申克孢子丝菌翻译控制肿瘤蛋白的结构分析与功能预测

【目的】从cDNA文库中识别申克孢子丝菌翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)的基因并分析预测其结构功能和应用前景.【方法】 利用NCBI和ExPASy网站中的各种基因和蛋白的序列结构信息分析工具,结合DNAstar和VectorNTI suite生物信息学分析软件包,从申克孢子丝菌全长cDNA质粒文库中识别TCTP的基因及其编码区,分析、预测该基因编码的蛋白结构特征和功能.【结果】 TCTP基因全长621 bp,编码区具有207个氨基酸,在GenBank同源序列中,其与蓝菌属真菌(Grosmannia clavigera) TCTP氨基酸序列一致性达到78%,理论预测分子质量为64581.4 ku,无质体和线粒体定位序列,预测结果显示编码蛋白含有1个跨膜区,7个亲水性部位和5个主要B细胞表位?与蓝菌属真菌及球毛壳霉(C.globosum)的TCTP进化关系最近.【结论】 应用生物信息方法筛选出申克孢子丝菌TCTP的cDNA全长序列并预测其结构与功能?潜在抗原表位,为进一步实验研究该蛋白生物学特性提供了依据.     

饰胶蛋白（Decorin）基因的cDNA克隆与表达

目的 通过基因克隆技术获得饰胶蛋白基因ｃＤＮＡ克隆并表达。为研究饰胶蛋白的生物学功能及应用打基础。方法 应用ＰＣＲ技术从Ｔ细胞ｃＤＮＡ文库获得饰胶蛋白全长基因ｃＤＮＡ片段。并克隆到ｐＵＣ１９载体中,采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧末端终止法测定全部ｃＤＮＡ序列,将测序正确的饰胶蛋白ｃＤＮＡ序列插入ｐＧＥＸ－４Ｔ－１表达载体中,经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后１．２％凝胶电泳鉴定,ＩＰＴＧ诱导表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。结果 克隆的饰胶蛋白ｃＤＮＡ序列与ＧｅｎＢａｎｋ中ＡＦ１３８３００记载的序列完全一致,所表达的融合蛋白质分子量与理论计算值（６５．６ＫＤ）也一致并为可溶性蛋白。结论 本研究成功地克隆了饰胶蛋白基因和表达了ＧＳＴ－Ｄｅｃｏｒｉｎ融合蛋白。     

带有蛋白标签的原核表达载体构建

目的：构建带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标签的ｐＴＣ０１Ｅ载体。方法：从噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ中ＰＣＲ扩增出于Ｅ－ｔａｇ基因片段，经Ｋｌｅｎｏｗ片段补平和ＳａｃＩ消化后，将含有Ｅ－ｔａｇ序列的３８１ｂｐ片段克隆至分泌型原核表达载体ｐＴＣ０１的ＳａｃＩ－ＳａｍＩ位点中。结果：构建成带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标准签的ｐＴＣ０１Ｅ载体，限制性内切酶图谱和ＤＮＡ序列分析表明构建过程正确，结论：用ＰＣＲ－克隆策略获得了Ｄ     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

人骨形成蛋白-3成熟肽cDNA的克隆、测序及表达

目的：扩增、克隆人骨形成蛋白－３（ｈＢＭＰ－３）成熟肽ｃＤＮＡ基因，利用大肠杆菌表达ｈＢＭＰ－３成熟肽．方法：ＰＣＲ方法扩增ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，双脱氧终止法测序正确后，克隆入大肠杆菌表达载体ｐＤＨ，受控于ＰＲＰＬ启动子，重组质粒ｐＤＨＢ－３ｍ以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌在４２℃进行温度诱导．结果：扩增出ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，序列测定完全正确；含重组质粒ｐＤＨ－Ｂ３ｍ的工程菌诱导后在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新生蛋白带，分子质量为１４．５ｋｕ，与预期ｈＢＭＰ－３成熟肽分子量大小一致，约占菌体总蛋白的２８％．结论：成功扩增、克隆ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，并可在大肠杆菌中得到高效表达     

人白细胞介素—6基因的克隆表达和纯化的研究

目的：研究人ＩＬ－６基因在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的纯化。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆了人ＩＬ－６ ｃＤＮＡ，用ｐＢＶ２２０载体对ＩＬ－６基因进行了表达调控研究，用阴离子交换柱和凝胶柱对表达产物进行纯化，用ＭＴＴ法测定ｒｈＩＬ－６的活性。结果：表达调控研究发现，当ＳＤ序列到ＡＴＧ之间的距离为６ｂｐ和１０ｂｐ时在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶上未见明显表达，而当距离为５ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、８ｂｐ时均有     

产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因克隆及表达

目的 研究克隆并表达产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素Ｂ亚单位。方法 合成２条引物用ＰＣＲ法扩增包括产毒性大肠杆功不耐热肠毒素（ＥＴＥＣ，ＬＴ）Ｂ亚单位基因编码区及起始密码子上游７９３ｂｐ的ＤＮＡ片段，ＰＣＲ产物克主ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫ＾（一）并转化进入ＸＬ－Ｂｌｕｅ工程菌中。结果 经ＥＬＩＳＡ，Ｗｅｓｔｒｎｋ－ｂｌｏｔ测定共获得２２株菌表达ＬＴ－Ｂ表达水平比Ｈ１０４０７高２～３倍。克隆的基因经测序     

T—载体在聚合酶链反应扩增产物克隆中的应用

目的 探讨克隆聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增产物的简便方法。方法 用ＰＣＲ方法分别特异性扩增Ｗｉｌｍｓ瘤基因ｗｔ１和尿激酶受体（ＵＰＡＲ）基因,并利用Ｔａｐ聚合酶具有的延伸酶活性将扩增产物直接克隆入Ｔ－载体,ＥｃｏＲＩ酶切鉴定阳性重组子。结果设计的引物可分别扩增ｗｔ１基因锌指区（３４３ｂｐ）和ＵＰＡＲ基因编码区全长（１０８３ｂｐ）;未经修饰的常规ＰＣＲ和高保真ＰＣＲ扩增产物可被直接克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ     

抗人卵巢癌单克隆抗体COC183-B_2轻链可变区基因的体外扩增、克隆及序列分析

目的分离抗人卵巢癌单克隆抗体ＣＯＣ１８３－Ｂ２轻链可变区（ＶＬ）基因并测定其核苷酸序列。方法用ＰＣＲ方法体外扩增单抗ＣＯＣ１８３－Ｂ２ＶＬ基因，将其克隆入ＰＵＣ１９载体，重组子用Ｓａｎｇｅｒ’ｓ双脱氧链终止法测定其核苷酸序列，将其序列通过Ｉｎｔｅｒｎｅｔ与ＧｅｎｅＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ和ＰＤＢ已发表的抗体序列进行比较分析。结果ＶＬ基因全长３３６ｂｐ，属小鼠免疫球蛋白轻链第Ⅱ亚类（ＳｕｂｇｒｏｕｐⅡ），由种系基因的ＶＫ及Ｊ基因的ＭＵＳＪＫ２重排而成。该ＶＬ基因序列已被ＧｅｎｅＢａｎｋ收录（ａｃｅｓｉｏｎＮｏ．ｇｂＡＦ０４４０７７）。结论该ＶＬ基因为抗人卵巢癌单抗ＣＯＣ１８３－Ｂ２功能性轻链可变区基因。     

强化表达分泌型酵母载体YEp5101和YEp5102的构建

采用ＰＣＲ二段扩增法，从酵母基因组中获取６３５ｂｐ完整的ＭＦα（α─ｍａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）基因及１８０ｂｐ的ＵＡＳＰＧＫ（３─磷酸甘油酸激酶基因的上游激活序列）ＤＮＡ片段。首先，将４３０ｂｐ的ＭＦα基因启动子和信号序列与１８０ｂｐＵＡＳｐＧＫ片段分别克隆到ＰＵＣ１８载体上；然后，从含有ＭＦα基因启动子和信号序列的阳性重组子ｐＭＦα１与含有ＵＡＳＰＧＫ阳性重组子ｐＵＡＳ８质粒中，分别获得ＭＦα基因启动子和信号序列及ＵＡＳＰＧＫ片段，构建成含ＭＦα基因启动子和信号序列的表达分泌型载体ＹＥｐ５１０１及含ＭＦα启动子和信号序列与ＵＡＳＰＧＫ的强化表达分泌型载体ＹＥｐ５１０２。这两种载体可用于外源基因表达的比较研究，探讨ＵＡＳ对外源基因表达的调控作用。     

Tropic 1808基因在大肠杆菌中的表达

目的;在大肠杆菌宿主系统中表达Ｔｒｏｐｉｃ１８０８基因编码的蛋白。方法：用ＰＣＲ方法从质粒中扩增出Ｔｒｏｐｉｃ１８０８ｃＤＮＡ开放阅读框架片段,并重组人表达载体ｐＥＴ－２１ａ中,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,用ＩＰＴＧ诱导Ｔｒｏｐｉｃ１８０８融合蛋白的表达,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,表达蛋白条带转至ＰＶＤＦ膜进行氨基酸序列分析,结果：构建了ｐＥＴ－２１ａ－１８０８重组质粒,外源性Ｔｒｏｐｉｃ１８０８基     

国人 ICA69 基因 cDNA 的克隆及序列分析

目的：克隆国人胰岛细胞自身抗原６９ｋＤ蛋白基因（ｈｉＩＣＡ６９）并经序列分析予以确证。方法：采用聚合酶链式反应技术,从中国人胰岛细胞瘤ｃＤＮＡ文库中扩增出ｈｉＩＣＡ６９编码序列ｃＤＮＡ,将基因片段插入ｐＳＰＯＲＴ１质粒,进一步亚克隆到ｐＵＣ１８载体中,经蓝白斑和限帛性酶谱分析得以初步筛选后,双脱氧末端终止法对其全部核苷酸序列予以确定。结果：证实了ｈｉＩＣＡ６９基因全长为１４４９ｂｐ、编码４８３个氨     

猴免疫缺陷病毒SIV核心蛋白基因在大肠杆菌中表达的研究

应用多聚酶链反应（ＰＣＲ），直接从ＳＩＶ感染的猴艾滋病（ＳＡＩＤＳ）模型猴的外周血淋巴细胞总ＤＮＡ中扩增出７６７ｂｐ的ＳＩＶ核心蛋白Ｐ２７基因片段。扩增产物经ＥｃｏＲＩ及ＳａｌＩ双酶切后，克隆入相同酶切的表达质粒ｐＢＶ２２０中，获得含ＳＩＶ核心蛋白基因片段的重组质粒ｐＢＶＳＧ，并进行ＤＮＡ序列分析。用该重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａ经筛选、增殖及４２℃温度诱导，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明外源基因表达蛋白含量占菌体总蛋白１４．５％，Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实表达产物能被ＳＩＶＰ２７单克隆抗体及ＳＡＩＤＳ模型猴血清中特异性抗体识别。     

产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因克隆及表达

目的研究克隆并表达产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素Ｂ亚单位。方法合成２条引物用ＰＣＲ法扩增包括产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素（ＥＴＥＣ，ＬＴ）Ｂ亚单位基因编码区及起始密码子上游７９３ｂｐ的ＤＮＡ片段。ＰＣＲ产物克隆入ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫ（－）并转化进入ＸＬ－Ｂｌｕｅ工程菌中。结果经ＥＬＩＳＡ，Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ测定共获得２２株菌表达ＬＴ－Ｂ，表达水平比Ｈ１０４０７高２～３倍。克隆的基因经测序证实有一个碱基置换，但无氨基酸序列改变。结论本工作成功表达了产毒性大肠杆菌不耐热肠毒素Ｂ亚单位。     

人分泌型肿瘤坏死因子相关激活诱导因子基因的克隆及测序

目的 克隆人分泌型肿瘤坏殛因子相关激活诱导因子（ｓＴＲＡＮＣＥ）的编码区ｃＤＮＡ片段。方法 从人淋巴结组织提取总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增人ｓＴＲＡＮＣＥ基因编码区序列,将其克隆至ｐＭＤ１８－Ｔ载体中,并行序列测定。结果 克隆获得的７４４ｂｐ片段与文献报道的人ｓＴＲＡＮＣＥ基因编码区ｃＤＮＡ序列一致。结论 本研究为进一步研究ｓＴＲＡＮＣＥ的生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性打下了基础。     

弓形虫主要表面抗原基因克隆的初步研究

根据已发表的弓形虫主要表面抗原Ｐ３０基因序列，自行设计合成一对寡核苷酸引物。利用ＰＣＲ技术获取Ｐ３０抗原基因整个开放阅读框架的碱基序列。ＰＣＲ产物经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后，与经同样两种内切酶切割的质粒载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ连接构成 且质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ－Ｐ３０，转化大肠杆菌ＤＨ５α。通过遗传标记筛选，ＰＣＲ扩增及酶切分析对重组子进行了初步的鉴定。构建了弓形虫主要表面原Ｐ     

抗人卵巢癌单克隆抗体COC183-B2重链可变区基因的体外扩增、克隆及序列分析

目的：分离抗人卵巢癌单克隆抗体ＣＯＣ１８３Ｂ２重链可变区（ＶＨ）基因并测定其序列。方法：用反转录ＰＣＲ扩增抗人卵巢癌单抗ＣＯＣ１８３Ｂ２ＶＨ基因，将其克隆入ＰＵＣ１９载体，重组子用Ｓａｎｇｅｒ’ｓ双脱氧链终止法测定序列，将序列与ＧｅｎｅＢａｎｋ及已发表的抗体序列比较。结果：ＶＨ基因全长３５４ｂｐ，属鼠免疫球蛋白重链混杂亚类（ｓｕｂｇｒｏｕｐｍｉｓｃｅｌａｎｅｏｕｓ），由种系基因的ＶＨ，Ｄｓｐ２．５及ＭＵＳＪＨ４重排而来。该ＶＨ基因序列已被ＧｅｎｅＢａｎｋ收录（ａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏＡＦ０４５０２３）。结论：该ＶＨ基因为抗人卵巢癌单抗ＣＯＣ１８３Ｂ２功能性重链可变区基因。     

赖型钩体内鞭毛基因的扩增,克隆,核苷酸序列测定及其在大肠杆…

根据钩体内鞭毛蛋白ｆｌａＢ基因核苷酸序列自行设计一对引物，以赖型钩体ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ扩增到约８４０ｂｐ的片段。扩增片段经酶切（Ｂａｍ ＨＩ、Ｐｓｔ Ｉ）定向克隆入ｐＵＣ８。重组质粒ｐＬＦ１插入片段与哈勒焦型钩体ｆｌａβ基因相比，核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性很高。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明有一约３３ｋｄ的特异蛋白带，表达量占菌体蛋白１１％。免疫印迹试验表明此区带能被抗赖型钩体内鞭毛（轴丝）抗血     

人GDNF基因的克隆

目的：克隆可表达人胶质细胞源性神经营养因子的基因。方法：从脑胶质细胞瘤患者术后的脑瘤组织中提取总ＲＮＡ，以ＲＴＰＣＲ方法扩增出了一段约５５８ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，将这一片段克隆于ｐＵＣ１８载体中，进行全序列分析。结果：证实该研究所克隆的ｃＤＮＡ是编码正确的人ＧＤＮＦ基因。与发表于ＧｅｎｅＢａｎｋ上的序列相比，发现该研究克隆的基因有一段７８ｂｐ的核苷酸序列缺失，但不影响密码子的阅读框。结论：克隆到了编码正确的人ＧＤＮＦ的ｃＤＮＡ全序列，对帕金森病基因治疗的基础研究及临床应用具有重要意义。     

HCV定量RT—PCR竞争性参比标准的构建

将克隆的ＨＣＶ５‘ＮＣＲ序列反向插入ｐＳＰ７２的Ｅｃｏ ＲＶ切点，构建一种能转录ＨＣＶ－ＲＮＡ的质粒ｐＳｎｃ－２。以ＲＴ－ＰＣＲ从抗ＨＥＶ ＩｇＭ阳性病人血浆中扩增一段２３８ｂｐ的ＨＣＶ－ｃＤＮＡ反向插入ｐＳｎｃ－２中克隆的５’ＮＣＲ序列的ＮｃｏＩ切点，构建插入突变型ＨＣＶ－ｃＤＮＡ重组体ｐＳｎｃ－ｅ。