基于STAT3信号通路研究IL-17在大鼠急性脊髓损伤模型中的作用研究

[目的]观察白细胞介素17通过激活STAT3信号通路在大鼠急性脊髓损伤模型中的表达。[方法]健康雄性SD大鼠75只,体重(250±25)g,分为对照组和脊髓损伤组,脊髓损伤组随机分到1、24、48和72 h四个亚组(n=15只)。改良Allen氏打击法建立脊髓损伤模型,对照组只切除椎板不损伤脊髓。术后处死前对大鼠脊髓功能进行BBB评分,HE染色观察损伤段脊髓组织形态结构,免疫组织化学检测IL-17、p-STAT3的表达变化,逆转录PCR检测IL-17 mRNA的动态变化。[结果]免疫组织化学检测显示对照组的大鼠脊髓组织中IL-17、pSTAT3表达量较少,损伤后1h明显上升,24 h到达峰值,而后缓慢下降,72 h仍高于对照组(P<0.05)。RTPCR检测显示脊髓损伤后IL-17mRNA表达趋势与免疫组化结果一致(P<0.05)。[结论]大鼠脊髓损伤后可异常激活IL-17过量表达,它可能对继发性脊髓损伤炎症反应有着重要作用。     

急性脊髓损伤后促红细胞生成素受体的表达及其意义

目的探讨急性脊髓损伤后促红细胞生成素(EPO)及其受体(EPO-R)在脊髓内的表达。方法Wistar大鼠69只,随机分为三组：正常对照组(5只,不手术,作为后两组的对照)、假手术组(仅行椎板切除术)和脊髓损伤组。根据术后时间点不同后两组又分为1h、6h、12h、24h、3d、7d、14d和28d八个亚组(每组4只)。采用RT-PCR、Western blot免疫印迹法和免疫组织化学染色法检测EPO及EPO-R的表达。结果正常对照组、假手术组和脊髓损伤组在各时相点均未发现有EPO表达。正常对照组、假手术组未发现EPO-R的表达,脊髓损伤组在伤后1h未见EPO-R mRNA和蛋白的表达,6h开始有表达,12h有明显的表达,至24h达到高峰,3d和7d时仍维持在高表达水平,未见减弱,14d开始下降,至28d时仍有EPO-R蛋白的表达。免疫组化显示EPO-R阳性细胞主要位于神经元、少突胶质细胞、血管内皮细胞和脊髓中央管内室管膜细胞。结论大鼠急性脊髓损伤后脊髓内大量表达EPO-R,这是外源性EPO与EPO-R结合产生神经保护作用的分子基础。     

导向因子Slit2在大鼠脊髓损伤后的表达及其意义

[目的]探讨轴突导向因子Slit2在大鼠脊髓损伤后的表达变化及其意义。[方法]Wistar雄性大鼠72只,实验分组A组(脊髓损伤组),36只;B组(假手术组),24只;C组(正常对照组),6只。A组大鼠麻醉后在无菌条件下打开椎板,以尖刀横断T10节段脊髓,以鼠尾痉挛性摆动、双下肢瘫为损伤标准;B组仅打开椎板显露硬脊膜,未损伤脊髓;C组未作手术,为正常对照。分别于脊髓损伤后12h、1、3、5、7d麻醉下快速取出T10节段的脊髓组织;分别于术后3、5、7、14d麻醉大鼠,先后以PBS缓冲液及4%多聚甲醛行心脏灌流固定,以T10节段为中心取出长约1cm的脊髓。分别通过逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)和免疫组织化学方法检测Slit2基因的表达水平及部位。[结果]RT-PCR大鼠脊髓损伤后12h即可检测到Slit2mRNA的表达,表达量逐渐升高并于脊髓损伤后第3d表达量达高峰,之后逐渐呈下降趋势。免疫组织化学检测Slit2蛋白定位于星型胶质细胞和少突胶质细胞的胞浆,呈棕黄色染色,于脊髓损伤后第3d出现,阳性细胞逐渐增多,于脊髓损伤后第7d,Slit2阳性表达的细胞数达到高峰并趋于稳定,伤后第14d开始逐渐下降,呈一过性增高。[结论]作为引导轴突生长方向的重要因子,Slit2在脊髓损伤的早期的一过性表达升高提示其可能参与轴突的再生与重建。     

TNF-α拮抗剂(Etanercept)治疗脊髓损伤作用机制的实验研究

目的探讨TNF-α拮抗剂Etanercept(依那西普)对继发性脊髓损伤的治疗作用和可能机制。方法建立大鼠脊髓挫伤模型,损伤后1 h对大鼠行腹腔注射5 mg/kg Etanercept或生理盐水(损伤对照组);假手术组(20只大鼠)仅行椎板切除术而无脊髓损伤,1 h后给予腹腔注射1 ml生理盐水。结果在脊髓损伤急性期(12 h、1 d、3 d),Etanercept治疗组TNF-α的蛋白表达强度明显弱于损伤对照组。与对照组相比,Etanercept治疗组TNFR1的表达在损伤后6、12 h均下降,TNFR2仅在损伤后6 h下降。损伤对照组大鼠在脊髓损伤后后肢运动功能明显受限,而Etanercept治疗组大鼠在脊髓损伤后2、4、8周,后肢BBB评分显著升高。结论 Etanercept可能通过抑制TNF-α/TNFR通路,减轻了脱髓鞘变性,促进了运动功能的恢复。     

低氧诱导因子1α在继发性脊髓损伤中的时序性表达及意义

目的通过观察大鼠继发性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)中低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor lα,HIF-lα)的表达规律,探讨其在继发性SCI发生、发展过程中的作用。方法 SD大鼠66只,雌雄不限,体重(250±20)g,随机分为正常对照组(A组,6只)、假损伤组(B组,6只)和SCI组(C组,54只)。A组不作任何处理;B组大鼠仅行椎板切除术;C组大鼠在椎板切除术后采用脊髓静压法建立T10静压SCI模型。A、B组于术后1h,C组于术后1、3、6、12h及1、2、3、7、14d各处死6只大鼠,取损伤区脊髓组织行HE染色,采用SABC法行免疫组织化学染色观察各组HIF-1α阳性表达情况并计数。结果各组动物均存活至实验完成。HE染色示,A、B组脊髓组织结构致密,细胞核圆而大、染色浅、核仁清晰。C组术后1～12h,损伤局部神经元核固缩,胞体缩小,胞质深伊红染色;1～3d,轴突肿胀,出现空泡,白质内神经髓鞘散乱、崩解破裂;7、14d,胶质细胞增生明显,损伤段脊髓变细,部分灰质崩解坏死,可见囊腔形成。免疫组织化学染色示,A组HIF-1α阳性细胞少,B组稍增多。C组术后1、3h,HIF-1α阳性产物开始增多,主要在脊髓前角神经元和少量胶质细胞中表达;术后1d达峰值,1～3d维持较高水平,此后逐渐减少;14d时仅可见少量白质中的胶质细胞。A、B组间HIF-1α阳性细胞数比较差异无统计学意义(t=1.325,P=0.137)。C组各时间点HIF-1α阳性细胞数均高于A、B组(P<0.05),C组各时间点间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 SCI后HIF-1α表达开始升高,与继发性SCI缺血缺氧密切相关,其表达规律与损伤时间具有相关性。     

神经营养素3对大鼠急性脊髓损伤后Fas表达的影响

[目的]探讨神经营养素3（NT-3）对脊髓损伤保护作用的分子机制。[方法]105只SD大鼠随机分成3组：对照组（生理盐水组），实验组（NT-3组），假手术组。用改良Allen＇s WD法以30gcm致伤SD大鼠制作大鼠全瘫模型，经蛛网膜下腔导管于术后即刻、4、8、12、24h、3、7d注入NT-320μl（含NT-3200ng），对照组在相同时间点给予等容积生理盐水，假手术组只打开椎板后蛛网膜下腔置管，不致伤，不给药。采用免疫组织化学方法检测Fas蛋白在脊髓神经元的表达变化情况。[结果]假手术组中Fas蛋白弱阳性表达，对照组中Fas蛋白4h即出现强阳性表达，24h达高峰，实验组与对照组相比Fas蛋白表达明显减少（P〈0．01）。[结论]NT-3能通过抑制Fas蛋白的表达抑制脊髓损伤后神经元凋亡，从而保护损伤的脊髓组织，这可能是NT-3对脊髓损伤具有保护作用的机制之一。     

热休克蛋白70在大鼠急性打击损伤脊髓中的表达

目的观察急性打击损伤大鼠脊髓组织中热休克蛋白70（heat shock protein70，HSP 70）的表达。方法65只大鼠随机分为3组：正常对照组5只、手术对照组和脊髓损伤组各30只，采用改良Allen法建立脊髓损伤动物模型。手术对照组和脊髓损伤组分别于处置后的2h、6h、12h、24h、48h、72h这6个时间点各采集5只大鼠的脊髓。应用免疫组织化学染色方法观察不同时点各组脊髓中热休克蛋白的表达变化。结果在大鼠正常胸段脊髓中没有基础性HSP70的表达。打击造成急性脊髓损伤后2h，脊髓组织内出现HSP70的表达，损伤后24～48h脊髓组织中HSP70染色达到高峰，并维持至损伤后72h。结论在遭遇损伤性刺激后，脊髓组织在随后的2～72h内HSP70的表达明显增加；HSP70可能在阻止脊髓的继发性损伤方面发挥一定的作用。     

氨基胍对大鼠急性脊髓损伤后脊髓水肿的作用机制研究

目的氨基胍(aminoguanidine,AG)能显著减轻脑外伤及中风动物模型脑水肿,提高神经功能恢复程度。探讨AG对大鼠急性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后脊髓水肿的作用及相关机制。方法取成年雄性SD大鼠150只(体重230～255 g),分为对照组(A组,25只)、假损伤组(B组,25只)、SCI后未治疗组(C组,25只)和SCI后AG治疗组(75只);AG治疗组按给药剂量分为AG 75 mg/kg组(D组,25只)、AG 150 mg/kg组(E组,25只)和AG300 mg/kg组(F组,25只)。A组未行任何处理,B组仅行椎板切除术但不治疗;C、D、E、F组制备静压型大鼠SCI模型后,C组腹腔注射5%DMSO,D、E、F组腹腔注射相应剂量AG。于造模后0、12、24、48 h用干湿重法检测受损脊髓组织含水量以筛选最佳剂量,进一步用伊文思兰(Evans blue,EB)法评测血-脊髓屏障功能,用RT-PCR检测水通道蛋白4(aquaporins 4,AQP4)mRNA表达,Western blot和免疫组织化学染色检测AQP4蛋白表达。结果脊髓组织含水量检测示,E组在造膜后12、24、48 h对SCI后脊髓组织水肿有明显抑制作用(P<0.05),选择该剂量组用于后续实验。造模后12、24、48 h,E组EB含量明显低于C组(P<0.05),降低血-脊髓屏障通透性。RT-PCR检测结果示造模后12、24、48 h,B、E组AQP4 mRNA表达明显低于C组;Western blot检测示造模后24、48 h,B、E组AQP4蛋白表达明显低于C组;免疫组织化学染色示造模后48 h,B、E组AQP4蛋白表达明显低于C组,差异均有统计学意义(P<0.05);但各指标各时间点B、E组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论急性SCI后大鼠经150 mg/kg AG治疗后,能降低AQP4表达,改善脊髓水肿,减轻损伤。     

NF-κB信号传导通路在大鼠急性结肠炎应激反应中的作用

目的探讨NF-κB通路在大鼠急性结肠炎应激反应中的作用.方法建立大鼠急性结肠炎应激模型,固定化蛋白印迹法（Western blot）检测脊髓内I-κB蛋白水平,逆转录-聚合酶链式反应法（RT-PCR）检测脊髓内COX-2 mRNA水平,免疫组化法检测L5-S1和C2-4脊髓内COX-2蛋白水平.结果结肠内灌注6%醋酸可产生明显局部炎症反应;急性结肠炎0.5 h后L5-S1脊髓内I-κB蛋白表达明显上调（P＜0.05）;急性结肠炎3 h后L5-S1脊髓内COX-2 mRNA表达开始增加,24 h后达到高峰;免疫组化结果显示结肠炎24 h后胞浆内COX-2蛋白表达增加.结论大鼠急性结肠炎时,NF-κB通路可能通过调控COX-2的表达而介导炎症反应,I-κB有可能成为急性结肠炎治疗的靶点.     

GM-1预防大鼠急性脊髓损伤的研究

目的：探讨单唾液酸神经节苷脂（GM-1）对大鼠急性脊髓损伤的预防作用。方法：随机将126只大鼠分为3组，每组42只。A组（正常组）：行椎板切除术但不损伤脊髓；B组（对照组）：行椎板切除术，同时予脊髓损伤打击；C组（GM-1组）：术前应用GM-1，行椎板切除术，同时予脊髓损伤打击。脊髓损伤采用改良Allen’s打击法。术后24h、48h和72h采用胥少汀6级行为学评分及Rivlin斜板试验进行神经功能评价；1h和72h对大鼠脊髓损伤后运动诱发电位（MEP）潜伏期和波幅进行分析；8h、24h、48h和72h对损伤部位脊髓通过光镜和电镜进行病理学观察。结果：GM-1组与对照组相比，行为学评分障碍率及斜板障碍率较对照组低。神经功能评分提高；术后MEP潜伏期较对照组短，波幅下降较对照组小，MEP得到改善；光镜、电镜下见脊髓损伤轻。结论：预防性应用GM-1可能对减轻脊髓损伤有一定的作用。     

大鼠脊髓损伤过程中细胞周期蛋白H的表达变化

目的 观察细胞周期蛋白H(Cyclin H)在急性脊髓损伤后的表达变化及定位情况,探讨其在脊髓损伤与修复过程中的生物学功能.方法 取56只成年SD大鼠,随机分8组:正常对照组、T9撞击伤6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d 7组,每组7只.采用Western blot测定损伤后各时间段Cyclin H蛋白水平在脊髓中的表达变化,采用免疫组织化学方法检测Cyclin H在正常及损伤后脊髓中的分布和定位,在此基础上探讨Cyclin H在脊髓损伤后的病理生理意义.结果 Western blot结果表明创伤性脊髓损伤后脊髓中Cyclin H表达呈现逐渐升高再下降的趋势,3 d达到高峰.免疫组织化学表明Cyclin H在正常脊髓中表达,损伤后3 d,Cyclin H在脊髓白质中的表达明显增强,在灰质中的表达也有一定程度的增强.免疫荧光双标记表明Cyclin H与神经元标记物NeuN、小胶质细胞标记物CD11b有明显共定位,与星形胶质细胞标记物GFAP有少量共定位.结论 脊髓损伤后Cyclin H蛋白水平有明显时相改变,且与神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞有共定位,提示Cyclin H在脊髓损伤后可能发挥了作用.     

重组sCR1对大鼠急性脊髓损伤组织免疫炎症反应的影响

目的探讨重组可溶性补体受体Ⅰ型(sCR1)对大鼠急性脊髓损伤组织免疫炎症反应的影响及对脊髓损伤的保护作用。方法采用改良Allen重物打击法制成SD大鼠脊髓急性损伤模型,观察伤后12h、1d、3d、7d、14d时间点sCR1组与生理盐水(NS)组脊髓损伤组织中性粒细胞浸润程度及C3c的阳性表达,测定髓过氧化物酶(MPO)活性,并采用BBB评分法评定大鼠后肢运动功能。结果sCR1组在伤后各时间点C3c阳性表达均明显少于NS组,差异有极显著性意义(P<0.01);sCR1组在伤后各时间点损伤组织髓过氧化物酶(MPO)活性弱于NS组,差异有极显著性意义(P<0.01);sCR1组在伤后7、14d时间点大鼠后肢BBB评分明显优于NS组(P<0.05、P<0.01)。结论重组sCR1可通过抑制补体系统激活机制显著减轻急性脊髓损伤组织的免疫炎症反应,减轻继发性脊髓损伤。     

环孢霉素A对大鼠脊髓损伤早期环氧化酶-2与肿瘤坏死因子α表达的影响

目的:观察环孢霉素A(CsA)对大鼠脊髓损伤(SCI)早期环氧化酶-2(Cox-2)与肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达的影响,探讨CsA对大鼠SCI的作用。方法:180只大鼠随机分成对照组、损伤组和损伤后CsA治疗组(治疗组),每组60只。用25g.cm致伤损伤组和治疗组大鼠T8~T11脊髓,对照组不损伤脊髓。治疗组于术后1h予尾静脉注射CsA(2.5mg/kg),之后每隔12h给药1次,对照组和损伤组在相同时间点尾静脉注射相同体积生理盐水。损伤组和治疗组于术后2h、6h、12h、24h、48h和72h处死动物取损伤段脊髓标本,对照组在相应时间点取相应节段脊髓标本,切片后分别行HE染色观察脊髓组织损伤情况、免疫组织化学EnVision法检测TNF-α、免疫组织化学SP法检测Cox-2,并对TNF-α和Cox-2进行定量分析。结果:对照组各时间点脊髓无出血、水肿等变化。损伤组和治疗组伤后2h、6h脊髓灰质可见水肿、出血,但无坏死,周围白质无明显改变;12h、24h脊髓灰质出现广泛灶性出血及出血后形成囊腔,神经元肿胀,部分细胞核浓缩,染色增强,白质见少量红细胞渗出,髓鞘轻度肿胀;48h、72h脊髓灰质中出现神经元固缩、坏死、溶解,细胞体积变小,有大量小胶质细胞增生和中性粒细胞浸润,白质中可见较多红细胞渗出,髓鞘肿胀和大量空泡,周围有炎性细胞浸润和胶质细胞增生;治疗组各时间点的病理改变均较损伤组轻。对照组大鼠脊髓Cox-2呈可疑阳性表达;损伤组和治疗组伤后2h Cox-2即有表达,6h达到高峰,之后逐渐下降;损伤组在伤后72h Cox-2表达仍较对照组高(P<0.05),而治疗组到伤后48h即恢复到对照组水平(P>0.05),治疗组各时间点Cox-2表达均较损伤组低(P<0.05);对照组大鼠脊髓TNF-α呈可疑阳性或弱阳性表达;损伤组和治疗组伤后2h即有TNF-α表达,12h达到高峰,之后逐渐下降;损伤组在伤后72h TNF-α表达仍较对照组高(P<0.05),而治疗组在伤后72h即恢复到对照组水平(P>0.05),治疗组各时间点TNF-α表达均较损伤组低(P<0.05)。结论:CsA能显著降低大鼠SCI后早期损伤脊髓组织中Cox-2和TNF-α的表达,从而减轻脊髓继发性损伤。     

大鼠创伤性脊髓损伤后Caspase-3的表达及其意义

目的研究半胱天冬氨酸蛋白水解酶-3 (Cysteinyl aspartate specific protease-3,Caspase-3)在大鼠创伤性脊髓损伤(traumatic spinal cord injury,t-SCI)后的表达及意义。方法取雄性SD大鼠48只,随机分为损伤组和假手术组,每组分别24只。每组再分为6、12、24、48小时共4个时间点,每个时间点6只大鼠。损伤组使用血管夹钳夹压迫法建立大鼠T10急性脊髓损伤动物模型,而假手术组则仅做单纯T9-T11椎板切除术。应用免疫印迹法(Western blot,WB)检测各时间点Caspase-3的表达变化。结果大鼠t-SCI后,损伤脊髓组织中Caspase-3表达水平在损伤后6小时开始升高,至24小时达到最高峰,48小时有所下降。损伤组大鼠在各时间点caspase-3的表达水平均高于假手术组(P0.01)。结论大鼠脊髓损伤后Caspase-3的表达水平显著升高,可能是导致脊髓继发性损伤的因素之一。     

大鼠钳夹式急性脊髓损伤模型的制备与评价

[目的]建立并评估大鼠钳夹式脊髓损伤模型,为研究急性脊髓损伤的机制及后续治疗提供基础。[方法]40只成年S-D大鼠,随机分为脊髓损伤组和假手术组,脊髓损伤组行T10水平的椎板切除术,并用一动脉瘤夹瞬间释放,造成脊髓的急性挫伤,假手术组大鼠则仅行T10水平的椎板切除,术后进行行为学评价,血清学检测及病理学检查。[结果]脊髓损伤组大鼠术后运动功能评分(BBB评分)低于假手术组大鼠,术后4 h血清TNF-α和IL-6的含量高于假手术组,且两组差异具有统计学意义,病理学检查脊髓损伤组有脊髓实质结构破坏、空洞及瘢痕形成,假手术组未见明显异常。[结论]本研究建立的大鼠急性脊髓损伤模型,能够反映脊髓损伤的病理生理过程,并具有较好的重复性及稳定性,可用于脊髓损伤的研究。     

柴胡皂苷a对大鼠急性脊髓损伤的神经保护作用与机制研究

目的探讨柴胡皂苷a(saikosaponin a,SSa)对大鼠急性脊髓损伤早期机体免疫炎性水平的影响,并研究其可能存在的影响机制。方法取健康成年雌性SD大鼠72只,体质量220~250 g,随机分为假手术组(A组)、脊髓损伤组(B组)、SSa处理组(C组),每组24只。A组仅咬除棘突和椎板暴露脊髓;B、C组利用改良Allen重物打击法制作急性脊髓损伤模型,造模后即刻C组给予大鼠腹腔注射10 mg/kg SSa,B组注入等量生理盐水。术后24 h每组处死18只大鼠并取出脊髓组织,采用ELISA法检测TNF-α和IL-6浓度,Western blot检测NF-κB P65、NF-κB P-P65和水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)蛋白表达水平,HE染色观察脊髓组织形态;每组其余6只大鼠分别于术后1、3、7、14、21、28 d采用BBB评分和斜板实验评价大鼠双下肢运动恢复情况。结果术后各时间点A组BBB评分和斜板实验最大角度均显著高于B、C组(P0.05),术后14、21、28 d C组上述指标显著高于B组(P0.05)。ELISA检测示,A组TNF-α、IL-6浓度显著低于B、C组,C组显著低于B组,差异均有统计学意义(P0.05)。Western blot检测示,A组NF-κB P65、NF-κB P-P65和AQP4蛋白表达水平显著低于B、C组,C组显著低于B组,差异均有统计学意义(P0.05)。HE染色示,A组脊髓中神经细胞正常,无明显病变;B组脊髓中损伤部位可见神经元细胞,损伤处有出血、中性粒细胞浸润、神经细胞水肿;C组脊髓中可见神经元细胞,小胶质细胞轻度增生,病变较B组好转。结论 SSa通过抑制NF-κB信号通路和AQP4蛋白的表达,减轻急性脊髓损伤后机体炎性反应和组织水肿,从而具有一定保护神经的功能。     

基质金属蛋白酶-9与脊髓损伤后脊髓水肿的关系

目的：探讨基质金属蛋白酶-9与急性脊髓损伤后脊髓水肿的关系。方法：健康雄性SD大鼠70只，随机分为对照组和损伤组。对照组大鼠10只，仅做椎板切除术，术后6h取材；损伤组采用改良Allen法制作T8～T9节段脊髓损伤模型，分别于伤后6h、12h、1d、3d、5d、7d（每时间点10只）处死取材。采用干湿重法测定脊髓含水量，免疫组化检测基质金属蛋白酶-9的表达。结果：急性脊髓损伤后6h，损伤组脊髓含水量较对照组增多，3～5d时达到高峰。基质金属蛋白酶-9在对照组未见表达，而损伤组在损伤后6h表达增加，并在1～3d达到高峰，损伤后7d仍有表达。相关性分析显示基质金属蛋白酶-9的表达与脊髓含水量呈正相关。结论：急性脊髓损伤后，基质金属蛋白酶-9的表达与脊髓水肿的形成有关，但两者达到高峰的时间不完全一致。     

胞浆泛素蛋白连接酶2在大鼠脊髓损伤后星形胶质细胞中的表达及意义

目的研究胞浆泛素蛋白连接酶2(Kip1 ubiquitylation-promoting complex 2,KPC2)在大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)过程中的蛋白表达及细胞定位情况,探讨其在SCI修复过程中的生物学功能。方法将成年SD大鼠随机分为2组,对照组7只仅行单纯T9椎板全切除术,实验组49只采用改良Allen法制作T9节段脊髓撞击损伤模型,实验组于伤后6、12 h及1、3、5、7、14 d分别取7只大鼠进行以下检测。采用Western blot检测p27kip1、KPC2、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和细胞周期蛋白A(Cyclin A)在SCI前后的蛋白表达变化,免疫组织化学染色观察KPC2在SCI后的大体定位及表达,免疫荧光双标记染色观察KPC2在SCI过程中与神经元特异性核蛋白(neuronal nuclei,Neu N)、神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和PCNA的共定位情况。细胞水平采用体外培养星形胶质细胞增殖模型,Western blot检测KPC2、P27kip1、PCNA表达;免疫共沉淀分析KPC2、KPC1和p27kip1之间在细胞增殖过程中的相互作用。结果 Western blot结果示SCI后3 d,p27kip1显著下调,伴随KPC2、Cyclin A、PCNA表达明显增加。免疫组织化学染色示KPC2阳性信号广泛分布,包括脊髓灰质和白质,实验组KPC2阳性细胞数显著高于对照组(t=10.982,P=0.000)。免疫荧光双标记染色示在脊髓灰质,对照组和实验组KPC2与Neu N双标记阳性细胞数分别为(0.43±0.53)、(0.57±0.53)个/视野,比较差异无统计学意义(t=0.548,P=0.604);在脊髓白质,对照组和实验组KPC2与GFAP双标记阳性细胞数分别为(3.86±0.90)、(0.71±0.49)个/视野,差异有统计学意义(t=7.778,P=0.000);对照组和实验组KPC2与PCNA标记的星形胶质细胞共定位明显,阳性细胞数分别为(0.57±0.53)、(5.57±1.13)个/视野,差异有统计学意义(t=8.101,P=0.000)。体外培养并模拟星形胶质细胞增殖,提取细胞蛋白行Western blot示PCNA和KPC2蛋白表达在血清刺激增殖后即开始增加,24 h达峰值,而p27kip1表达则逐渐减少。免疫共沉淀示KPC2可沉淀p27kip1、KPC1,p27kip1也可沉淀KPC2、KPC1,且在刺激后相互作用明显增加。结论 SCI后KPC2参与介导的p27kip1表达下调,KPC2与SCI后星形胶质细胞的增殖相关。     

p27kip1和Skp2在大鼠坐骨神经切断后脊髓中的表达

目的 观察坐骨神经切断后大鼠脊髓中p27^kip1和Skp2的表达变化。方法 将成年SD大鼠随机分为正常对照组和实验组。对实验组实行坐骨神经切断术。用Western blot和免疫组织化学技术检测脊髓中p27^kip1和Skp2的表达变化。结果 Western blot结果表明坐骨神经切断后脊髓中p27^kip1表达持续下降，Skp2表达上调。免疫组织化学结合免疫荧光双标技术显示，在正常组和实验组，p27^kip1和Skp2在脊髓神经元和胶质细胞均有表达。在腹角神经元，损伤后p27^kip1 免疫染色减弱，Skp2增强。坐骨神经损伤前后脊髓腹角p27^kip1和Skp2阳性细胞数目改变呈负相关（r=-0．6892，P〈0．01）。结论 坐骨神经损伤可影响脊髓中p27^kip1和Skp2的表达水平及亚细胞定位，两者改变呈负相关。     

脊髓损伤后神经轴突导向分子Semaphorin 3A表达的研究

目的:研究后脊髓损伤大鼠Semaphorin 3A表达的变化,探索脊髓损伤后轴突再生受到抑制的可能机制。方法:40只雌性健康SD大鼠,8周龄,体质量(210.00±9.88)g,随机分为对照组(A组,20只)和模型组(B组,20只)。A组仅切开T10全椎板及T9、T11部分椎板,对脊髓未作其他处理;B组切开T10全椎板及T9、T11部分椎板采用脊髓横切法制作脊髓损伤的动物模型。两组分别在术后3、7、14、28、42 d(每组每个时间点4只)进行灌注、获取脊髓组织,然后进行HE染色,同时按照SP试剂盒的操作步骤进行Semaphorin 3A的表达。结果:单纯脊髓横切损伤后,损伤局部发生出血坏死,局部水肿,神经变性、坏死以及囊腔形成,胶质细胞增生胶质瘢痕形成。对照组Semaphorin 3A只在灰质区有低水平表达。模型组术后3 d脊髓损伤损伤区Semaphorin 3A无表达,14 d时脊髓损伤损伤区Semaphorin 3A的表达显著增加,处在较高的水平,28 d时Semaphorin 3A的表达呈中等水平,42 d时Semaphorin 3A阳性表达恢复到正常水平。结论:脊髓损伤后Semaphorin 3A表达升高,可能是抑制轴突再生的机制之一。