HCV 定量 RT-PCR 竞争性参比标准的构建

将克隆的ＨＣＶ５’ＮＣＲ序列反向插入ｐＳＰ７２的ＥｃｏＲＶ切点，构建一种能转录ＨＣＶ－ＲＮＡ的质粒ｐＳｎｃ－２。以ＲＴ－ＰＣＲ从抗ＨＥＶＩｇＭ阳性病人血浆中扩增一段２３８ｂｐ的ＨＣＶ－ｃＤＮＡ，反向插入ｐＳｎｃ－２中克隆的５’ＮＣＲ序列的ＮｃｏⅠ切点，构建插入突变型ＨＣＶ－ｃＤＮＡ重组体ｐＳｎｃ－ｅ。应用限制性酶切和ＰＣＲ对这两种重组质粒进行了鉴定，为ＨＣＶ－ＲＮＡ的定量ＰＣＲ提供有用的内参照模板。     

HCV5’－NCR序列克隆和转录重组质粒构建

选取ＩＶ基因型ＨＣＶ及中国和台湾代表株ＨＣＶ的５’ＮＣＲ区保守序列合成引物，以ＲＴ－ＰＣＲ从输血后非甲非乙型肝炎病人血浆中扩增一段３００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段作目的基因，钝端插入ｐＵＣ１９的ＳｍａＩ切点，构建了ｐＵＨＣＶ－ＮＣ重组质粒。对ｐＵＨＣＶ－ＮＣ分别或混合应用ＨＣＶ序列特异的内外引物和载体序列特异的通用引物进行ＰＣＲ扩增，所用产物分子量均同预期相符；酶切分析查出ＨＣＶ基因所带有和克隆位点融合所产生的两个外源ＮｃｏＩ切点也存在；证实ｐＵＨＣＶ－ＮＣ中克隆基因是ＨＣＶ的５’ＮＣＲ序列且插入方向为反向。应用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双切出克隆ＨＣＶ基因，粘端插入ｐＳＰ７２的多克隆位点，均建了ｐＳＨＣＶ－ＮＣ转录重组体，对之进行了ＰＣＲ和酶切鉴定。     

HCV 5‘—NCR序列克隆和转录重组质粒构建

选取ＩＶ基因型ＨＣＶ及中国和台湾代表株ＨＣＶ的５’ＮＣＲ区保守序列合成引物，以ＲＴ－ＰＣＲ从输血后非甲非乙型肝炎病人血浆中扩增一段３００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段作目的基因，钝端插入ｐＵＣ１９的Ｓｍａ１切点，构建了ｐＵＨＣＶ－ＮＣ重组质粒。对ｐＵＨＣＶ－ＮＣ分别或混合应用ＨＣＶ序列特异的内外引物和载体序列特异的通用引物进行ＰＣＲ扩增，所得产物分子阳均同预期相符；酶切分析查出ＨＣＶ基因所带和克隆位点融合所产     

Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒E2／N21基因的克隆与序列分析

目的 构建插入Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的真核表达载体,分析该基因片段的核苷酸一级结构。方法 利用逆转 录套式ＰＣＲ扩增Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２／ＮＳ１基因片段,通过定向克隆将其克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,采用双脱氧链终止法测定其核苷酸序列。结果 构建出含有Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的克隆,该区基因片段的核苷酸一级结构和Ⅲ型日本株ＨＣＶ（ＨＣ－Ｊ６     

重组丙型肝炎病毒基因载体的构建与表达

应用基因重组技术。从载体ＣＤＺ２酶切获得１．７３ｋｂＤＮＡ片段（含１６ｄ９３ｂｐ的ＨＣＶ结构区ｃＤＮＡ，其特异性已为ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实）。将ＨＣＶｃＵＮＡ片段插入载体ｐｃＤＮＡ３，构建ＨＣＶ重组体。经在大肠杆菌中表达，筛选、酶切分析，获得重组ＨＣＶ（ＰｃＤＮＡ３－ＨＣＶ）。以重组质粒转染Ｈ９细胞（ＣＤ淋巴细胞系），用Ｇ４１８筛选出抗性细胞。经ＲＴ－ＰＣＲ、ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ验证表明，ｐｃＤＮＡ３－ＨＣＶ能在Ｈ９细胞中进行复制、转录和表达。这为丙型肝炎发病机理的研究提供了一个有用模型。     

HCVC基因部分序列的克隆测序

选取５株ＨＣＶ共有序列合成一时５’端加端引物。上游加端为ＥｃｏＲⅠ切点，下游加端为ＢａｍＨＩ切点。以ＲＴ－ＰＣＲ扩增一长为５７８ｂｐ的ｃＤＮＡ作目的基因，相应酶切后，反向插入ＰＵＣ１８的多克隆位点，构建ｐＵＨＣ－Ｃ重组体。分别或混合应用ＨＣＶ特异内外引物和ｐＵＣ特异通用引物以ＰＣＲ扩增重组体，扩增产物分子片段均同预期一致。测序表明克隆基因与ＨＣＶ－ＣＨＮ最同源，在所测ＣＥ４９７个核苷酸及由之推导的１６０个氨基酸区域内。其核苷酸与氨基酸同源性都是９７．５％。     

HCV E2／NS1基因的PCR检测克隆与序列分析

本文报道了利用ＰＣＲ技术检测了３４例丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因的ｃＤＮＡ并与５非编码区基因的ｃＤＮＡ检测技术进行了比较，应用ｐＵＣ１８质粒对此扩增片段进行了克隆与序列分析，结果表明克隆片段ＨＣＶ－Ｓ１为我国主要流行的ＨＣＶ基因亚型－ＩＩ型，其与ＨＣＶ－ＩＩ型的核苷酸与氨基酸的同源性均在９０％以上，序列分析表明该片段富含脯氨酸和胱氨酸，可能具有复杂的空间构型，且与４个糖基化位点一样保持稳定，另外，     

尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建

目的 构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ的表达质粒ｐＵＲＡＳ。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆尿激酶受体（ｕＰＡＲ）ｃＤＮＡ５’端－４６￣４５４ｂｐ一段为５００ｂｐ的顺序，利用ＤＮＡ重组技术将该片段反向插入表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游。结果 限制性内切酶分析和ＤＮＡ顺序分析证实ＲＴ－ＰＣＲ获得ｕＰＡＲ ｃＤＮＡ片段与文献报道相吻合；重组质粒ｐＵＲＡＳ转染肺癌细     

HCVE＿2／NS＿1基因的PCR检测克隆与序列分析

本文报道了利用ＰＣＲ技术检测了３４例丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因的ｃＤＮＡ并与５’非编码区基因的ｃＤＮＡ检测技术进行了比较，应用ｐＵＣ１８质粒对此扩增片段进行了克隆与序列分析，结果表明克隆片段ＨＣＶ－Ｓ１为我国主要流行的ＨＣＶ基围亚型－ＩＩ型，其与ＨＣＶ－ＩＩ型的核苷酸与氨基酸的同源性均在９０％以上，序列分析表明该片段富含脯氨酸和胱氨酸，可能具有复杂的空间构型，且与４个糖基化位点一样保持稳定，另外，在ＨＣＶ－Ｓ１片段的３’端有一３６个核苷酸的区域，其变化可能具有型特异性     

Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒E2/NS1基因的克隆与序列分析

目的构建插入Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的真核表达载体，分析该基因片段的核苷酸一级结构。方法利用逆转录套式ＰＣＲ扩增Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２／ＮＳ１基因片段，通过定向克隆将其克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上，采用双脱氧链终止法测定其核苷酸序列。结果构建出含有Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的克隆，该区基因片段的核苷酸一级结构和Ⅲ型日本株ＨＣＶ（ＨＣ－Ｊ６）的同源性为８８．３７％，Ⅱ型中国株ＨＣＶ（ＨＣ－Ｃ２）的同源性为７０．６９％，其推定的氨基酸同源性分别为８９．２９％和７５．５５％。结论基因的核苷酸一级结构在同一基因型中有较高的同源性，而不同基因型之间的同源性则相对较低。对不同基因型之间Ｅ２／ＮＳ１基因一级结构的研究将有助于ＨＣＶ疫苗的研制。     

七株急性散发性戊型肝炎病毒部分核苷酸序列分析

比较我国流行性和散发性戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）的部分核苷酸和氨基酸序列及其与戊型肝炎流行的关系。方法应用逆转录套式聚合酶链反应法（ＲＴ－ｎＰＣＲ）从急性散发性戊型肝炎病人血清中扩增ＨＥＶ开放读码框架２（ＯＲＦ２）ｃＤＮＡ，并用ＳｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒｓｉｏｎ２．０ＤＮＡ序列分析试剂盒，经双脱氧核苷酸ＤＮＡ链末端终止直接测序法测定ＲＴ－ｎＰＣＲ扩增产物的核苷酸序列。结果从深圳、长春、杭州、西安、北京５个城市４１份急性散发性戊型肝炎病人血清中获得２８株ＨＥＶＯＲＦ２ｃＤＮＡ，对其中７株进行了核苷酸序列分析，表明它们与ＨＥＶ墨西哥株（Ｍ）的同源性为７８．９％～８０．２％；与ＨＥＶ缅甸（Ｂ）流行株（Ｅｐ）的同源性为９３．１％～９５．１％；与ＨＥＶ缅甸（Ｂ）散发株（Ｓｐ）的同源性为９２．３％～９４．２％；与ＨＥＶ中国新疆流行株ＣＨ１．１同源性为９６．５％～９８．９％；７株散发性ＨＥＶ间核苷酸序列的同源性为９５．７％～１００％。结论该７株散发性ＨＥＶ与ＨＥＶ（Ｂ）和ＨＥＶＣＨ１．１核苷酸序列的同源性较高，均属同一亚型。     

带有蛋白标签的原核表达载体构建

目的：构建带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标签的ｐＴＣ０１Ｅ载体。方法：从噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ中ＰＣＲ扩增出于Ｅ－ｔａｇ基因片段，经Ｋｌｅｎｏｗ片段补平和ＳａｃＩ消化后，将含有Ｅ－ｔａｇ序列的３８１ｂｐ片段克隆至分泌型原核表达载体ｐＴＣ０１的ＳａｃＩ－ＳａｍＩ位点中。结果：构建成带有Ｅ－ｔａｇ蛋白标准签的ｐＴＣ０１Ｅ载体，限制性内切酶图谱和ＤＮＡ序列分析表明构建过程正确，结论：用ＰＣＲ－克隆策略获得了Ｄ     

庚型肝炎病毒基因组全长cDNA的拼接及克隆

目的：构建ＧＢ病毒Ｃ／庚型肝炎病毒（ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ）基因组全长ｃＤＮＡ克隆。方法：以覆盖ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ分离株ＨＧＶ－Ｉｗ全长基因组且互相重叠的５个基因片段Ｉｗ５，Ｉｗｑ２，Ｉｗｈ６，Ｉｗ３′和Ｉｗ３为起始材料，采用重叠延伸ＰＣＲ拼接和连接酶连接的方法，构建ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ基因组全长ｃＤＮＡ克隆。结果：ＧＢＶ／Ｃ／ＨＧＶ基因组全长ｃＤＮＡ克隆的酶切图谱与预期一致；核苷酸序列分析显示，克隆的     

尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建

构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ的表达质粒ｐＵＲＡＳ。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆尿激酶受体（ｕＰＡＲ）ｃＤＮＡ５’端－４６～４５４ｂｐ一段长５００ｂｐ的顺序，利用ＤＮＡ重组技术将该片段反向插入表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游。结果限制性内切酶分析和ＤＮＡ顺序分析证实ＲＴ－ＰＣＲ获得的ｕＰＡＲｃＤＮＡ片段与文献报道相吻合；重组质粒ｐＵＲＡＳ转染肺癌细胞株９５Ｄ，ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ证实转染细胞克隆有ｕＰＡＲ反义ＲＮＡ的表达。结论重组质粒ｐＵＲＡＳ能在肺癌细胞株９５Ｄ中表达尿激酶受体反义ＲＮＡ，尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ表达质粒的构建获得成功。     

含抑癌基因p16转移载体的构建

目的：为获得高表达有活性的ｐ１６蛋白,构建含ｐ１６ｃＤＮＡ的重组转移载体。方法：ＥｃｏＲＩｘｈｏＩ双酶切克隆质粒ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ－ｐ１６,低融点琼脂糖回收０．８ｋｂ的Ｐ１６ＣＤＮＡ片段,插入质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３,构建含Ｐ１６的重组载体ＰＸ３－Ｐ１６,并对重组子以菌落原位杂交和酶切电泳两种方法进行鉴定。结果：电泳证实低融点琼脂糖回收的片段为０．８ｋｂ。菌落原位杂交筛选８个阳性克隆,酶切电     

中国HCV一株NS5区部分基因克隆及序列分析

目的：研究ＨＣＶ ＮＳ５基因的结构与功能，为进一步研制适合我国使用的第３代抗－ＨＣＶ试剂打下基础。方法：自行设计引物，从河北固安县慢性丙型肝炎患者血中，用逆转录－聚合酶链反应扩增出ＨＣＶ ＮＳ５基因，并将其克隆到载体ｐＫＰＬ－３ａ，经Ｄｏｔ ｂｌｏｔ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和限制性内切酶分析筛选出阳性克隆ｐＫＨＣ－５ａ，进行序列测定。结果：核苷酸序列分析表明，克隆的ＨＣＶ ＮＳ５基因与ＨＣＶⅡ     

细胞因子对HCV基因疫苗诱生免疫反应的增强作用

目的 探讨细胞因子对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因疫苗诱生免疫应答强度的增强作用。方法 将包含ＨＣＶ－Ｃ蛋白的基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中,构建重组质料ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,将此重组质粒单独或与包含鼠ＩＬ－２或ＩＬ－１２基因的表达质粒共免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,ＥＬＩＳＡ法检测ＨＣＶ Ｃ特异性抗体产生情况,以ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ转梁小鼠ＳＰ２／０细胞,表达ＨＣＶ Ｃ抗原为靶细胞,进行     

H—2K^b cDNA的克隆及其在多种真核细胞中的表达

目的 克隆Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ及研究其在多种真核细胞中的表达。 方法 ＲＴ－ＰＣＲ法扩增Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ,克隆入双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ,ＰＡ３１７包装出重组病毒后,分别感染ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ７及ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ分析目的基因表达,ＦＡＣＳ分析Ｈ－２Ｋ＾ｂ在细胞膜上的表达。结果 以双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ介导,分别建立了Ｈ－２Ｋ＾ｂ基因转导细胞：ＮＩＨ３Ｔ     

随机多肽噬菌体展示载体pCANTAB5X的构建

构建适用于外源性随机多肽的噬菌体展示载体,方法在引物中加入ＸｂａⅠ识别序列,将用该引物扩增的ＰＣＲ产物克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ中,再将该片段插入ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ中构建成噬菌体展示载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｘ。结果限制酶切点ＸｂａＩ和ＨＧＶＣ片段被引入到新构建的噬菌粒载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｘ中。     

癌胚抗原cDNA真核表达重组质粒的构建

目的：将人特异表达的癌胚抗原（ＣＥＡ）－ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒质粒载体ｐＬＸＳＮ中,构建成真核表达重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ,为进一步表达表达人ＣＥＡ的动物肿瘤细胞模型作准备。方法：用内切酶ＥｃｏＲＩ酶切质粒ｐＬＸＳＮ及ｐ９１０２３Ｂ－ＣＥＡ－１７,得到线状载体ｐＬＸＳＮ及外源基因ＣＥＡ－ｃＤＮＡ,然后通过连接酶的连接反应将ＣＥＡ－ｃＤＮＡ插入到ｐＬＸＳＮ的ＥｃｏＲＩ位点,用ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ鉴定。结果：成功地将ＣＥＡ－ｃＤＮＡ克隆到ｐＬＸＳＮ中,通过鉴定筛选获得有意义的正向重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ。结论：利用基因克隆技术能将人ＣＥＡ－ｃＤＮＡ定向插入逆转录病毒质粒载体中,构建成真核表达重组质粒ｐＬＸＳＮ－ＣＥＡ,为进一步建立ＣＥＡ阳性动物肿瘤细胞模型及研究ＣＥＡ阳性肿瘤的免疫防治奠定了基础。