人脐静脉内皮细胞分离、培养及鉴定

目的：寻求一种简单、实用的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分离及培养方法。方法：在传统HUVECs分离、培养的基础上,进行实验方法的改进,用Ⅰ型胶原酶分离HUVECs;通过倒置显微镜观察HUVECs生长情况,最后使用Ⅷ因子免疫荧光及摄取Dil-Ac-LDL实验鉴定HUVECs,采用流式细胞术检测HUVECs纯度。结果：改进实验工序和精化实验操作后,HUVECs分离不受影响,原代HUVECs3～4d后融合,传代后2～3d融合,倒置显微镜下见细胞呈＂铺路石＂状,有接触性抑制现象,Ⅷ因子及摄取Dil-Ac-LDL实验呈阳性,流式细胞术检查细胞纯度达92.9%。结论：本培养方法操作简便,培养周期短,获得的HUVECs纯度较高,有助于体外研究血管内皮细胞模型的构建。     

血清饥饿对原代人脐静脉内皮细胞周期同步化的影响

目的探讨人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）的最佳饥饿条件,以建立高效稳定的 HUVECs体外分离提取方法,并为HUVECs相关实验提供研究基础。方法用0.1%Ⅱ型胶原酶灌注脐静脉腔消化15 min,收集 细胞并用内皮细胞专用培养基（含5%内皮细胞基础培养基、1%内皮细胞生长因子、1%青链霉素）,置37 ℃,5% CO2培养箱培 养。在倒置显微镜下观察细胞形态特点,并用细胞免疫荧光方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术检测所得HUVECs的纯 度,并检测0%、0.1%、0.5%、1%血清浓度的培养基饥饿处理0、6、12、18、24 h对细胞周期的影响。结果0.1%Ⅱ型胶原酶消化可 以得到HUVECs,细胞培养呈典型的铺卵石状排列,细胞较密处呈涡旋状排列。免疫荧光检测细胞VIII因子相关抗原表达呈阳 性。流式检测细胞纯度高达99.67%。不同血清浓度培养基培养6 h可获得70%左右的G0/G1期细胞;培养12 h可获得80%~90% 的G0/G1期细胞;培养18、24 h 可获得95%左右的G0/G1期细胞。结论0.1%Ⅱ型胶原酶充盈静脉管腔可以获得高纯度的原代 HUVECs。完全无血清培养基培养12 h即可获得纯度超过80%的G0/G1期HUVECs。     

人脐静脉内皮细胞的原代培养及鉴定

目的:体外进行人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)原代培养及鉴定.方法:用0.1%Ⅱ型胶原酶消化法收集HUVECs,加入含20%胎牛血清的M199培养基在37℃、5%CO2孵箱中培养,用Tryple express进行消化传代培养.采用细胞形态学观察、流式细胞仪测定CD34鉴定细胞.结果:原代培养的HUVECs在24 h完全贴壁,在3～5天融合成片,呈现单层铺路石样改变.流式细胞仪测定内皮细胞纯度为75.52%.结论:Ⅱ胶原酶及Tryple express的灵活使用可获得大量连续传代培养的HUVECs.     

肺泡Ⅱ型细胞培养方法的探讨

目的 :研究不同方法对体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞纯度、活力、产量、存活时间的影响。方法 :不同浓度胰蛋白酶消化法和胰蛋白酶加胶原酶消化法消化、分离组织 ,低密度接种 ,常规浓度含血清培养和无血清培养 ,抗大鼠IgG包被与不包被 ,倒置显微镜观察细胞生长 ,检测细胞活力 ,免疫组织化学方法鉴定细胞纯度和电镜检测鉴定细胞。结果 :两种方法消化、分离组织 ,肺泡Ⅱ型上皮细胞纯度、活力、产量、存活时间经统计学分析无显著性差异。结论 :不同浓度胰蛋白酶消化分离肺组织程序相对简单、低密度接种、无血清培养所得细胞纯度能够满足体外研究肺泡Ⅱ型上皮细胞功能的需要 ,从而简化了体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞的程序。     

人脐静脉内皮细胞的原代培养及鉴定

目的建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)体外培养模型,并对其进行鉴定,为体外血管内皮细胞及相关疾病的研究搭建桥梁。方法采用0.1%Ⅰ型胶原酶分离脐静脉内皮细胞,于M199培养基(含20%胎牛血清,80%M199不完全培养基,1%终浓度为50μg/mL内皮细胞生长复合物,1%终浓度为100μg/mL肝素钠,1%青-链霉素,1%L-谷氨酰胺)中培养,待细胞80%以上融合后,用0.25%的胰酶和0.25%的EDTA消化传代,并在倒置显微镜下观察细胞形态,用免疫荧光法对细胞进行鉴定。结果原代培养的HUVECs在24 h后完全贴壁,2～3 d可达80%的融合,倒置显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排布,免疫荧光显示细胞胞浆中Ⅷ因子相关抗原阳性。结论 0.1%Ⅰ型胶原酶消化HUVECs方法便于操作,细胞获得量多且生长状态良好。     

肺泡型细胞培养方法的改良及其应用

目的研究不同方法对体外培养肺泡型上皮细胞纯度、活力、产量、存活时间的影响。方法采用不同浓度胰蛋白酶消化法和胰蛋白酶加胶原酶消化法消化、分离组织,低密度接种,常规浓度含血清培养和无血清培养,抗大鼠IgG包被与不包被,倒置显微镜观察细胞生长,检测细胞活力,免疫组织化学方法鉴定细胞纯度和电镜检测鉴定细胞。结果两种方法消化、分离组织,肺泡型上皮细胞纯度、活力、产量、存活时间经统计学分析无显著性差异。结论不同浓度胰蛋白酶消化分离肺组织程序相对简单、低密度接种、无血清培养所得细胞纯度能够满足体外研究肺泡型上皮细胞功能的需要,从而简化了体外培养肺泡型上皮细胞的程序。     

人离体子宫在位内膜细胞的原代培养方法探讨

目的:比较不同的消化酶对人离体子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞分离培养的异同,为研究人体子宫内膜细胞生长、分化及药物作用机制提供一个较理想的实验方法。方法:将人离体子宫内膜细胞随机分为胰酶组、胶原酶组、胰酶组和胶原酶联合消化组进行消化分离和体外培养,用倒置相差显微镜观察细胞的生长状况及形态特点。结果:3组的培养成功率分别为53.33%、73.33%、86.67%。联合消化组较胰酶组培养成功高(P<0.05)。3种不同方法消化分离后的子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞贴壁、生长状况无明显差异(P>0.05)。结论:采用胰酶与胶原酶联合消化法进行子宫内膜细胞消化分离和体外培养,较单用胰酶法细胞培养的成功率高,比单用胶原酶缩短了消化时间,具有降低培养成本的优点。     

肺泡Ⅱ型细胞培养方法的改良及其应用

目的：研究不同方法对体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞纯度、活力、产量、存活时间的影响。方法：采用不同浓度胰蛋白酶消化法和胰蛋白酶加胶原酶消化法消化、分离组织，低密度接种，常规浓度含血清培养和无血清培养，抗大鼠IgG包被与不包被，倒置显微镜观察细胞生长，检测细胞活力，免疫组织化学方法鉴定细胞纯度和电镜检测鉴定细胞。结果：两种方法消化、分离组织，肺泡Ⅱ型上皮细胞纯度、活力、产量、存活时间经统计学分析无显著性差异。结论：不同浓度胰蛋白酶消化分离肺组织程序相对简单、低密度接种、无血清培养所得细胞纯度能够满足体外研究肺泡Ⅱ型上皮细胞功能的需要，从而简化了体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞的程序。     

人主动脉内皮细胞体外培养方法的建立及生物学活性鉴定

目的：建立体外人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells，HAECs）提取和培养的方法。方法：从术中取下的人主动脉组织上剥离内皮层，Ⅰ型胶原酶消化分离HAECs，利用显微镜观察其生长状况，免疫组织化学方法及流式细胞法鉴定及检测细胞纯度，以氧化低密度脂蛋白（oxidized low?density lipoprotein，ox?LDL）检测细胞吞噬功能并检测细胞在体外的血管生成能力。结果：0.1%及0.2%的Ⅰ型胶原酶，最佳消化时间均为50 min，2 h贴壁细胞数分别（25.2 ± 2.1）×103，（40.5 ± 3.8）×103）个。细胞融合后在倒置显微镜下呈“鹅卵石”样排列生长。血小板?内皮黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule?1，CD31）及Ⅷ因子鉴定为阳性，细胞纯度达（96.43 ± 4.12）%。细胞内吞ox?LDL及血管生成能力较好。结论：钝性分离主动脉内皮层，辅以Ⅰ型胶原酶消化是一种较好的HAECs获取方法，酶浓度及消化时间是其重要的影响因素。     

新生C57BL/6小鼠成肌细胞体外培养、纯化和鉴定的实验研究

目的建立C57BL/6小鼠成肌细胞体外培养、纯化和鉴定的方法。方法采用Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶消化分离新生C57BL/6小鼠的成肌细胞,用Percoll分离液纯化细胞,在含15%胎牛血清的DMEM培养基中进行成肌细胞培养,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,Desmin抗体鉴定成肌细胞。结果经过Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶消化分离,Percoll纯化的成肌细胞纯度较高,Desmin染色95%以上的细胞胞浆染色阳性。结论采用Percoll纯化、国产胎牛血清培养,可以获得高纯度的成肌细胞。     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

细胞培养技术的研究进展

随着现代科学的发展,体外细胞培养技术已成为多个领域必不可少的研究工具,并且其新技术和方法也在不断涌现。本文就细胞培养技术的发展、支架材料以及细胞培养的影响因素作一综述。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

人成纤维细胞产生的抑制因子对肿瘤和转化细胞增殖与分化的影响

对人成纤维细胞产生的抑制因子(HFDI)的细胞生长抑制效应进行研究,发现HFDI对肿瘤细胞~3H—TdR掺入抑制是由于使细胞变性坏死或促使细胞有限分化所致;并证明HFDI对PHA刺激的淋巴细胞转化的抑制,也是由于使转化细胞变性坏死或促使细胞向成熟方向发展所致。     

新生豚鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及标记

目的 从新生豚鼠海马中分离培养神经干细胞，为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋的实验研究创造条件。方法 分离新生豚鼠海马组织，用含碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）无血清培养技术培养神经干细胞，免疫组化技术检测其巢蛋白（Nestin）的表达。采用荧光染料DAPI标记神经干细胞。结果 从新生豚鼠海马组织分离出的细胞中可获得呈集落样生长的神经干细胞团，并能表达Nestin；荧光染料的标记效率可达93．4％，细胞传代8次后荧光亮度仍无明显衰减。结论 从新生豚鼠海马分离的细胞具有明显的增殖能力，荧光染料的标记可获得较高的标记效率，可作为神经干细胞移植治疗感音神经性耳聋实验研究的供体细胞。     

睾丸支持细胞与骨髓间充质干细胞共培养的初步研究

目的 观察睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)与骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)共培养时SCs对MSCs扩增的影响. 方法 取雄性SD大鼠睾丸,分离出SCs,取SD大鼠,分离出骨髓MSCs,将两种细胞用"三明治"式的方法共培养7 d. 结果 共培养组的MSCs前四天生长较对照组快,第5天无明显差异,第6和第7天细胞数量迅速减少. 结论 在体外共培养的早期,SCs可以显著促进MSCs的生长,但在后期则反而抑制MSCs的生长,具体原因有待进一步研究.     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .