实验中表现出显著的形象辨别记忆、工作记忆和空间学习记忆障碍；社会交往实验中主动接触时间缩短，社会交往能力下降；筑巢实验中生活自理能力也显著下降。与模型组相比，OAB-14 能剂量依赖性地改善APP/PS1 小鼠形象辨别记忆、工作记忆、空间学习记忆障碍，提高小鼠社会交往能力及生活自理能力。OAB-14 200 mg·kg-1 连续给药15 d，对Aβ生成相关蛋白APP、ADAM10、BACE-1、PS1 的表达没有显著影响，提示OAB-14 可能不影响Aβ的生成。OAB-14 显著增加Aβ降解酶NEP、IDE 的表达；增加ApoE、ABCA1、ABCG1 的表达，提高酯化ApoE 水平，增加小胶质细胞吞噬Aβ。提示OAB-14 可能通过活化ApoE 通路，并提高Aβ降解酶的表达，增加脑内可溶性Aβ的清除。OAB-14 还能显著提高小胶质细胞表面受体CD36 的表达，从而促进对纤维化Aβ的清除。OAB-14 促进小胶质细胞由促炎的M1 型向抗炎、吞噬的M2 型转换，在增加其对Aβ清除的同时，减少炎症因子的表达。透射电镜结果显示，OAB-14 能促进APP/PS1 小鼠海马神经元细胞损伤的修复，改善突触超微结构，增加NeuN 标记的神经元细胞数及NeuN 蛋白表达。OAB-14 可显著增加ApoE3 的表达，降低ApoE4 的表达，增加H3 的乙酰化水平，活化BDNF通路，提高突触相关蛋白SYP、GAP43、PSD95 的表达。结论：OAB-14 能显著改善APP/PS1 双转基因小鼠的学习记忆障碍，减少脑内Aβ沉积，其机制可能与增加Aβ降解酶表达，活化ApoE 通路，提高小胶质细胞对Aβ的清除有关。同时，OAB-14 能减少海马神经元丢失及提高突触可塑性，这可能与减少Aβ对神经元的毒性以及活化BDNF/TrkB/raf/ERK 信号通路有关。本课题的研究为将OAB-14 开发为抗AD 新药提供了药效学依据。     

APP/PS1双转基因AD小鼠学习记忆功能与超微结构的对照研究

目的观察APP/PS1双转基因阿尔茨海默病小鼠的记忆功能与超微病理改变。方法采用水迷宫实验检测记忆功能,透射电镜观察海马区超微病理改变。结果APP/PS1双转基因AD小鼠的水迷宫潜伏期比对照组小鼠明显延长,而在探索实验中两者差异无统计学意义;电镜观察到APP/PS1双转基因AD小鼠海马区神经元肿胀,突触稀松形态不一。结论APP/PS1双转基因AD小鼠能够较好的模拟AD患者的表现及病理过程,提供有效的实验动物模型。     

链脲佐菌素对APP/PS1转基因小鼠学习记忆及JNK信号通路的影响

目的 观察链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)对APP/PS1转基因小鼠学习记忆和海马组织MKK4、JNK、c-Jun磷酸化水平的影响.方法 3月龄APP/PS1转基因小鼠腹腔内注射STZ,采用Morris水迷宫实验观测学习记忆功能,应用尼氏染色观察海马神经元细胞形态,应用免疫印迹法检测海马组织内MKK4、JNK和c-Jun的表达水平.结果 水迷宫隐蔽平台实验中,从第2天到第5天,给予STZ后APP/PS1转基因小鼠逃避潜伏期和目标路径均明显长于对照组(P＜0.05或P＜0.01);Nissl染色显示STZ组小鼠海马神经元损伤明显;与对照组比,STZ组海马组织中磷酸化JNK和c-Jun的表达水平明显增高,分别增高到217.78 ±23.49和189.27±17.80(P＜0.01).结论 STZ可使APP/PS1转基因小鼠学习记忆功能减退,神经元损伤,其机制可能与JNK信号转导通路有着密切的关系.     

二苯乙烯苷通过影响APP 代谢途径减少斑块沉积进而影响学习记忆功能

目的：评价二苯乙烯苷（2,3,4’,5-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG）在长期给药过程中对APP/PS1 小鼠学习记忆功能的影响及其对阿尔茨海默病病理改变的影响,同时比较其与多奈哌齐药效学及药理作用的不同。方法：给APP/PS1 小鼠灌胃给药（TSG,50 mg·kg-1,100 mg·kg-1;donepezil,1 mg·kg-1）在给药后用Morris 水迷宫实验,新物体识别实验,自主活动,评价小鼠的学习记忆功能及小鼠的活动性。硫磺素染色和Aβ40/42 免疫荧光共定位观察全脑斑块沉积,免疫组化染色观察皮层和海马部位斑块沉积情况,ELISA 方法检测脑内可溶及不可溶Aβ42 的含量,用Western Blot 方法检测皮层及海马部位Aβ生成及代谢途径的关键酶的含量,以此来判断TSG 药物在改善老年痴呆的作用及其作用的关键点。结果：Morris 水迷宫实验结果显示APP/PS1 模型组与Wild Type 对照组相比逃避潜伏期明显延长,给药后逃避潜伏期明显缩短,TSG 与DON 相比,逃避潜伏期更短。新物体识别实验显示APP/PS1 模型组与Wild Type 对照组相比分辨指明显缩短,给药后分辨指数提高,TSG 与DON 相比,分辨指数明显提高。硫磺素染色与Aβ40/42 免疫荧光共定位,斑块能够完全重合,说明斑块的主要成分是Aβ40/42,实验结果统计分析APP/PS1 模型组与Wild Type 对照组相比脑内斑块显著,给药后全脑斑块减少,以小剂量最为显著,Don 也能减少斑块沉积,减少程度较TSG 稍差。免疫组化染色皮层斑块沉积,APP/PS1 模型组与Wild Type 对照组相比皮层斑块显著,给药后皮层斑块减少;免疫组化染色海马斑块沉积,APP/PS1 模型组与Wild Type 对照组相比海马斑块显著,给药后海马斑块减少。另外Western Blot 检测了Aβ代谢通路,前体蛋白和关键代谢酶,给药后APP,BACE-1,PS1 表达量减低。用ELISA 方法检测脑内可溶及不可溶性Aβ42 的含量,结果显示APP/PS1 模型组与Wild Type 对照组相比可溶性Aβ42 含量明显增高,给药后有一定程度减低;不可溶性Aβ42,APP/PS1 模型组与Wild Type 对照组相比明显增加。给药后不可溶性Aβ42明显减低,DON 对不可溶性Aβ42 的脑内含量减低,效果与TSG 相比不明显。结论：TSG 在长期给药后能够改善小鼠的空间学习记忆功能,对斑块所导致的记忆功能减退,有显著的提高作用,而与TSG 相比DON 的改善学习记忆能力更为显著。TSG 对小鼠的活动能力无不良影响。TSG 能够减少斑块沉积,其中不可溶性Aβ42 减低最为明显。进一步研究Western Blot 结果显示TSG 能够减少APP 的表达,在板块生成途径能够影响关键代谢酶BACE-1 和PS1。TSG 长期药效优于DON。     

文冠果壳苷对APP/PS1 转基因小鼠突触可塑性的作用及其机制研究

目的：阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）被认为是突触相关的一类疾病,因此又把它叫做突触失效,最终导致中枢神经系统网络联系受损,认知功能及记忆能力的下降。神经元的损伤和异常信号转导是神经退行性疾病的关键性指标。因此,改善突触结构和功能障碍是改善认知缺陷和防止AD 发展的一个重要目标。文冠果壳苷是从文冠果果壳中提取的一种三萜皂苷类单体化合物,前期研究结果证实其对多种AD 模型动物的学习记忆障碍具有显著的改善作用,并可增加海马突触素及PSD95 的蛋白表达,提示文冠果壳苷可能具有保护突触或提高突触可塑性的作用。方法：本实验通过行为学、透射电镜、Golgi-Cox 染色、免疫组化、电生理和突触相关蛋白表达的考察,验证文冠果壳苷对APP/PS1 转基因小鼠学习记忆障碍的改善作用及对突触结构和功能可塑性的影响。结果：Morris 水迷宫结果表明,与APP/PS1 小鼠相比,文冠果壳苷可以显著缩短逃避潜伏期,提高穿台次数;Y 迷宫结果表明,文冠果壳苷可以显著提高APP/PS1 小鼠的自发交替反应率;提示文冠果壳苷可以改善APP/PS1 小鼠的空间记忆和工作记忆障碍。透射电镜结果表明,与APP/PS1 小鼠相比,给予文冠果壳苷后CA1 区突触间隙清晰可见,突触前区内有较多的突触小泡,突触前后膜清晰均匀;Golgi-Cox 染色结果表明,文冠果壳苷可以显著改善APP/PS1 小鼠海马树突棘密度降低;文冠果壳苷可以对抗Aβ25-35 导致的原代海马神经元树突长度降低及多级树突分枝减少;提高APP/PS1 小鼠突触结构可塑性相关蛋白（BDNF-TrkB 通路相关蛋白）的表达;提示文冠果壳苷对突触结构具有保护作用。电生理实验结果表明,文冠果壳苷可以显著改善APP/PS1 小鼠LTP 降低;CamKⅡ和GluR1 蛋白的表达对于LTP 的维持至关重要,Western blot 结果表明,文冠果壳苷可以显著提高APP/PS1 小鼠海马突触上和突触外p-CamKⅡ蛋白的表达,促进突触上GluR1蛋白的磷酸化;提示文冠果壳苷对APP/PS1 小鼠突触功能可塑性具有保护作用。结论：文冠果壳苷对APP/PS1 小鼠的学习记忆障碍具有显著改善作用。其机制可能与调节突触结构相关蛋白BDNF-TrkB 及功能维持相关蛋白CamKⅡ-GluR1,进而提高海马突触结构和功能可塑性有关。     

老年小鼠心脏左室重塑和存活相关蛋白的表达变化

【目的】 探讨老年小鼠心脏左室重塑以及左室心肌蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt、B细胞淋巴瘤-2蛋白(Bcl-2)和存活素(Survivin)的蛋白表达变化。【方法】 8只成年(5 ~ 5.5 月龄)雄性 C57bl/6小鼠作为对照组,8只老年(21.5 ~ 24 月龄)雄性 C57bl/6小鼠作为老年组(n = 8),计算心脏质量指数和左室质量指数,并利用Western-blot方法检测小鼠左室心肌β-肌动蛋白(β-actin)、Akt、磷酸化Akt (Ser473)、Bcl-2和Survivin的蛋白表达。【结果】 与成年对照组小鼠相比,老年组小鼠心脏质量指数、左室质量指数、左室心肌β-actin表达显著增加(P = 0.003, P = 0.001,P < 0.001),左室心肌Akt、磷酸化Akt (Ser473)、Survivin表达显著下降(P < 0.001, P = 0.028, P = 0.002),而Bcl-2表达却显著增加(P < 0.001)。【结论】这些研究结果表明,小鼠老年化过程中心脏发生左室重塑,同时左室心肌Akt、磷酸化Akt (Ser473)和Survivin表达下降,而Bcl-2表达增加,这些改变可能与老年心脏耐受缺血损伤能力下降有关。     

脑红蛋白改善AD双转基因（APPswe/PS1dE9）小鼠认知功能及其机制研究

目的：观察过表达脑红蛋白（neuroglobin,Ngb）对阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）双转基因（APPswe/PS1dE9）小鼠认知功能的影响,并探讨其机制。方法：成功构建过表达Ngb质粒pNgb和对应的空质粒pCDNA3.1,对AD双转基因小鼠进行侧脑室注射,使其过表达Ngb。采用Morris水迷宫评价过表达Ngb对AD小鼠学习记忆能力和空间探索能力的影响;采用免疫组织化学法检测其对β淀粉样蛋白-42(amyloid β-protein 42,Aβ42)生成的影响;半胱氨酸蛋白酶Caspase-3和Caspase-9酶活性检测试剂盒检测酶活性变化;Western blot检测海马组织中磷酸化蛋白激酶B p-Akt(ser473)、总Akt、Caspase-3和Caspase-9表达。结果：过表达Ngb提高了AD转基因小鼠的学习记忆和空间探索能力（P<0.05）;明显降低了转基因小鼠海马组织中Caspase-3和Caspase-9酶活性及Aβ42生成（P<0.05）;Western blot显示过表达Ngb能抑制脑组织中Caspase-3和...     

雌二醇对Aβ1-42诱导小鼠海马神经元细胞的影响

目的研究Aβ1-42诱导小鼠海马神经元凋亡机制。方法应用Aβ1-42处理小鼠海马神经元后,采用MTT法检测小鼠海马神经元细胞存活率,形态学观察海马神经元的特征,Western blot法检测小鼠海马神经元caspase-3蛋白的表达。结果给予Aβ1-42处理的小鼠海马神经元的雌二醇保护作用后,小鼠海马神经元细胞数目减少,差异有统计学意义（P〈0.05）。小鼠海马神经元染色质浓缩、核碎裂,小鼠海马神经元细胞凋亡率上升,小鼠海马神经元caspase-3表达增强,提示雌二醇可明显改善小鼠海马神经元的各种变化。结论 Aβ1-42通过caspase-3途径引起小鼠海马神经元凋亡,雌二醇可抑制Aβ1-42诱导的小鼠海马神经元凋亡来保护小鼠海马神经元避免发生凋亡。     

不同月龄APP/PS1双转基因AD小鼠海马神经元线粒体的动态变化

目的:检测不同月龄APP/PS1双转基因阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型小鼠海马神经元中线粒体自噬的动态变化,并探讨其意义.方法:选取20只雄性APP/PS1双转基因AD小鼠为研究对象,分为3月龄组、6月龄组、9月龄组和12月龄组,以C57小鼠为对照组.获取海马组织,通过电镜观察海马区神经元中线粒体的形态变化,用Western blot检测自噬相关蛋白LC3和P62的表达水平;线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin和Miro1的表达水平;线粒体外膜蛋白Tom20的表达水平.结果:电镜观察结果显示:随着月龄增大,APP/PS1双转基因AD小鼠海马区神经元中线粒体损伤的病理变化呈逐渐加重的过程,即线粒体明显水肿、透明,嵴排列不规则,断裂,甚至消失.Western blot结果显示,与野生小鼠组比较,LC3、P62、PINK1和Parkin蛋白表达水平在6月龄组、9月龄组和12月龄组小鼠中明显增高(P＜0.05),而Miro1蛋白却明显降低(P＜0.05),Tom20的表达水平无明显差异(P＞0.05).结论:随着APP/PS1双转基因AD小鼠月龄的增加,其海马区神经元线粒体病理改变呈动态,线粒体自噬呈动态增强但伴随线粒体清除障碍.     

APP/PS1 转基因小鼠的甲状腺功能变化

 目的观察APP/PS1转基因小鼠甲状腺功能的动态变化并探讨AD与甲状腺功能的关系。方法6 月龄雌性APP/PS1
转基因鼠（ n=9）和野生型小鼠（ n=9）自由摄食和饮水,2 组小鼠分别于9,12,18 月龄时各取3 只处死,应用ELISA方法检测血
清TSH 和甲状腺激素（TT3、TT4、FT3、rT3）。结果（1）APP/PS1转基因小鼠与野生型小鼠相比血清TT3、FT3 水平均有降低,但
9 月龄时差异不显著（ P> 0.05）,12 月龄时差异显著（ P< 0.05）,18 月龄时差异更为显著（ P< 0.01）（2）APP/PS1转基因小鼠与
野生型小鼠相比血清TT4、rT3 均升高,但9月龄时差异不显著（ P> 0.05）,12 月龄时差异显著（ P< 0.05）,18 月龄时差异更加显
著（ P< 0.01）（3）各年龄段APP/PS1 转基因小鼠血清TSH 水平较野生型小鼠虽有所降低,但无统计学意义（ P> 0.05）。结论
APP/PS1 转基因小鼠在生长过程中伴随着甲状腺功能的改变,且逐渐加重。     

药物组合吲哚美辛与阿托伐他汀对阿尔茨海默病的治疗作用研究

目的：观察吲哚美辛与阿托伐他汀组合对阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的治疗作用。方法：在口服给予APP/PS1 转基因小鼠药物组合吲哚美辛与阿托伐他汀90 d 后进行Morris水迷宫和穿梭箱实验,并应用免疫荧光染色技术,观察小鼠脑中的Aβ沉积;应用AlphaLISA 技术检测小鼠中枢以及外周血中的Aβ含量;应用液相蛋白芯片技术和流式细胞术,检测小鼠外周血中细胞因子和脾细胞上清液中淋巴细胞亚型;应用放射免疫和化学发光技术,检测小鼠下丘脑- 垂体- 肾上腺轴（hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA）和下丘脑- 垂体- 性腺轴（hypothalamicpituitary-gonadal,HPG）中的相关激素水平。结果：药物组合吲哚美辛与阿托伐他汀能够显著改善APP/PS1 转基因小鼠的空间学习记忆能力和主动回避反应能力,降低海马中的Aβ沉积以及Aβ1–42 水平,显著抑制外周血中促炎因子IL-1β、IL-23、GM-CSF、TNF-α、NF-β和eotaxin 的分泌,并促进抑炎因子IL-4 和G-CSF 的分泌。同时,药物组合吲哚美辛与阿托伐他汀能够增加CD4+,CD28+ T 细胞的数量,降低CD4+,CD25+,Foxp3+ T 细胞的数量,显著降低HPA 轴中ACTH、HPG 轴中GnRH 和LH 的水平。结论：药物组合吲哚美辛与阿托伐他汀合用能够改善APP/PS1 转基因小鼠紊乱的免疫系统,调节神经内分泌系统的失衡,进而改善APP/PS1 转基因小鼠的学习记忆能力和病理损伤,提示吲哚美辛与阿托伐他汀的组合有可能成为防治AD 的潜在药物。     

APP5肽对糖尿病小鼠学习记忆功能与海马神经元蛋白表达的影响

目的 研究APP5肽对糖尿病模型小鼠学习记忆能力及海马神经元蛋白表达的影响.方法用链脲佐菌素诱发小鼠糖尿病模型,应用APP5肽(0.0014 mg/kg)皮下注射治疗,5周后进行Morris水迷宫试验;小鼠脑组织海马做Akt、PI3K、P-CREB、Bcl-2、Bax、CytoC免疫组织化学染色;另一部分鼠脑海马,做Bcl-2、Bax抗体蛋白免疫印记.结果(1)水迷宫试验:糖尿病模型小鼠到达站台游动时间比正常对照组延长(P<0.01);而APP5肽皮下注射治疗组较DM组动物分别缩短(P<0.01).(2) 神经免疫组织化学实验和Western blot:给予APP5肽糖尿病小鼠与对照组小鼠海马组织内神经元表达细胞存活相关蛋白及抗凋亡相关蛋白PI3K、Akt、P-CREB、Bcl-2阳性细胞数相似,明显高于糖尿病小鼠(P<0.01); APP5肽给予糖尿病小鼠与对照组小鼠表达凋亡蛋白Bax、cytoC阳性细胞数相似,明显少于糖尿病小鼠 (P<0.01).Western blot 结果相同.结论糖尿病小鼠海马神经元表达细胞存活相关蛋白下降,神经元表达细胞凋亡相关蛋白增加,导致其学习记忆能力下降.APP5肽应用可以使上述蛋白恢复到接近正常,从而改善糖尿病小鼠学习记忆能力.