耐乙胺丁醇结核分枝杆菌基因型研究

目的研究青海地区耐乙胺丁醇结核分枝杆菌菌株embB基因突变特征,并比较耐乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)菌株中耐多药结核分枝杆菌(Multiple drug resistance,MDR)与非结核分枝杆菌菌株的embB基因突变差异。方法采用聚合酶链式反应方法对63株耐乙胺丁醇的结核分枝杆菌的embB高突变区进行扩增,并分析embB基因突变特征。结果 63株耐乙胺丁醇的结核分枝杆菌中,28株在embB基因发生突变,突变率为44.44%(28/63);53株结核分枝杆菌且耐乙胺丁醇菌株中,22株(45.51%,22/53)在embB基因发生突变;10株非结核分枝杆菌耐乙胺丁醇菌株中,6株(60.00%,6/10)在embB基因发生突变。位点embB306和embB406为高突变点,分别占突变菌株的67.86%(19/28)和21.43%(6/28)。耐乙胺丁醇菌株中,结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌菌株的embB基因突变差异无统计学意义(χ~2=0.536,P=20.464)。结论青海地区对乙胺丁醇耐药的结核分枝杆菌常见突变位点为embB306和embB406。单测embB基因不能非常有效地快速检测出乙胺丁醇耐药状况,增加emb A及其调控区的检测,能提高耐乙胺丁醇菌株的检出率。     

深圳地区结核临床分离菌基因突变与耐药的关系

目的研究深圳地区结核分枝杆菌临床分离株的基因突变与利福平（RFP）、异烟肼（INH）、链霉素（SM）和乙胺丁醇（EMB）耐药之间的关系。方法采用反向斑点杂交技术（RDBHA）对182株结核分枝杆菌临床分离株的rpoB、katG、inhA、rpsL和embB基因突变位点进行检测,并采用L-J比例法检测这些分离株对RFP、INH、SM、EMB的耐药性。结果 182株临床分离株中,总的基因突变率为34.62%（63/182）,其中rpoB基因突变率最高,达24.17%（44/182）。多重耐药结核菌（MDR-TB）占17.03%（31/182）。以L-J比例法作为金标准,采用RDBHA技术检测分别与RFP、INH、SM、EMB耐药相关的rpoB、katG/inhA、rpsL、embB基因突变,其灵敏度分别为88.89%、67.50%、81.82%和64.29%,特异度分别为97.08%、94.37%、97.99%和92.86%。结论深圳地区结核分离株ropB基因突变最普遍,S531L位点是其突变率最高的位点。深圳地区结核分枝杆菌对4个一线抗痨药物耐药现象均较严重,反向斑点杂交技术（RDBHA）可快速检测结核分枝杆菌耐药基因突变,能给临床提供快速用药指导。     

应用DNA芯片法检测耐多药结核分枝杆菌的研究

目的应用DNA芯片技术快速检测耐多药结核菌的常见突变位点,初步评价其临床应用价值。方法以结核分枝杆菌标准株H37RV为对照,应用基因芯片技术、聚合酶链反应-单链构象多态性技术、聚合酶链反应-直接测序技术检测46株耐多药结核分枝杆菌临床分离株katG、rpoB基因。结果 46例耐多药菌株中,应用基因芯片检测出katG基因突变28株,检出率为60.9%(28/46);检测出rpoB基因突变37株,检出率为80.4%(37/46);同时检测出二者突变共25株,检出率为54.3%(25/46)。结论基因芯片技术操作简单、检测快速,对异烟肼、利福平耐药基因检出率较高,可作为临床耐药检测的辅助手段。     

结核分枝杆菌耐药基因快速检测

目的 探讨结核分枝杆菌耐链霉素(SM)和利福平(RFP)的耐药分子机制，采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)同时检测rpsL基因、rpoB基因突变在结核分枝杆菌耐链霉素(SM)和利福平(RFP)耐药性测定中的应用价值。方法 采用PCR-SSCP技术对122株结核分枝杆菌临床分离株rpsL基因、rpoB基因突变同时进行检测，即首先用PCR方法同时扩增RFP、SM的rpoB基因和rpsL基因，然后进行SSCP分析。结果 以结核分枝杆菌H37RV为对照，48株药物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未见SSCP图谱异常。特异性为100.0％，74株同时耐链霉素和利福平的耐药株中，59株(79.7％)有rpsL基因图谱异常；69株(93.2％)有ropB基因图谱异常。结论 ropB基因突变和rpsL基因突变分别是结核分枝杆菌耐利福平和链霉素的主要分子机制。应用PCR-SSCP技术可同时快速检测结核分枝杆菌链霉素和利福平耐药性。     

结核分枝杆菌rpoB基因突变与多重耐药及利福平耐药程度的相关性

目的 研究结核分枝杆菌，rpoB基因突变与多重耐药及利福平耐药程度强弱之间的关系。方法应用绝对浓度法测定58株结核分枝杆菌对4种－线抗结核药物的药敏特性，对耐利福平结核分枝杆菌的耐药谱进行分析。同时对含有核心突变区的结核分枝杆菌，rpoB基因片段进行PCR扩增和DNA测序，分析rpoB基因突变与多重耐药的关系，以及突变位点和突变性质与利福平耐药强弱的相关性。结果58株结核分枝杆菌中，利福平耐药株36株，敏感株22株。36株耐药株均存在，rpoB基因突变，其中88．9％(32／36)至少对利福平和异烟肼同时耐药。90．O％的利福平高度耐药株(18/20)与rpoB基因531位和526位密码子突变相关。密码子531位和526位各有1株双碱基突变，且均为多重耐药株。结论结核分枝杆菌，rpoB基因突变所致的利福平耐药株大部分对异烟肼耐药，因此单独检测rpoB基因突变即可初步筛选多重耐药的结核分枝杆菌；而rpoB基因的突变位点与利福平耐药程度之间具有一定的相关性。     

广西百色地区结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB的突变特征分析

目的分析百色地区结核分枝杆菌(MTB)利福平耐药相关基因rpoB的突变特征。方法收集128例结核病患者痰液标本,采用改良罗氏培养基分离培养结核分枝杆菌,绝对浓度法检测利福平耐药性,PCR技术检测耐药结核分枝杆菌rpoB基因序列并测序分析利福平耐药相关基因rpoB的突变特征。结果分离培养获得98例MTB,98例MTB出现36株利福平耐药,耐药率为36.73%,36株耐利福平菌株中有27株rpoB基因发生突变,基因突变率为75.00%,其中516位点突变率为3.70%(1/27),531位点突变率为59.26%(16/27),526位点突变率为29.63%(8/27),533位点突变率为7.41%(2/27)。突变热点依次为rpoB531、rpoB526和rpoB533。结论百色地区耐利福平结核分枝杆菌耐药性产生的主要分子机制是因为rpoB的基因发生突变。     

基因芯片检测结核分枝杆菌耐药突变基因的结果分析

目的:用基因芯片检测临床痰液标本中的结核分枝杆菌对异烟肼(INH)、利福平(RIF)、链霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)的耐药性,并评价其临床应用价值。方法:本基因芯片采用聚合酶链反应(PCR)和反向点杂交相结合的技术,快速完成异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇四个结核分枝杆菌耐药基因(katG、inhA、rpoB、rpsL、embB)突变位点的检测。同时以传统药敏试验法作对照。结果:基因芯片法对结核分枝杆菌INH耐药性检测符合率、特异性分别为82.1%、100%;对RFP耐药性检测符合率、特异性分别为94.9%、100%;对SM耐药性检测符合率、特异性分别为76.5%、100%;对EMB耐药性检测符合率、特异性分别为82.6%、100%。结论:基因芯片检测结核分枝杆菌的耐药性能满足临床的快速需要,但基因芯片法检测的抗结核药数量有限,并不能完全取代常规药物敏感性试验,因此基因芯片法可作为快速筛选有效抗结核药的补充。     

耐多药结核分枝杆菌基因突变在耐药性检测中的应用

目的:探讨结核分枝杆菌耐链霉素(SM)和利福平(RFP)的耐药分子机制,应用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)同时检测rpsL基因、rpoB基因突变在结核分枝杆菌耐SM和RFP耐药性测定中的应用价值。方法:采用PCR-SSCP技术对168株结核分枝杆菌临床分离株rpsL基因、rpoB基因突变同时进行检测。即首先用PCR方法同时扩增RFP、SM的rpoB基因和rpsL基因,然后进行SSCP分析。结果:以结核分枝杆菌H37RV为对照,82株药物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未见SSCP图谱异常。特异性为100%。86株同时耐SM和RFP的耐药株中,68株(79.1%)有rpsL基因图谱异常;81株(94.2%)有rpoB基因图谱异常。结论:rpoB基因突变和rpsL基因突变分别是结核分枝杆菌耐RFP和SM的主要分子机制。应用PCR-SSCP技术可同时快速检测结核分枝杆菌SM和RFP耐药性。     

膜反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇基因型

目的应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌对乙胺丁醇（EMB）耐药性。方法设计与合成用于检测结核分枝杆菌耐EMB基因embB的寡核苷酸探针，点于硝酸纤维素膜上，与结核分枝杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应（PCR）产物进行反向斑点杂交，并与PCR-直接测序（PCR—DS）结果比较。结果27株结核分枝杆菌临床分离株中，14株敏感株膜反向斑点杂交结果与标准株完全相同；13株耐乙胺丁醇临床分离株检测到embB基因突变。均为306位密码子ATG→GTG、ATG→CTG、ATG→ATA、ATG→ATT和ATG→ATC突变．该突变与直接测序结果完全一致。结论膜反向斑点杂交技术可能成为检测部分结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因型简便、快速的方法。     

应用基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐异烟肼基因型

目的研制一种新型DNA芯片,用于快速检测结核分枝杆菌耐异烟肼katG基因突变。方法根据结核分枝杆菌katG基因序列设计探针并制作DNA芯片,用四甲基罗丹明标记的引物扩增结核分枝杆菌katG基因突变热点的片断,与DNA芯片杂交,同时以聚合酶链反应-单链构象多态性(pdymerase chain reaction-single stranded conformation polymorphism,PCR-SSCP)和DNA测序法为对照。结果153株结核分枝杆菌临床分离株中30株异烟肼敏感株的PCR-SSCP和DNA芯片杂交结果与结核分枝杆菌标准株完全相同,123株异烟肼耐药株中有85株检测到katG基因突变,占69.1%(85/123)。其中83株为315位密码子AGC→ACC突变,2株为315位密码子AGC→AAC突变,该突变与PCR-SSCP和DNA芯片杂交结果一致;余38株未检测到突变,经测序证实其中1株PCR-SSCP有不同突变的为279位密码子GGC→GAC突变,因芯片上未点该位点的探针,所以杂交结果为阴性。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐异烟肼分离株的katG基因突变,可用于临床耐药性的检测,指导临床用药。     

结核分支杆菌耐药分子机制及快速检测的研究

目的：研究结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药的分子机制，探索快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性的分子生物学方法。方法：应用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药株与katG基因、rpoB基因突变。结果：46例株结核分支杆菌临床分离株均未发现katG基因序列的缺失，17株检测到katG基因突变，耐药株中katG基因的突变率为57％；87株结核分支杆菌利福平耐药临床分离株的PCR－SSCP结果显示，所有39株利福平敏感菌无突变检出，48株利福平耐药菌中，36株高度利福平耐药菌和7株低度利福平耐药菌检测到rpoB基因突变；另5株低度利福平耐药菌未检测到rpoB基因突变，利福平耐药株中rpoB基因的突变检出率为89．6％。结论：证实katG和rpoB基因突变分别是结核分支杆菌异烟肼和利福平耐药的主要分子机制。应用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）可快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性，使应用传统耐药测定方法需时1－2个月缩短到2天内即可完成，使非生长依赖性分子生物学手段应用于快速检测结核分支杆菌耐药性成为可能。     

某地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药相关基因突变特征分析

目的了解深圳地区结核分枝杆菌临床分离株利福平和异烟肼的耐药相关基因的突变特点。方法 60株结核分枝杆菌临床分离株通过全自动快速分枝杆菌培养鉴定系统(BACTEC-MGIT960)进行鉴定和药敏分析。在这60株菌株中,针对包括利福平耐药决定区(RRDR)在内的rpoB基因和异烟肼耐药相关位点katG315、inhA-15、kasA269、kasA312进行PCR扩增,并将扩增产物T-A克隆后进行测序。结果在60株结核分枝杆菌临床分离株中,检出利福平耐药株45株,敏感株15株;异烟肼耐药株41株,敏感株19株;利福平和异烟肼同时耐药的有14株。在45株利福平耐药株中,rpoB基因RRDR突变发生率为91.1%(41/45),共检测到12种突变形式,主要突变位点在531、526、516、533,以Ser531Leu突变最常见,占rpoB发生基因突变株的51.2%(21/45)。在41株异烟肼耐药株中,katG315位点有29株发生突变,包括28株katG315(AGC-ACC)和1株katG315(AGC-AAC)突变,突变发生率为70.7%(29/41);inhA-15位点有9株发生突变,均为(C-T)突变,突变发生率为21.95%(9/41)。kasA基因未发现常见突变形式。结论深圳地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药相关基因突变位点与国内外研究基本一致,但各位点频率有所不同。     

结核分枝杆菌耐利福平株rpoB基因突变的研究

目的了解遵义地区结核分枝杆菌耐利福平临床分离株rpoB基因突变特点.方法采用比例法对肺结核患者痰标本分离的127株结核分枝杆菌进行药物敏感性试验,并对结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因包括耐药决定区81个碱基在内的412bp片段进行PCR扩增及序列测定.结果127株结核分枝杆菌临床分离株中49株对利福平耐药,78株对利福平敏感.49株耐利福平临床分离株中,31株rpoB基因存在突变(63.3%),突变位点为531、526和516等;511位点CTG→CAG(Leu→Pro)为新的突变位点;4株双位点联合突变,其中2例为新的联合突变:GAC516GGC,ATC572CTC和CTG511CAG,CAC526AAC.结论结核分枝杆菌耐利福平与rpoB基因突变相关,且存在地区差异.     

91株耐利福平结核分枝杆菌的rpoB基因突变分析

目的分析利福平耐药结核菌株rpoB基因突变特点,探讨DNA序列分析在药敏测定中的意义。方法对101株结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因的PCR产物进行测序分析,观察其rpoB基因突变的规律。结果 101株临床分离株中,耐利福平91株,经DNA序列分析有85.71%(78/91)菌株存在rpoB基因突变的突变,主要集中在531位(44.87%)和526位(28.21%),未检测到发生缺失或插入碱基突变的菌株,10株敏感株均无突变。结论 rpoB基因核心突变区发生突变是结核分枝杆菌对利福平耐药的主要原因,其中531位丝氨酸和526位组氨酸是最常见的突变位点。     

痰耐药结核分枝杆菌rpoB基因的快速检测及利福平耐药机制研究

目的快速检测痰耐药结核分枝杆菌rpoB基因，了解利福平耐药的分予机制。方法根据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物．用PCR方法从耐药肺结核患者痰及临床分离菌株扩增rpoB基因片段，对扩增获得的rpoB基因片段进行序列测定，比较分析耐多药、全耐、单耐利福平、全敏感或标准结核分枝杆菌株之间的基因序列差异。结果于6h内从耐药肺结核痰中快速检测到rpoB举因。耐多药菌株、全耐及单耐利福平分离菌株均检测有rpoB基因点突变，突变位点主要为531、516或526常见密码子，且绝大多数为单碱基突变，发现1例MDR-TB出现479位和531位密码子同时突变。敏感株和标准株无基因突变。结论PCR及序列分析方法可快速、准确检测结核分枝杆菌rpoB基岗及其突变，结核分枝杆菌埘利福平的耐药性与rpoB基因点突变有关。     

临床肺结核治疗中耐药性分析及对策

目的:了解从分离自肺结核患者的结核分枝杆菌耐药基因突变率及耐药情况,以利抗结核治疗中药物的合理选用。方法:对痰涂片阳性的新发初治和复治肺结核患者进行痰结核分枝杆菌培养,阳性菌株采用高、低两种药物浓度,四种抗结核药物耐药性测试,同时用实时PCR法对结核分枝杆菌的耐药基因和突变进行检测。结果:127例痰培养阳性菌株总耐药率为14.2%,其中初治耐药率8.1%,复治耐药率35.7%,对四种抗结核药物的耐药率依次为异烟肼8.7%,利福平2.4%,链霉素2.4%,乙胺丁醇0.8%。耐药基因检测结果,在初治组中rpoB和katG的突变率为12.1%(12/99)和10.1%(10/99);复治组中rpoB和katG的突变率为32.1%(9/28)和21.4%(6/28)。结论:分离自肺结核患者的结核分枝杆菌在初始治疗时已存在耐药性,而药物治疗有可能使其耐药性增加。结果表明抗结核治疗前及在治疗过程中对结核分枝杆菌进行耐药性及耐药基因检测对指导临床抗结核治疗很有实际意义。     

PCR-SSCP快速检测耐多药结核分枝杆菌

目的:了解本地区结核病耐药基因突变情况,探讨PCR-SSCP作为新的分子药敏试验方法在临床的应用价值。方法:通过提取耐INH、RFP、SM的肺结核患者痰中结核分枝杆菌DNA,进行PCR-SSCP分析,检测结核分枝杆菌rpoB、katG、rpsL基因是否存在突变,并与传统L-J药敏实验对照。结果:30株耐多药株中,耐RPF、INH、SM基因突变阳性率为90%(27/30)、63%(19/30)、53%(16/30)。3个基因联合突变共8株(26.7%),2个基因联合突变共18株(60%),即26株(86.7%)。单基因突变共2株,2株无基因突变。结论:通过PCR-SSCP方法可检测出绝大部分耐多药结核病的耐药基因,rpoB、katG、rpsL基因突变与本地区结核杆菌对RFP、INH、SM耐药性有关。与传统L-J药敏实验对比,PCR-SSCP是一种敏感、快速的指导临床用药的先进检测方法。     

L型结核分枝杆菌rpoB基因突变与利福平耐药性研究

目的：探讨L型结核分枝杆菌rpoB基因突变与利福平耐药性的关系。方法：采用PCR和PCR-DS技术对23例初治肺结核和45例复治肺结核患者L型结核分枝杆菌临床分离株进行rpoB基因检测和序列分析。结果：初治肺结核L型结核分枝杆菌rpoB基因突变率为4.3%,复治肺结核耐L型结核分枝杆菌rpoB基因突变率为40.0%。结论：复治肺结核L型结核分枝杆菌rpoB基因突变率高于初治肺结核,L型菌rpoB基因突变是造成结核分枝杆菌形成利福平耐药性的主要机制。     

PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌耐药性

目的：探讨耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药性的关系以及聚合酶链反应-单链构象多态性分析(poly merase chain reaction-single strand cinfomlation polymorphism，PCR-SSCP)方法的临床应用价值。方法：用PCR-SSCP方法检测58株结核分枝杆菌临床分离株katG，rpoB，rpsL基因突变并与常规药敏试验检测结果进行对比。结果：经常规药敏试验检测，58株结核分枝杆菌临床分离株中共有41株耐药，其中，耐异烟肼(INH)为35株，高耐药株27株；耐利福平(RFP)为31株，高耐药株24株；耐链霉素(SM)有31株，高耐药株26株。同时耐3种药物的有21株(51．2％)，耐2种药物的14株(34．1％)，单耐药株6株(14．6％)．PCR-SSCP方法对58株临床分离株katG，rpoB，rpsL基因突变的检测率为40％(23／58)，45％(26／58)，38％(22／58)，其中检出3个基因同时突变的有13株(32％)，2种基因突变的12株(29％)，1种基因突变的有10株(23．8％)．常规药敏试验与PCR-SSCP法检出结核分枝杆菌同时耐3种药物的符合率为61．9％(13／21)，检出耐2种药物的符合率为85．70k，(12／14)，检出耐1种药物的符合率为50％(3／6)．高耐药株中突变率为80．5％(62／77)，低耐药株中突变率为60％(12／20)．结论：PCR-SS-CP方法对耐2种以上药物的结核杆菌检出率较高，且耐药基因突变率随着耐药浓度增高而增高。将PCR-SSCP法与药敏试验联合应用可互相弥补，已成为临床指导用药的好方法。     

结核分支杆菌耐药分子机制的检测技术的研究

目的：探讨结核分支杆菌对异烟肼、利福平耐药的分子机制，建立快速检测耐药分支杆菌基因型的分子生物学方法。方法：采用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR—SSCP)同时检测结核分支杆菌敏感株和耐异烟肼、利福平耐药株的KayG基因、rpoB基因突变。结果：78株结核分支杆菌临床分离株均未发现KatG、rpoB基因缺失。以结核分支杆菌H37RV为对照，36株药物敏感株的KarG、rpoB基因SSCP图谱均正常。42株同时耐异烟肼和利福平的多耐药株中，KatG和rpoB基因突变率分别为66．7％(28／42)，90．5％(38／42)。结论：结核分支杆菌耐异烟肼、利福平耐药性的产生是由于KatG基因和rpoB基因突变所致。应用PCR-SSCP技术可同时快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性。