鱼藤酮致线粒体氧化损伤的作用和机制

鱼藤酮是线粒体呼吸链上复合体I的经典抑制剂之一。大量的研究表明当鱼藤酮作用于活体的动物或细胞 时,可导致线粒体功能紊乱、ROS生成增加,蛋白质、脂质、核酸遭受氧化损伤。以线粒体与ROS的生成、鱼藤酮促 线粒体ROS生成机制、鱼藤酮促DNA损伤机制为中心,阐述鱼藤酮致线粒体氧化损伤的相关作用和机制;同时探讨 鱼藤酮作用下线粒体DNA(mtDNA)的损伤及其可能存在的mtDNA突变。     

半胱氨酰白三烯受体1参与鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的调节

目的:观察半胱氨酰白三烯受体1(CysLT1受体)与鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的关系。方法:鱼藤酮及CysLT1受体拮抗剂孟鲁司特处理PC12细胞后,以MTT方法检测PC12细胞活性变化;以Western blotting检测鱼藤酮处理前后,PC12细胞CysLT1受体的表达变化;不同浓度鱼藤酮处理24 h及3μmol/L鱼藤酮处理不同时间,以免疫细胞化学方法观察CysLT1受体分布变化。结果:鱼藤酮(0.3～30μmol/L)可诱导PC12细胞损伤,孟鲁司特(1、5μmol/L)可显著减轻鱼藤酮诱导的细胞损伤。1～10μmol/L鱼藤酮作用PC12细胞24 h及3μmol/L鱼藤酮处理3 h和24 h,均可诱导CysLT1受体蛋白水平表达升高。鱼藤酮能浓度和时间依赖性引起CysLT1受体从细胞核移位到细胞浆。结论:CysLT1受体参与鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤。     

辅酶Q10能有效抑制鱼藤酮诱导的细胞毒性作用

目的:探讨辅酶Q10对鱼藤酮介导的多巴胺能神经元损伤是否具有保护作用并研究其机制.方法:原代培养孕 14 d的胎鼠中脑多巴胺能神经元.以不同剂量的鱼藤酮建立细胞凋亡模型.通过 TH 免疫细胞化学进行鉴定,测定LDH值以了解细胞活力.以罗丹明123染料进行流式细胞仪检测线粒体膜电位(△Ψm).结果:鱼藤酮干预多巴胺能神经元24 h后,细胞活力及△Ψm均明显下降,与0 nmol/L鱼藤酮组比较,15 nmol/L及30 nmol/L鱼藤酮组的LDH值(U/ml)显著增加(P<0.05),其△Ψm(%)则明显下降(P<0.05);辅酶Q10 12 h能显著缓解细胞△Ψm的下降,与15 nmol/L鱼藤酮组比较,50 μmol/L 及100 μmol/L 辅酶 Q10预处理组的△Ψm(%)明显上升(P<0.05).结论:辅酶 Q10能有效抑制鱼藤酮诱导的细胞毒性作用.     

FGF21对鱼藤酮导致神经细胞损伤的作用及其机制

采用鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞损伤建立帕金森病样病变细胞模型，探讨成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor 21，FGF21）对其作用及机制。以不同浓度的FGF21对鱼藤酮诱导的神经细胞损伤模型进行干预，MTT法检测神经细胞活性；采用Annexin V-FITC/PI双染法分析神经细胞凋亡情况；Western blot检测FGF21及鱼藤酮对神经细胞酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）和α-突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）表达的影响；采用DCFH-DA荧光探针检测FGF21及鱼藤酮对神经细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的作用。结果显示：FGF21能够减少鱼藤酮致神经细胞的损伤，抑制神经细胞凋亡，缓解鱼藤酮引起的神经细胞TH和α-syn水平的异常，同时降低神经细胞内异常ROS水平，提示FGF21可能通过调控氧化应激进而缓解鱼藤酮导致的神经细胞损伤。     

中脑腹侧多巴胺能神经元对氧化应激反应的性别差异

目的研究中脑腹侧(VM)多巴胺能神经元对氧化应激反应的性别差异。方法原代培养不同性别Balb/c胎鼠的VM多巴胺能神经元,分为对照组(未处理)、鱼藤酮组(25 nmol/L鱼藤酮处理8 h)、雌激素+鱼藤酮组(用1×10-7mol/L的17β-雌二醇预处理1 h后,加25 nmol/L鱼藤酮处理8 h)。采用免疫组织化学法观察不同性别神经元的损伤程度;MTT法检测细胞存活率;W estern b lotting检测不同性别细胞酪氨酸羟化酶(TH)蛋白的表达。结果免疫组织化学检测结果显示:鱼藤酮组雄性细胞较雌性细胞损伤大,TH阳性细胞更明显。MTT检测结果显示:鱼藤酮组雄性细胞存活率为66%,雌性细胞存活率为75%,差异有统计学意义(P<0.05);雌激素+鱼藤酮组雄性细胞存活率为81%,雌性细胞存活率为86%,高于相同性别的鱼藤酮组(P<0.05)。W estern b lotting检测结果显示:鱼藤酮组雄性细胞的TH蛋白水平较雌性细胞明显下降(P<0.05);雌激素+鱼藤酮组TH蛋白水平高于相同性别的鱼藤酮组(P<0.05)。结论 VM多巴胺能神经元对氧化应激反应存在性别差异,雄性细胞对鱼藤酮的刺激较雌性...     

半胱氨酰白三烯受体1参与鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的调节

目的:观察半胱氨酰白三烯受体1(CysLT1受体)与鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的关系.方法:鱼藤酮及CysLT1受体拮抗剂孟鲁司特处理PC12细胞后,以MTT方法检测PC12细胞活性变化;以Western blotting检测鱼藤酮处理前后,PC12细胞CysLT1受体的表达变化;不同浓度鱼藤酮处理24 h及3μmol/L鱼藤酮处理不同时间,以免疫细胞化学方法观察CysLT1受体分布变化.结果:鱼藤酮(0.3 ～30 μmol/L)可诱导PC12细胞损伤,孟鲁司特(1、5μmol/L)可显著减轻鱼藤酮诱导的细胞损伤.1～ 10 μnol/L鱼藤酮作用PC12细胞24 h及3μmol/L鱼藤酮处理3h和24 h,均可诱导CysLT1受体蛋白水平表达升高.鱼藤酮能浓度和时间依赖性引起CysLT1受体从细胞核移位到细胞浆.结论:CysLT1受体参与鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤.     

Ghrelin拮抗鱼藤酮诱导的多巴胺能细胞凋亡的机制研究

【目的】 帕金森病(PD)是常见的神经退行性疾病之一,遗传和环境因素均可导致PD的发生,但90%的PD为散发性。由于病因不明,临床上的治疗多为对症治疗,且药物治疗的副作用大,因此,寻找新的预防和治疗PD的生物活性物质具有重要的临床意义。Ghrelin是1999年发现的由28个氨基酸残基组成的脑肠肽,对其研究集中在摄食和能量代谢的调控上,近年来发现Ghrelin对下丘脑神经元具有保护作用,为了探讨Ghrelin对多巴胺(DA)能神经元的作用,本实验拟在环境毒素鱼藤酮制备的PD细胞模型上,观察其对DA能细胞损伤的保护作用,并深入探讨其机制。 【方法】 本实验选用的DA能细胞是MES23.5细胞,具有DA能神经元的主要特点。实验分为三组:对照组,鱼藤酮处理组(500 nmol/L鱼藤酮孵育24 h),Ghrelin+鱼藤酮处理组(10^-9 mol/L的Ghrelin预孵育20 min后,加入500 nmol/L鱼藤酮共同孵育24 h)。应用MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测线粒体跨膜电位差和caspase-3活性,酶活性检测技术测定线粒体呼吸链复合物I的活性,蛋白质印迹法检测线粒体细胞色素C的释放,Hoechst染色观察细胞凋亡的形态学变化。 【结果】 鱼藤酮处理24 h后,细胞存活率降低39%(P<0.01)。而Ghrelin预孵育20 min,能显著拮抗鱼藤酮所致的细胞存活率的降低(P<0.01)。Ghrelin能够拮抗鱼藤酮导致的线粒体呼吸链复合物I活性的降低和跨膜电位差的降低,并进一步抑制鱼藤酮诱发的细胞色素 C由线粒体的释放。我们还观察了凋亡效应酶caspase-3活性的变化,在鱼藤酮处理组,细胞caspase-3的活性较对照组显著增加(P<0.01),而Ghrelin预孵育后,细胞caspase-3的活性较鱼藤酮组明显降低(P<0.05)。鱼藤酮孵育后,细胞出现明显的核碎裂与核固缩现象,而Ghrelin预处理后上述现象明显减轻。 【结论】 环境毒素鱼藤酮能够通过抑制DA能细胞线粒体呼吸链复合物I的活性,从而导致其功能的损伤,引起线粒体跨膜电位差的降低和细胞色素C的释放,并进一步诱发细胞的凋亡,而Ghrelin能够通过作用于线粒体呼吸链复合物I,从而恢复线粒体功能,抑制细胞凋亡,发挥其保护作用,但其细胞内的信号转导过程尚需进一步探讨。     

基于内质网应激探讨番茄红素对帕金森病细胞模型的预防效果

目的：研究番茄红素对帕金森病细胞模型的作用效果，探究其可能作用机制。方法：采用0.5μmol/L的鱼藤酮作用SH-SY5Y细胞24 h建立帕金森病细胞模型。将实验随机分组为对照组、番茄红素组、鱼藤酮组、不同浓度（低、中、高）番茄红素预处理组。采用CCK-8法检测细胞活力，显微观察法观察细胞形态，Hoechst染色观察细胞凋亡情况，Western blot法、细胞免疫荧光法检测内质网应激标志物GRP78、CHOP的表达分布。结果：与对照组比较，鱼藤酮组细胞活力明显下降，细胞凋亡信号明显；与鱼藤酮组比较，番茄红素预处理组的细胞活力均有提高，差异均具有统计学意义（P<0.05）；细胞凋亡信号减弱。鱼藤酮组GRP78和CHOP的表达较对照组明显增多（P<0.01），而高浓度番茄红素预处理组两者的表达量均低于鱼藤酮组（P<0.05）。结论：番茄红素预处理对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞有明显保护作用，此作用可能与番茄红素预处理可有效缓解鱼藤酮损伤的细胞发生内质网应激有关。     

姜黄素通过抗氧化作用拮抗鱼藤酮致PC12细胞损伤的研究

目的 探讨姜黄素(Cur)对鱼藤酮(Ro)致PC12细胞损伤的保护作用及其机制.方法 用鱼藤酮建立PC12细胞损伤模型;用四氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖活力;苏木精-伊红染色观察细胞形态学变化;比色法检测细胞内总超氧化物歧化酶(SOD)的活性;DCFH-DA染色检测细胞内活性氧类物质(ROS)水平;流式细胞术(Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法)检测PC12细胞的凋亡.结果 0.5 μmol/L姜黄素和1.0 μmol/L姜黄素均可减轻0.1 μmol/L鱼藤酮对PC12 细胞增殖活力的抑制,与鱼藤酮组比较差异有统计学意义(P＜0.01);明显减轻了细胞损伤的形态学改变;明显增加了 PC12 细胞内SOD的活性,与鱼藤酮组比较差异有统计学意义(P＜0.05);明显降低了PC12细胞内ROS的含量,明显抑制了鱼藤酮对PC12 细胞凋亡的诱导作用,与鱼藤酮组比较差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 姜黄素可拮抗鱼藤酮致PC12细胞的损伤,其机制可能与清除细胞内ROS,诱导抗氧化酶的活性有关.     

鱼藤酮对PC12细胞Caspase-3, Fas和Fasl的作用及与凋亡的关系

目的: 探讨鱼藤酮对PC12细胞Caspase-3, Fas和Fasl的作用及与凋亡的关系. 方法: 应用流式细胞仪(flow cytometry, FCM)检测不同浓度鱼藤酮对体外培养大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞株凋亡率的影响,并检测1.0 μmol/L鱼藤酮干预不同时段对Caspase-3、Fas/Fasl蛋白表达的影响,透射电镜观察凋亡形态学的改变. 结果: 对照组凋亡率为0.0199±0.0020,经0.1, 1.0, 2.0和3.0 μmol/L不同浓度鱼藤酮干预2 d,凋亡率明显增加其变换值分别为: 0.0305±0.0030, 0.0486±0.0073, 0.0313±0.0041和0.0285±0.0031,与对照组比较有显著差别(P<0.02),实验组中以1.0 μmol/L作用最显著(P<0.01),当鱼藤酮浓度大于1.0 μmol/L时,其作用呈剂量依赖性递减. 对照组Caspase-3, Fas和Fasl FI值分别为1.0±0.03, 1.0±0.02和1.0±0.04;经鱼藤酮干预3, 6, 12, 24和48 h,各组均有Caspase-3, Fas和Fasl表达,其中以鱼藤酮干预6 h时Fas/ Fasl表达最明显(P<0.01),而12 h 时Caspase-3表达最明显(P<0.01). 电镜下观察到细胞膜不光滑,细胞突起减少,核质比小,细胞质空间增大,核周隙增大、不规则,异染色质增多、边集. 结论: 鱼藤酮可通过激活Caspase-3, Fas/ Fasl凋亡途径损伤PC12细胞.     

齐留通减轻小鼠小胶质细胞介导的鱼藤酮对PC12细胞的毒性作用

目的：观察5 脂氧酶选择性抑制剂齐留通对小胶质细胞介导的鱼藤酮神经毒性的影响。方法：以鱼藤酮预处理的小鼠小胶质BV2细胞条件培养液培养PC12细胞,通过MTT法和乳酸脱氢酶（LDH）释放分析PC12细胞损伤和活性变化,Hoechst/碘化丙啶荧光双染检测PC12细胞死亡,并评估齐留通对小胶质细胞介导细胞毒性的作用。结果：1、3、10 nmol/L鱼藤酮对PC12细胞无直接毒性,但是其预处理的BV2细胞条件培养液间接诱导PC12细胞形态改变、活性下降,LDH释放和细胞死亡明显增加;001、1 μmol/L齐留通能有效减轻小胶质细胞介导的鱼藤酮细胞毒性作用。结论：5 脂氧酶抑制剂齐留通能减轻小胶质细胞介导的鱼藤酮神经毒性,提示5 脂氧酶通路在小胶质细胞炎症诱导的神经细胞死亡中有重要作用。     

利血平对转染VMAT2基因的CHO细胞抵抗鱼藤酮及多巴胺毒性作用的研究

目的研究单胺囊泡转运蛋白 2（VMAT2）抑制剂利血平（RE）作用于转染VMAT2基因的中国仓鼠卵巢细胞（VMAT2 CHO）时,VMAT2 CHO对鱼藤酮（Rotenone）、多巴胺（DA）的毒性抵抗作用。方法采用MTT比色法检测RE与不同浓度Rotenone及DA共同作用下的VMAT2 CHO细胞存活率;采用流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）水平。结果Rotenone对VMAT2 CHO细胞有毒性作用,随浓度增大,细胞存活率下降;Rotenone和DA对细胞有协同毒性作用。随DA浓度增大,VMAT2 CHO细胞产生的ROS增加;VMAT2抑制剂利血平增加DA的毒性,使同样浓度的DA诱发VMAT2 CHO细胞产生的ROS增加,存活率下降。结论RE使VMAT2功能抑制时DA在胞浆内聚集,触发DA内源性毒性,通过氧化应激系统而发挥毒性作用。DA内源性毒性可协同环境毒物Rotenone增加对细胞的毒性作用。     

不同剂量鱼藤酮对拟帕金森病模型大鼠行为学及纹状体多巴胺

目的 观察不同剂量鱼藤酮皮下注射对大鼠行为学及脑纹状体多巴胺含量的影响,探讨鱼藤酮拟帕金森病大鼠模型的适宜造模条件.方法 Lewis大鼠分别给予鱼藤酮不同剂量(1.0、1.5和2.0 mg/kg/d)皮下注射共28 d.应用旷场实验和斜板实验分别测定大鼠的运动功能和协调性,高效液相色谱-电化学法检测大鼠纹状体内多巴胺含量.结果 模型组大鼠存活率随鱼藤酮注射剂量的升高呈逐渐下降趋势.鱼藤酮2.0 mg/kg组大鼠体重最先明显降低,随着注射时间的延长,各模型组大鼠均出现显著的体重降低.旷场实验结果显示,各剂量鱼藤酮组大鼠跨格次数和站立次数均明显下降.斜板实验结果显示,鱼藤酮1.5 mg/kg组大鼠在斜板的停留角度较对照组显著减小.鱼藤酮1.5 mg/kg组大鼠脑纹状体内多巴胺含量显著降低.结论 鱼藤酮1.5 mg/kg皮下注射28 d,大鼠出现明显的运动功能障碍和脑内多巴胺含量减少,而死亡率相对较低,因此是建立帕金森病大鼠模型的适宜剂量.     

重复注射鱼藤酮对中枢多巴胺神经元的毒性作用

目的 研究小剂量鱼藤酮长期暴露对大鼠和小鼠中枢多巴胺能神经元的损伤特点。方法 昆明小鼠和Wistar大鼠每日腹腔注射鱼藤酮(Rotenone)，连续40d。用小鼠攀爬笼检测阿扑吗啡(AFO)诱导的定型行为，以HPLC法检测血浆和脑组织鱼藤酮浓度以及脑皮层和纹状体多巴胺(DA)、二羟基苯乙酸(DOPAC)含量。结果 注射鱼藤酮20d，大鼠脑皮层和纹状体鱼藤酮明显蓄积，APO诱导的小鼠攀爬行为显著下降，纹状体DA和DOPAC含量也显著降低。鱼藤酮暴露20d和40d，纹状体DA和DOPAC含量均显著下降，且有明显的量效和时效关系。结论 重复注射鱼藤酮显著降低动物中枢多巴胺神经递质的含量并导致DA神经行为的异常。     

鱼藤酮和MPTP慢性帕金森病小鼠黑质共同差异蛋白研究

目的 通过比较鱼藤酮和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)两种慢性帕金森病(Parkinson's disease,PD)模型小鼠与对照组小鼠黑质蛋白表达谱,找出两种PD模型小鼠共同的差异蛋白,探索筛选出PD的...     

鱼藤酮纳米脂质载体及其修饰物在大鼠体内的分布

［摘要］目的: 探讨聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修饰后的鱼藤酮纳米脂质载体(rotenone loaded nanostructured lipid carriers, R NLC)在大鼠体内的分布。方法: 取SD大鼠123只,其中21只随机分为3组,每组7只,分别皮下注射鱼藤酮溶液、R NLC、PEG修饰的鱼藤酮纳米脂质载体(PEG R NLC),在不同时间点取尾静脉血;其余102只SD大鼠随机分为17组,5组皮下注射鱼藤酮溶液,12组分别皮下注射R NLC(6组)和PEG R NLC(6组),在不同时间点取各种组织;采用HPLC法检测血浆和组织样品中鱼藤酮的含量,观察并比较大鼠体内的分布。 结果： 鱼藤酮溶液在血液中达峰时间(Tmax)为4 h,在各组织分布的曲线下面积(AUC)由高到低依次为肾、肝、脑、脾、心、肺。R NLC和PEG R NLC在血液中的Tmax为8 h,AUC分别为鱼藤酮溶液35.99、42.03倍;R NLC在各组织分布的AUC由高到低分别为脑、肝脏、肾、心、脾、肺;与R NLC相比,PEG R NLC在脑组织(黑质、纹状体)中的分布明显升高,在外周组织中的分布均减少。结论： PEG R NLC能增加鱼藤酮在纹状体和黑质中的分布,进一步增强了R NLC的脑靶向效应。     

多巴胺对鱼藤酮诱导α-突触核蛋白聚集的促进作用

目的:探讨多巴胺能细胞内多巴胺在鱼藤酮诱导α-突触核蛋白聚集过程中的作用。方法:采用鱼藤酮(1μmol/L)处理PC12细胞,流式细胞术检测双氢罗丹明123荧光强度;Western印迹法检测胞质内α-突触核蛋白表达;免疫荧光法观察α-突触核蛋白聚集体。并采用多巴胺耗竭剂——利血平预处理3h,观察上述指标。结果:鱼藤酮处理24h后,PC12细胞内过氧化物水平显著升高,而利血平(1μmol/L和5μmol/L)预处理后,细胞内过氧化物水平较鱼藤酮组显著下降(P<0.05)。鱼藤酮处理后,α-突触核蛋白表达水平显著升高,胞质内可见α-突触核蛋白免疫阳性的聚集体形成;采用利血平预处理后,α-突触核蛋白表达水平较鱼藤酮组显著下降(P<0.05),α-突触核蛋白聚集体面积减小。结论:在鱼藤酮作用过程中,多巴胺可促进α-突触核蛋白表达上调及其聚集体的形成。     

鱼藤酮对大鼠尾核及血浆中NOS活性和NO含量的影响

目的 研究鱼藤酮慢性中毒大鼠尾核脑区及血浆的一氧化氮（NO）含量和一氧化氮合成酶（NOS）活性的变化规律。方法 Wistar大鼠每日皮下注射0.335、0.670、1.005mg/kg鱼藤酮共90d。于30、60、90d处死动物，分离血浆和尾核脑组织，以生化方法测定NOS活性和NO含量。结果 在鱼藤酮中毒规律脑组织中NOS活性和NO含量增加，增加程度因中毒剂量的提高而升高、随中毒时间的延长而升高。结论 长期接触鱼藤酮导致血浆和尾核脑组织NOS活性和NO含量升高。