人食管癌相关基因cDNA片段的克隆、筛选与初步鉴定

目的 :筛选和鉴定人原发性食管癌组织的相关基因 ,揭示食管癌的癌变机理。方法 :用高效、灵敏的荧光mRNA差异显示技术 ,以食管癌及相应的正常食管粘膜组织为对照 ,通过对其基因表达的比较 ,找出差异条带 ,利用ReverseNorthernDotBlot、DNA序列分析和NorthernBlot,并结合mRNA原位杂交技术对被筛片段进行鉴定。结果 :①在实验中分离、鉴定了 74条差异片段 ,其中包括正常组织表达而癌组织中不表达的差异片段 5 4个 ,癌组织中表达而正常组织不表达的差异片段 2 0个。②其中 1个片段C5 7(337bp)在GenBank数据库中没有发现同源的已知基因或片段 ,推测其可能为食管癌相关基因。③经NorthernBlot检测C5 7在癌组织中有表达信号。④原位杂交技术检测C5 7在癌组织中具有较高的阳性表达率 (74% )。结论 :食管癌组织中C5 7可能是新的食管癌相关的候选癌基因 ,它与食管癌的发生发展可能有关     

应用RT-PCR和SSCP分析食管癌组织中p73基因的表达

目的：观察p73基因在食管癌中的表达与突变状况，探讨p73基因在食管癌发生、发展中的意义。方法：采用RT－PCR和SSCP检测37例食管鳞状细胞癌肿瘤组织、癌旁组织、区域淋巴结和相应正常食管组织中p73mRNA的表达和基因的突变情况。结果：37例食管肿瘤组织中有21例（51．8％）p73 mRNA检测到过度表达，其阳性表达率显著高于相应的癌旁组织、区域淋巴结和正常组织（P＜0．05），与食管癌临床病理分期、细胞分化程度和病理类型均无显著性差异（P＞0．05）；未发现食管癌组织中p73基因有任何突变。结论：p73 mRNA在食管癌组织中有较高的表达率和表达水平，本研究未发现p73在食管癌中有突变。p73基因在食管癌中的过表达和正常基因型没有能够阻止癌症的发生及恶化，可能没有主要的抑癌作用。     

荧光标记mRNA差异显示技术在分离食管癌相关基因片段中的应用

目的：以荧光标记的mRNA差异显示技术分离食管癌及其正常食管粘膜组织相关的差异基因片段。方法：结合Genbomyx LR^TM DNA测序／差异显示系统及Genomyx SC^TM荧光图像扫描系统,以及配套的FluoroDD和HIEROGLYPH mRNA Profile Kit,采用荧光标记的mRNA差异显示技术进行检测。结果：从人食管癌及正常食管粘膜组织间,同时直接分离出了相关的癌基因或抑癌基因片段74条。结论：该技术方便、快捷,值得推广应用。     

hTERT mRNA在食管癌组织中的表达及意义

目的 研究凋亡调控基因hTERT mRNA在食管癌癌组织中的表达及意义.方法 采用RT-PCR检测52例食管癌组织、30例癌旁食管组织（距离肿瘤至少5 cm）和7例非食管癌黏膜组织中hTERT mRNA的表达情况.结果 hTERT mRNA在食管癌组织和癌旁食管组织中表达的阳性率明显高于非食管癌组织（P＜0.05）,食管癌组织中的表达阳性率与癌旁食管组织的表达阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）;hTERT mRNA在食管癌组织中的表达与患者年龄、病理类型、分化程度、浸润程度、淋巴转移和临床分期无相关性（P＞0.05）.结论 hTERT mRNA在食管癌组织中的表达可能是早期事件,检测hTERT mRNA的表达可能对食管癌的早期诊断及治疗具有指导意义.     

食管癌中环氧化酶-2和人端粒酶逆转录酶mRNA的表达

目的 研究环氧化酶-2(COX-2)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA在食管癌组织中的表达及意义.方法 采用RT-PCR检测46例食管癌组织及其对应的癌旁食管组织(距离肿瘤至少5 cm)和65例正常食管黏膜组织中COX-2和hTERT mRNA的表达.结果 COX-2和hTERT mRNA在食管癌组织和癌旁组织中表达的阳性率明显高于正常食管黏膜组织(P<0.05),而在食管癌组织中表达的阳性率与癌旁组织差异无统计学意义(P>0.05);COX-2和hTERT mRNA在食管癌组织中的表达与患者年龄、分化程度、浸润程度、淋巴转移和临床分期无关(P>0.05),而两者表达具有关联性(P=0.015).结论 COX-2和hTERT mRNA在食管癌组织中的表达可能均是早期事件,联合检测这两个基因可能对食管癌的早期诊断及相关治疗具有重要的意义.     

TIMP-1在食管鳞状细胞癌中的表达及意义

目的:探讨金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)在食管鳞状细胞癌及其癌旁正常组织中的表达及与临床病理因素间的关系。方法:100例新鲜离体手术切除食管癌标本,每例分别各取癌组织及对应癌旁组织1份,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法分别检测TIMP-1mRNA在癌及癌旁正常组织中的表达;采用Western Blot法检测TIMP-1蛋白在癌及癌旁正常组织中的表达。结果:TIMP-1mRNA在癌及癌旁正常组织中的表达分别为0.736 4±0.082 9和0.516 0±0.056 0,差异有统计学意义(t=2.203,P=0.029);TIMP-1mRNA在T1+T2期及T3+T4期食管癌组织中的表达分别为0.536 6±0.097 9和0.695 0±0.075 4,差异有统计学意义(t=2.006,P=0.043);TIMP-1mRNA在高、中、低分化食管癌组织中的表达分别为0.396 6±0.074 3,0.907 2±0.128 1和0.548 5±0.089 8,差异有统计学意义(F=3.520,P=0.033);TIMP-1mRNA在有无淋巴结转移、不同大体病理类型、不同性别及不同年龄食管癌间比较,差异均无统计学意义。随机选取的5例标本的Western Blot的检测结果与RT-PCR结果一致,肿瘤组织内的表达高于癌旁正常组织中的表达。结论:TIMP-1在食管鳞状细胞癌浸润生长方面可能发挥了促进作用,与食管癌分化程度可能有关,但与食管鳞状细胞癌淋巴结转移可能无关。     

应用PCR-SSCP/HMA分析食管癌组织中p73基因的突变

目的：检测p73基因在食管癌中的突变状况，分析p73基因在食管癌发生，发展中的角色和作用机制。方法：采用RT－PCR，单链PCR构象多态性（PCR－SSCP）和异源双链体迁移率（HMA）技术检测37例食管鳞状细胞癌肿瘤组织，癌旁组织，区域淋巴结和相应正常食管组织中p73 mRNA的表达和基因的突变情况，并探讨与食管癌临床病理特征的关系。结果：37例食管肿瘤组织中有21例（51．8％）p73 mRNA过度表达，其阳性表达率显著高于相应的癌旁组织，区域淋巴结和正常组织（P＜0．05），并且与食管癌TNM分期，细胞分化程度和病理类型均无明显关系（P＞0．05），未发现食管癌组织中p73基因有任何突变。结论：p73基因在食管癌中的过表达和正常基因型没有能够阻止癌症的恶，可能没有担当起重要的抑癌作用。     

DAPK基因启动子区过甲基化与颈段食管癌的关系

目的 探讨死亡相关蛋白激酶基因启动子区过甲基化与颈段食管癌的关系.方法 采用甲基化特异性PCR(MSP)法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分析颈段食管部正常黏膜、颈段食管癌及相应癌旁组织中DAPK基因启动子区过甲基化及其mRNA表达状况.结果 42例颈段食管癌组织中,有27例(64.3%)DAPK基因启动子区过甲基化,其在各病理分级和T分级之间差异无统计学意义(P>0.05),而在N分级之间差异有统计学意义(P<0.05).25例癌旁组织中,有6例过甲基化,且均为颈段食管癌组织中有过甲基化的病例.颈段食管部正常组织、非甲基化的颈段食管癌组织和癌旁组织中均有DAPK mRNA表达.结论 颈段食管癌中DAPK基因启动子区过甲基化与mRNA失表达有关,可能是颈段食管癌发生、发展的原因之一.     

应用mRNA差异显示技术进行肝癌相关基因的筛选

目的采用mRNA差异显示技术寻找肝癌及非肝癌组织的差异表达基因，筛选肝癌相关基因，为进一步研究创造条件。方法提取手术切除肝癌及非癌肝组织成对标本的总RNA，逆转录获得eDNA片段，以mRNA差异显示方法筛选差异表达基因。对所获得的差异表达基因进行序列分析，并通过CenBank／BLAST数据库进行序列的同源性比较，并以Northern杂交方法对有意义片段予以来源确认。结果自720余条扩增条带中选出28条差异条带，其中“上调”者16条，“下调”者12条。对其中5条差异最为明显的片段进一步分析，其中2条为可能的新基因片段，其中一条经Northern印迹杂交证实确来自源标本组织，且在肝癌组织中有明显高表达趋势。结论mRNA差异显示技术是一种快速、灵敏、高效的差异表达基因的克隆技术，已采用这种技术获得了1条可能的肝癌相关新基因片段，有必要进一步研究。     

食管鳞癌组织中FHIT和MSH2mRNA的检测与分析

目的探讨FHIT和MSH2在食管鳞状细胞癌中的作用及其临床意义。方法采用原位杂交的方法检测62例食管鳞癌组织及62例正常食管黏膜组织中mRNA的表达。结果食管鳞癌癌变过程中FHIT在癌组织中mRNA的表达率低于正常黏膜组织，组间比较差异具有统计学意义；食管鳞癌组织中MSH2mRNA表达低于正常黏膜组织，但组间比较差异无统计学意义。FHIT和MSH2的mRNA的表达呈正相关关系。结论联合检测FHIT和MSH2的表达有可能成为早期诊断食管癌和判断预后的分子指标之一。     

荧光标记mRNA差异显示技术在分离食管癌相关基因片段中的应用

目的 :以荧光标记的mRNA差异显示技术分离食管癌及其正常食管粘膜组织相关的差异基因片段。方法 :结合GenomyxLRTM DNA测序 /差异显示系统及GenomyxSCTM 荧光图象扫描系统 ,以及配套的FluoroDD和HI EROGLYPHmRNAProfileKit,采用荧光标记的mRNA差异显示技术进行检测。结果 :从人食管癌及正常食管粘膜组织间 ,同时直接分离出了相关的癌基因或抑癌基因片段 74条。结论 :该技术方便、快捷 ,值得推广应用     

食管癌组织中肝素酶mRNA的表达

目的:探讨肝素酶mRNA表达与食管癌转移的关系。方法:采用原位杂交技术检测了54例食管鳞癌、癌旁组织及其正常食管组织中肝素酶mRNA的表达。结果:21例有淋巴结转移的食管鳞癌癌组织、癌旁及正常组织中肝素酶mRNA阳性表达率分别为100％(21/21)、66.7％(14/21)和0％(0/21)。而在无淋巴结转移的33例食管鳞癌癌组织、癌旁及正常食管组织中肝素酶mRNA阳性表达率分别为30.3％(10/33)、24.2％(8/33)和0%(0/33)。2组癌组织、癌旁组织肝素酶mRNA阳性表达率差异有统计学意义(P<0.01)。结论:肝素酶mRNA表达与食管鳞癌转移有一定关系。     

食管癌相关基因片段的筛选与鉴定

目的：从已构建的中国人食管癌特异的消减cDNA文库中，初步筛选与鉴定食管癌相关基因片段。方法：随机挑选48个片段作反Northern印迹杂交分析，将杂交信号有差别 的15个片段送测序公司进行测序，用GenBank Blast程序检索，以同源性很小的cDNA片段作为新基因的候选基因，观察其在食管癌组织和正常食管粘膜组织中的表达情况。结果：所获得 的7个序列中：3y59与已知基因同源性很小，且3y59在30例食管癌及其配对正常食管粘膜组织中，19例（63．3％）表达有差别，11例（36．7％）表达无差别（P＜0．05）。3y88与已知基因geminin基因部分同源。另外5个片段3y20,3y14,3y90,3y91和3y92分别与核糖体蛋白RpL7a,TLH29蛋白驱动子，Hsp70/Hsp90-organizing protein,Keratin6(KRT6C) 和内膜蛋白等已知基因序列高度同源。结论：3y59可能是与食管癌的发生、发展有关的新的候选基因。首次发现，geminin基因，核糖体蛋白Rp17a,TLH29蛋白驱动子，Hsp70/Hsp90-organizing protein,Keratin6(KRT6C),内膜蛋白等已知基因可能与食管癌的发生发展有关。     

食管鳞状细胞癌组织中Stathmin蛋白及mRNA的表达

目的：检测食管鳞状细胞癌组织中Stathmin蛋白及mRNA的表达。方法：应用免疫组化SP法和原位杂交技术检测40例食管鳞状细胞癌组织和40例正常食管黏膜组织中Stathmin蛋白及mRNA的表达,并分析二者与食管鳞状细胞癌患者临床病理特征的关系。结果：①正常食管黏膜组织中Stathmin蛋白和mRNA的阳性表达率均为12.5%,食管鳞状细胞癌组织中Stathmin蛋白和mRNA的阳性表达率均为80.0%,2组间相比,差异均有统计学意义（蛋白：χ2=21.806,P〈0.001;mRNA：χ2=20.485,P〈0.001）。②伴有淋巴结转移组的食管鳞状细胞癌组织中Stathmin蛋白和mRNA阳性表达率高于无淋巴结转移组（P均=0.005）;随着浸润深度的增加,Stathmin蛋白和mRNA的阳性表达率逐渐增高（P均=0.010）。结论：食管鳞状细胞癌组织中Stathmin蛋白及mRNA异常表达可能与食管鳞状细胞癌的发生发展及浸润转移有关。     

原位杂交法检测基质金属蛋白酶-9mRNA在食管鳞癌组织中的表达

目的探讨基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在食管鳞状细胞癌中mRNA的表达。方法采用原位杂交的方法检测62例食管鳞癌组织、31例癌旁不典型增生组织及62例正常食管黏膜组织中mRNA的表达。结果食管鳞癌组织及癌旁不典型增生组织中MMP-9mRNA表达均高于正常黏膜组织,表达量分别为71．0％、54．8％、48．4％,组间比较差异有统计学意义（采用χ^2检验,χ^2=6．876,P〈0．05）;食管鳞癌组织中基序逆向诱导半胱氨酸丰富蛋白（RECK）基因蛋白表达与癌组织的分化程度、不同浸润深度及有无淋巴结转移密切相关（采用χ^2检验,χ^2分别为7．458,11．737,3．916,P均〈0．05）。结论MMP-9的高表达可能与食管癌的发生有关,且RECK的低表达可能是癌变早期的分子事件。     

食管细胞系和癌组织中分化抑制因子Id-1 mRNA的表达

目的:探讨分化抑制因子Id-1基因在食管癌组织和食管癌细胞系中的表达状况.方法:采用RT-PCR方法检测食管癌细胞系(EC109、EC1、EC18)、食管永生化上皮细胞系(NECA6-E6E7和NECA6-E6E7-hTERT)及20例食管癌及其配对癌旁正常组织中Id-1 mRNA基因的表达状况.结果:EC109、EC1、EC18、NECA6-E6E7和NECA6-E6E7-hTERT均出现Id-1 mRNA的表达.正常食管上皮中未见其表达,癌旁组织中Id-1 mRNA阳性表达率为35%(7/20),癌组织中为65%(13/20),有升高趋势,但差异无统计学意义(x2=3.6,P＞0.05).结论:Id-1基因可能参与了食管癌的癌变过程.     

食管鳞癌中miR-122-5P的表达及其临床病理学意义

目的 探究食管鳞癌组织中miR-122-5P的表达、临床病理学意义及生物学行为。方法 选取食管鳞癌患者74例,收集手术切除的食管鳞癌组织及其配对的癌旁正常食管组织。采用原位杂交技术检测miR-122-5P的表达,比较食管鳞癌组织与癌旁正常食管组织miR-122-5P表达差异,分析其表达及与肿瘤直径、病理分级、淋巴结转移等临床病理特征的关系。结果 miR-122-5P在食管鳞癌中的阳性表达率35.1%(26/74)明显低于癌旁正常食管组织77.0%(57/74)(X²=26.363,P=0.000)。miR-122-5P与食管鳞癌的肿瘤部位、浸润深度表达差异有统计学意义(X²=16.662,P=0.000;X²=10.723,P=0.005)。食管鳞癌组织中miR-122-5P的表达水平与患者性别、年龄、病理类型、肿瘤直径、病理分级、脉管转移、神经转移及淋巴结转移差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 miR-122-5P在食管鳞癌组织和癌旁组织表达不同,食管鳞癌组织中表达下调,推测其可能具有抑癌基因的功能。     

MMP-9和TIMP-1 mRNA在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其意义 

目的：探讨MMP-9和TIMP-1 mRNA在食管鳞状细胞癌和对应癌旁组织中的表达差异
及其相关性。方法：选取新鲜手术切除的食管癌标本98例,每例分别取癌组织和对应的癌旁组
织各1份,采用RT-PCR法检测MMP-9和TIMP-1 mRNA在食管鳞状细胞癌组织和对应癌旁组织中的表达,分析食管癌组织中M
MP-9和TIMP-1 mRNA表达与临床病理特征的关系;采用Pearson相关分析法分析
MMP-9与TIMP-1 mRNA在食管鳞状细胞癌组织中表达率的相关性。结果：食管癌
组织中MMP-9 mRNA阳性表达率高于癌旁组织,阳性表达率比较差异有统计学意义（χ2=22.873,P=0.000）;食管癌组织中TIMP-1 mRNA阳性表达
率高于癌旁组织,阳性表达率比较差异有统计学意义（χ2=7.864,P=0.005）。
MMP-9 mRNA表达率与食管鳞状细胞癌浸润深度有关联（χ2=5.022,P=0.025）,与食管
鳞状细胞癌淋巴结转移无关联（χ2=0.617,P=0.432）。TIMP-1 mRNA的表达与食管鳞状细胞
癌浸润深度有关联（χ2=4.982,P=0.026）,与食管鳞状细胞癌淋巴结转移无关联（χ2=0.527,P=0.468）。MMP-9 mRNA与TIMP-1 mRNA在食管鳞状细胞癌组织中
的表达率呈正相关关系（r=2.237,P=0.028）。结论：MMP-9和TIMP-1 mRNA表达可能参与
了食管鳞状细胞癌的发生发展,但在食管鳞状细胞癌淋巴结转移方面可能不发挥关键作用。
     

p15在食管癌中的表达及生物学意义

目的探讨p15 mRNA及其蛋白在食管癌中的表达与食管癌发生的关系.方法采用原位杂交(in suit hybridyzation)技术和链霉卵白素-过氧化物酶(streptavidin-horseradish peroxidase, SP)免疫组织化学染色法检测48例食管鳞状细胞癌组织,18例癌旁不典型增生组织和10例切缘正常组织中p15 mRNA及其蛋白的表达水平.结果 p15 mRNA及其蛋白在食管癌组织中的阳性表达率分别为 56.3 % 和 47.9 %,二者表达呈明显正相关(χ2=22,P<0.05),均明显低于在正常组织和不典型增生组织中的表达(P<0.05); 且p15 mRNA及其蛋白的表达与肿瘤的分化程度相关(P<0.05).结论 p15低表达可能与食管癌的发生有关,p15表达对食管癌恶性程度的评估有一定的参考价值.     

食管癌相关基因片段的筛选与鉴定

目的 :从已构建的中国人食管癌特异的消减cDNA文库中 ,初步筛选与鉴定食管癌相关基因片段。方法 :随机挑选 48个片段作反Northern印迹杂交分析 ,将杂交信号有差别的 15个片段送测序公司进行测序 ,用Gen BankBlast程序检索 ,以同源性很小的cDNA片段作为新基因的候选基因 ,观察其在食管癌组织和正常食管粘膜组织中的表达情况。结果 :所获得的 7个序列中 :3y5 9与已知基因同源性很小 ,且 3y5 9在 30例食管癌及其配对正常食管粘膜组织中 ,19例 (6 3.3 % )表达有差别 ,11例 (36 .7% )表达无差别 (P <0 .0 5 )。 3y88与已知基因geminin基因部分同源。另外 5个片段 3y2 0 ,3y14,3y90 ,3y91和 3y92分别与核糖体蛋白RpL7a,TLH2 9蛋白驱动子 ,Hsp70 /Hsp90 organizingprotein ,Keratin6 (KRT6C)和内膜蛋白等已知基因序列高度同源。结论 :3y5 9可能是与食管癌的发生、发展有关的新的候选基因。首次发现 ,geminin基因 ,核糖体蛋白RpL7a,TLH2 9蛋白驱动子 ,Hsp70 /Hsp90 organizingpro tein ,Keratin6 (KRT6C) ,内膜蛋白等已知基因可能与食管癌的发生发展有关