猪真皮脱细胞基质制备方法的实验研究

目的 研究猪真皮脱细胞基质的制备方法.方法 实验组使用0.125％胰蛋白酶和2.5 U/mL DispaseⅡ溶液,对照组使用PBS溶液,在4℃下,经过24 h脱去猪真皮细胞,配合0.5％SDS对脱细胞后基质振荡洗涤3 h和0.5％Triton X-100振荡洗涤24 h清除细胞碎片制备出猪真皮脱细胞基质.结果 实验组...     

改良萃取法制备脱细胞神经支架的去髓鞘效果评价

【目的】评价改良化学方法制备脱细胞神经支架的去髓鞘与脱细胞效果。【方法】12只成年SD大鼠(230～280g),取双侧坐骨神经,随机分为3组,每组8例,分别采用不同的处理方法。正常对照组:不作任何处理;Hudson组:采用Triton X-200、磺基三甲铵乙内酯-10(SB-10)、磺基三甲铵乙内酯-16(SB-16)处理;改良组:采用Triton X-200、SB-10、SB-16联合脱氧胆酸钠(SDC)及过氧乙酸(PAA)处理。处理后行HE染色、甲苯胺蓝染色及透射电镜检查,观察脱细胞、去髓鞘程度及基底膜保存情况。【结果】形态学检查显示,与对照组相比,Hudson组中的细胞核结构完全消失,甲苯胺蓝染色为散在同心圆状的髓鞘结构,透射电镜下显示髓鞘板层成分保留,但有崩解断裂,轴突依然存在;改良组细胞核完全去除,与Hudson组不同的是,甲苯胺蓝染色显示为不规则多孔状结构,髓鞘成分消失,透射电镜下显示髓鞘及轴突成分彻底去除,基底膜管壁结构清晰并完整保留。【结论】改良萃取法制备脱细胞神经支架能够有效地去除细胞和髓鞘成分,同时基底膜管结构保留完整。     

脱细胞血管基质的制备方法研究

目的:通过不同脱细胞方法制备脱细胞血管基质材料,比较筛选出较为理想的血管脱细胞方法,为临床血管修复提供良好的组织工程生物材料。方法:1采用不同浓度的胰蛋白酶、Triton X-100、SDS组合,对牛血管进行脱细胞处理,制备脱细胞牛血管基质。2苏木素-伊红染色,观察细胞核残留情况,以比较脱细胞效果。3利用微量样品基因组DNA提取试剂盒提取脱细胞血管基质的DNA,超微量蛋白核酸分析仪检测DNA含量。结果:大体观察:各组血管经过不同脱细胞方法处理后,所得脱细胞血管基质呈乳白色。苏木素-伊红染色观察:光镜下观察,可见各组均有不同程度的细胞核残留,其中1%胰蛋白酶+3%Triton X-100+1%SDS组和0.1%胰蛋白酶Triton X-100+0.5%SDS所制备的脱细胞血管基质细胞核残余最少,每高倍视野中细胞核残留不大于3。DNA提取检测:所提取DNA的含量显示,0.1%胰蛋白酶+3%Triton X-100+1%SDS和0.1%胰蛋白酶+3%Triton X-100+0.5%SDS的脱细胞效果较好,DNA残留量分别为0.22μg/mg和0.231μg/mg。结论:应用0.1%胰蛋白酶+3%Triton X-100+1%SDS和0.1%胰蛋白酶+3%Triton X-100+0.5%SDS的方法来制备脱细胞基质的效果较好。     

Triton X-100法制备牛颈静脉脱细胞血管支架

 【目的】 研究经Triton X-100 脱细胞处理的牛颈静脉的组织结构和生物力学特性以及作为组织工程血管支架的可能性?【方法】 获取10条新鲜带瓣牛颈静脉,随机分为两组,新鲜对照组(n = 5)和脱细胞实验组(n = 5),脱细胞组血管使用2.5 mL/L Triton X-100等进行脱细胞处理48 h, 病理切片染色和扫描电镜观察血管壁和瓣膜自身细胞的脱除情况和细胞外基质变化情况;生物力学性能检测血管组织强度变化;体外人内皮种子细胞种植以了解脱细胞支架的生物相容性?【结果】 脱细胞处理后,管壁和瓣膜的自身细胞完全脱除而弹力纤维和胶原纤维无明显改变;与新鲜牛颈静脉相比,脱细胞血管的拉伸强度[(16.5 ± 2.61)MPa vs (15.5 ± 3.1)MPa; P > 0.05]和最大持线力[(7.9 ± 0.9)N vs (7.0 ± 1.1)N; P > 0.05]无明显改变,在100 mm Hg液压下脱细胞血管无异常扩张;内皮种子细胞在脱细胞血管支架上生长黏附良好?【结论】 Triton X-100法对新鲜牛颈静脉进行脱细胞处理效果良好,脱细胞牛颈静脉可作为细胞种植的血管支架使用?     

抑制SIRT2介导的心肌程序性坏死改善衰老心肌的缺血耐受

【立论依据】 衰老心肌对缺血/再灌注(I/R)损伤的耐受力显著降低。并且,坏死是I/R心肌死亡最主要的病理途径,但以往认为心肌坏死不可调控。最新发现SIRT2介导的RIP1去乙酰化是触发程序性坏死(Necroptosis)这一可调控性细胞坏死的关键机制。 【设计思路】 本研究以成年和老年组为对比,结合基因和药理学干预,从整体,器官,细胞,分子四个水平进行功能验证, 旨在探讨衰老状态下SIRT2介导的心肌Necroptosis是否是老年心肌缺血损伤加重的新机制。 【实验内容】 采用成/老年C57小鼠建立整体心肌I/R(30 min/4 h)模型。分别于基础状态和I/R后检测各组心肌SIRT2表达水平及其活性;RIP1的乙酰化水平。采用免疫共沉淀方法检测RIP1-RIP3复合物(necrosome)水平;免疫组化方法检测下游分子MLKL的质-膜转位;再灌注后测定心肌梗死面积。采用成年SIRT2 KO和RIP3 KO小鼠建立心肌I/R平行实验,分析SIRT2介导的促坏死在心肌缺血易损中的关键作用。进而,采用心肌点注射腺病毒或siRNA 上调/下调成年和老年心肌SIRT2的表达,在整体水平明确衰老状态下心肌SIRT2对I/R心肌Necroptosis以及心肌损伤的影响。运用离体心脏灌流结合SIRT2特异阻断剂AGK2和Necroptosis抑制剂nec-1,建立成/老年小鼠离体心脏I/R模型。在器官水平探讨干预SIRT2介导的Necroptosis能否抑制衰老心肌死亡。再则,建立体外心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型,使用AGK2或nec-1处理细胞;采用细胞动缘探测系统观察单心肌细胞收缩舒张功能;流式细胞仪检测PI和Annexin V双阳性细胞定量检测心肌Necroptosis程度与细胞存活率。在细胞水平阐明干预SIRT2介导的Necroptosis促进衰老心肌存活的分子机制。 【材料】 成年(4个月龄)及老年(22个月龄)C57小鼠。 【可行性】 老年组I/R心肌SIRT2活性显著增高,RIP1乙酰化水平随之降低,necrosome水平升高,MLKL细胞质-膜转位增加(均P<0.05)。离体灌流实验发现,AGK2可有效抑制老年I/R心肌SIRT2活性,减小老年组心肌损伤。心肌细胞实验显示,抑制SIRT2介导的Necroptosis可提高H/R后心肌存活率(均P<0.05)。现有的实验结果表明本设计切实可行。 【创新性】 我们有望首次证实:SIRT2介导的Necroptosis加重是老年心肌缺血易损性增加的重要原因;针对性的抑制心肌SIRT2可显著改善衰老心肌抗I/R损伤能力。本研究将为降低老年缺血性心脏病患者的心肌损伤提出新的干预靶点。     

牛脱细胞肌腱基质的制备方法研究

目的:探究牛肌腱组织脱细胞的方法,为组织工程法修复肌腱所需生物材料的制备提供理论和实验基础。方法:牛的肌腱作实验材料,被组织粉碎机粉碎后,依次放入不同浓度的胰蛋白酶溶液、Triton X-100溶液、SDS溶液浸泡处理后,所得基质用过氧乙酸-乙醇溶液中灭菌消毒处理,然后依次用蒸馏水和PBS缓冲液洗涤、过滤。最后冷冻、干燥、保存。冰冻切片进行苏木素-伊红染色,观察细胞核残留情况。微量DNA提取试剂盒提取脱细胞后跟腱基质DNA,检测DNA的残留量。结果:大体观察可见,各实验组跟腱组织经脱细胞处理后,均呈乳白色匀浆状。苏木素-伊红染色结果显示,跟腱组织脱细胞处理后细胞核均大量减少,细胞核残留极少,每高倍视野中细胞核残留不大于5。DNA含量结果显示,当牛跟腱组织依次经过0.5%胰蛋白酶溶液处理2h、1%的Triton X-100溶液处理2h、0.5%的SDS溶液处理1h后,得到的肌腱脱细胞基质DNA含量最少,为0.03μg/mg。结论:依次用胰蛋白酶溶液、Triton X-100溶液、SDS溶液浓度分别为0.5%、1%、0.5%、处理时间分别为2h、2h、1h时,对牛肌腱组织的脱细胞效果最佳。     

PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损及机制

【立论依据】 糖尿病患者发生缺血性心脏病(IHD)后心肌损伤程度明显高于非糖尿病患者,但其具体机制尚待阐明。线粒体自噬是细胞通过自噬机制选择性清除线粒体的过程,对于维持线粒体功能和细胞生存至关重要。新近研究表明,线粒体激酶PINK1可通过线粒体融合蛋白Mfn2募集并结合E3泛素连接酶Parkin,介导线粒体自噬。然而,PINK1在糖尿病心肌中的表达变化及其介导的Mfn2-Parkin通路在心肌缺血损伤中的作用尚不清楚。 【设计思路】 本课题拟在整体和细胞水平研究PINK1在糖尿病心肌中是否低表达、并引发线粒体自噬障碍,进而增加糖尿病缺血心肌易损性。 【实验内容】 (1)高脂饲料(45%脂肪含量)喂养C57BL/6小鼠16周,建立2型糖尿病(T2DM)小鼠模型。(2)在对照和T2DM小鼠构建心肌缺血(MI)模型,观察缺血心肌损伤、心肌PINK1-Mfn2-Parkin信号变化、线粒体自噬及线粒体功能。(3)分离乳鼠心肌细胞,高糖/高脂培养,利用腺病毒转染过表达PINK1或RNAi技术剔除PINK1表达,研究PINK1介导的线粒体自噬与心肌细胞缺氧损伤的关系。 【材料】 C57BL/6小鼠,SD乳鼠,线粒体膜电位测试盒,TUNEL凋亡检测试剂盒,蛋白质印迹、RNA干扰、腺病毒转染所需试剂等。 【可行性】 我们成功制备了T2DM小鼠模型;预实验结果提示,与对照组相比,T2DM小鼠心肌PINK1表达减少,且MI后心肌线粒体自噬水平显著降低,心肌缺血损伤加重(P<0.05)。过表达PINK1可有效增加高糖/高脂培养心肌细胞的线粒体自噬,减少缺氧心肌细胞凋亡(P<0.05)。以上结果强烈提示,PINK1的低表达通过影响线粒体自噬加重糖尿病心肌易损性的假设是可行的。本课题涉及的实验方法在前期研究中已熟练运用,为顺利完成奠定了基础;且实验室具备所需实验条件,所有实验试剂均可在国内购得。 【创新性】 PINK1-Mfn2-Parkin介导的线粒体自噬对于糖尿病心肌易损性的作用未见报道。预实验结果证实,PINK1低表达诱导线粒体自噬障碍致糖尿病缺血心肌易损性增加,增加心肌PINK1表达可显著改善糖尿病心肌抗缺血损伤的能力。如能彻底阐明该问题,可为减轻糖尿病IHD患者的心肌损伤提供全新的干预靶点和实验依据。     

激活AMPK对心肌纤维化的保护作用及其机制的研究

【立论依据】 心肌纤维化的治疗一直是困扰着国民的一大难题。心肌纤维化主要表现为:心脏重量、容积增加及形态的改变。初始阶段这种改变还能维持有效的心脏功能。长期纤维化,会导致心脏顺应性降低,最终导致心力衰竭发生。因此,如何抑制心肌纤维化的发生是改善心功能,是避免心力衰竭的关键。但是,目前临床上对心肌纤维化的治疗仍不能令人满意。心肌纤维化的主要病理改变之一,是心肌成纤维细胞(CF)的过度增殖。所以,控制心肌纤维化的关键,就是控制成纤维细胞的增殖。抑制成纤维细胞的增殖,我们就必须从成纤维细胞的细胞周期寻求突破点。正常细胞分化周期可分为G₁、S、G₂、M四个时期。其中影响细胞进程的关键时期,是G₁期向S期转化和G₂期向M期转化。目前,研究最多的是G₁期向S期转化,其过程主要是关键蛋白Rb,进而激活转录因子E2F,完成细胞由G₁期向S期的转化。Rb蛋白可由cyclinE-等复合体激活。而上述复合体又可被P21、P27、P53等蛋白抑制。所以,本实验拟cyclinE-CDK2复合体、P21、P27、P53途径对CF增殖周期进行探讨。 【设计思路】 近年来有研究发现,激活AMPK不仅具有细胞能量调节作用,同时也具有抑制内皮细胞增殖的作用。主要是通过抑制内皮细胞由G₁期向S期转化,最终抑制内皮细胞增殖。进一步研究显示,AMPK在心肌成纤维细胞中也有表达。那么激活AMPK能否抑制CF增殖及其发生的机制是本课题研究的重点。 【实验内容】 分为在体实验和离体实验。在体部分主要是在活体小鼠上探究注射AMPK的激动剂和阻断剂观察CF的增殖情况。离体实验分为三部分,分别验证激活AMPK对CF增殖的抑制作用;激活AMPK对CF周期蛋白的调节作用;激活AMPK抑制CF增殖通过P21、P27周期蛋白途径。 【材料】 AICAR,CompoundC,cyclinA抗体,cyclinD1抗体,cyclinE抗体,cyclinB抗体,CDK2抗体,P21抗体,P27抗体,P53抗体,小白鼠 【可行性】 本实验室硬件设施完善,能够达到实验中涉及到的蛋白质印迹,流式细胞仪技术,细胞计数,ELISA,MTT等技术要求。 【创新性】 该课题致力于研究激活AMPK在CF增殖中起到的调节作用,并且为临床上治疗心肌纤维化提供了新的靶点。     

胎球蛋白B上调致糖尿病缺血/再灌注心肌易损性增加及机制

【立论依据】 糖尿病患者缺血性心脏病(IHD)的发病率及心肌损伤程度明显高于正常人群,亟需探寻有效防治措施。胎球蛋白B(Fet-B)是由肝细胞和心肌细胞合成并分泌的糖蛋白。我们预实验发现,2型糖尿病小鼠心肌Fet-B的表达较正常小鼠高出4.84倍,且能与心肌胰岛素受体结合,诱导胰岛素下游PI3K-Akt通路受损、葡萄糖转运子4转位减少,提示心肌Fet-B表达增加可能与心肌胰岛素敏感性受损有关。此外,转录调节因子FoxO1在糖尿病状态下表达增加,然而其与Fet-B高表达的关系尚不清楚。 【设计思路】 本课题拟在预实验基础上,在整体和细胞水平,运用药理学方法和基因干预手段研究:2型糖尿病心肌FoxO1/Fet-B表达增加可否通过诱导胰岛素抵抗、从而使缺血/再灌注(I/R)损伤加重,并进一步探讨其机制。 【实验内容】 (1)研究糖尿病心肌Fet-B表达变化、并分析其与心肌胰岛素抵抗的关系:检测糖尿病小鼠血浆和心肌Fet-B水平,给或不给胰岛素,检测胰岛素下游信号;检测心肌FoxO1水平;分离乳鼠心肌细胞,分别用siRNA和腺病毒转染下调和上调FoxO1,检测Fet-B变化。(2)验证糖尿病心肌I/R损伤加重,分析其与Fet-B表达变化的关系:构建ob/ob小鼠心肌I/R模型,检测心肌损伤,分析其与Fet-B表达变化的关系。(3)基因水平验证FoxO1/Fet-B表达与I/R心肌损伤有关:构建Fet-B敲除小鼠I/R模型,给或不给胰岛素,检测心功能及心肌损伤、胰岛素下游信号;再给予Fet-B,检测是否加重心肌I/R损伤和心肌胰岛素抵抗。 【材料】 WT小鼠、ob/ob小鼠、Fet-B敲除小鼠、心肌I/R模型的手术器械、细胞培养所需试剂、细胞凋亡检测试剂盒、有关信号分子的抗体、siRNA和腺病毒、RT-PCR及蛋白质印迹仪器等。 【可行性】 本实验设计立足于前期预实验结果之上,所需实验技术均为常规技术,实验室具备所需仪器,动物与试剂均购到,可行性较好。 【创新性】 Fet-B在糖尿病及心脏方面的研究在国内外均无论文发表。我们首先提出2型糖尿病心肌FoxO1/Fet-B表达增加可诱导心肌胰岛素抵抗,进而导致I/R心肌损伤加重的新机制,并得到预实验的支持,期望为临床防治糖尿病IHD提供新靶点。     

阻断STAT3调控Th17/Treg平衡抑制免疫性肝损伤的实验研究

【立论依据】 肝病临床难治,关键在于免疫应答不力。肝损伤程度与免疫调控密切相关,近年来发现的Th17/Treg细胞失衡,可参与多种疾病的发生发展,但在肝损伤的研究甚少。调节Th17增殖和功能的关键是转录激活因子STAT3。研究发现,一种去乙酰酶抑制剂LBH589可以阻断STAT3,引起Th17/Treg细胞变化。 【设计思路】 本实验拟建立免疫性肝损伤模型,从细胞、蛋白、基因水平对Th17、Treg细胞数量及功能进行评估,探究Th17/Treg细胞失衡与肝损伤的相关性及机制。并采用LBH589分别从体内、体外观测免疫调控效果。 【实验内容】 Wistar大鼠随机分为两组。尾静脉注射ConA建立模型组(CC),PBS注射建立对照组(HC)。CC组自第六周始腹腔注射LBH589(乙组),甲组注射PBS至建模结束,血清学肝功能检测及肝脏病理分析确定建模成功。取外周取血检测TIMP-1、HA水平。取PBMC体外细胞培养,用不同浓度LBH589处理(G2、G3),PBS处理作为对照组(G1),ELISA检测上清液IL-17、IL-6等相关细胞因子的含量。FCM检测Th17细胞和Treg细胞频率变化,计算Th17/Treg比值;免疫组织化学法检测Foxp3、RORγt蛋白表达情况;ELISA法检测外周血IL-17、IL-6等相关细胞因子。 【材料】 健康的雄性wistar大鼠、流式细胞仪、conA(白色冻干粉)、OLYMPUS400自动生化仪,免疫组化试剂、ELISA反应试剂盒、TIMP-1单克隆抗体试剂盒、DMSO溶剂、大鼠透明质酸ELISA试剂盒、96孔培养板。 【可行性】 课题思路逻辑、合理、创新,前期预结果良好。具备该课题实施所需的人员素质和实验环境。课题指导教师多年来致力于肝病的免疫学研究,并取得一定成果。所属实验室为山东省十二五重点实验室,国家级实验与教学示范中心,具有完善的实验科研环境。 【创新性】 肝病临床难治,关键在于机制不清。本课题首次提出把各细胞亚群的网络平衡学说应用于疾病的研究,认为肝病的发展演变,关键在于Th17/Treg细胞亚群的失衡,为肝病发生发展机制提供了理论依据。并通过阻断STAT3免疫调控Th17/Treg细胞平衡状态,以期肝脏损害发生改变,从而达到抑制病情的治疗目的,为其临床治疗提供新的线索。     

新型脱细胞脑组织修复支架的制备及其细胞相容性

 【目的】研制天然脱细胞脑组织修复支架,并对其形态结构、主要成分和细胞相容性进行分析,为研制出理想的脑损伤修复支架提供初步的实验依据。【方法】取成年Sprague-Dawley （SD）大鼠脑皮质,运用冻融、Triton X-100、脱氧胆酸钠、DNA/RNA酶等进行脱细胞处理并予京尼平（Genipin,GP）交联,对处理后的支架材料进行形态结构观察、主要成分分析和细胞相容性观察。【结果】经脱细胞处理后,脑组织细胞成分已去除,形态上具有高度仿生的三维立体空间网状结构。经GP交联后脱细胞支架空间网状结构变得更为明显,无菌保留3个月未见明显降解。平均孔径（14.9±2.5）μm,孔隙率达（90.4±2.2）％。脱细胞支架细胞外基质成分层粘连蛋白(Laminin,LN)强阳性表达、纤维粘连蛋白（Fibronectin,FN）和Ⅳ型胶原（Collagen Ⅳ,Col Ⅳ）弱阳性表达。神经干细胞与脱细胞支架共培养,HE可见细胞外基质支架间大量细胞粘附; SEM下可见大量神经干细胞粘附在支架材料表面,部分细胞表面有突起。【结论】初步研制的脱细胞脑组织支架呈立体空间网状结构,部分保留了细胞外基质成分,并具有良好的细胞相容性。     

去细胞肝支架诱导大鼠损伤肝脏再生的研究

【立论依据】 基于结合国内外对肝脏去细胞的研究及前期的基础,利用肝脏去细胞支架在体内诱导损伤肝组织的修复与再生。以解决肝功能衰竭供体缺乏,在外科手术后损失修复与再生的空缺。 【设计思路】 制造肝损伤模型研究去细胞支架对于肝脏损伤修复及再生的作用。 【实验内容】 通过外科手术造成大鼠肝脏损伤,移植去细胞支架修补创面;检测去细胞基质内生长因子含量与移植后支架内细胞的类型;观测移植后肝脏形态及内部结构的改变与蛋白表达情况。 【材料】 去细胞肝脏支架。 【可行性】 去细胞支架相较于其他生物材料具有完全模拟机体细胞的生存环境;去细胞支架含有的一系列黏附分子及生长因子是细胞与组织再生的关键因素;运用去细胞支架体外培养细胞已初具成效。 【创新性】 相较国外针对去细胞支架的体外研究,体内移植能模拟真正的体内生理环境;运用新型生物材料修复肝损伤。     

改良Sihler's染色法显示腹前外侧群肌的肌内神经分支分布

【目的】 通过对腹前外侧群肌肌内神经分支分布的研究,为腹前外侧群肌肌移植的临床应用提供解剖学依据。 【方法】 改良的Sihler's肌内神经染色法:除色素, 固定好的标本用3%氢氧化钾进行浸泡5~6周;脱钙,标本用双蒸水冲洗后浸入Sihler's I液5~6周;染色,新配置的Sihler's II液对标本进行染色2~3周;脱色,标本放入 Sihler's I液脱染6~8 h,再用0.05% 碳酸锂中和1 h;透明,逐级甘油梯度(40%、60%、80%、100%) 透明,每一梯度约放2~3周。整个过程大约历时5~6个月。 【结果】 (1)腹外斜肌:受第7~12 胸神经前支支配;腹内斜肌和腹横肌:受第7~12 胸神经前支及第1腰神经前支支配;(2)支配该肌群的神经均从肌外侧入肌,神经走形与腹外斜肌纤维平行一致。 【结论】 腹前外侧群肌肌内神经呈节段性分布,相邻神经主干和分支之间均发出交通支形成不同程度的吻合。     

宿主因子NF90调节流感病毒复制的研究

【目的】 研究流感病毒的宿主因子NF90对流感病毒复制的影响。 【方法】 从 293T细胞中提取总RNA,以Oligo(dT)反转录cDNA。根据Gen Bank 中NF90的基因序列,设计上下游引物。以转录出的cDNA为模板扩增出NF90基因。用EcoR I 和Not I两种核酸内切酶对NF90 PCR扩增产物和PCDNA3.1-V5-HIS载体进行双酶切,酶切产物用高效DNA连接酶连接,然后鉴定选取正确的重组质粒,并命名为PCDNA3.1-NF90-V5-HIS。把PCDNA3.1-NF90-V5-HIS重组质粒转染至293T细胞,转染36 h后感染流感病毒A/WSN/1933 Moi 0.01,感染16 h后提取293T细胞的总蛋白,用蛋白质印迹法检测PCDNA-NF90-V5-HIS 重组质粒和流感病毒NP蛋白的表达。 【结果】 PCDNA3.1-NF90-V5-HIS重组质粒转染至细胞后,NP蛋白表达下降,流感病毒复制减弱。 【结论】 宿主因子NF90可以抑制流感病毒的复制。     

微RNA-21通过激活沉默信息调控因子1信号通路缓解多柔比星心肌毒性

目的 探讨微RNA-21（miR-21）能否减轻多柔比星（DOX）心肌毒性,并阐明沉默信息调控因子1（SIRT1）信号通路是否介导其作用。方法 用DOX（1 μmol/L）处理大鼠原代心肌细胞构建DOX心肌毒性模型。将心肌细胞分为8组：对照组、miR-21组、miR-21抑制剂组、DOX组、miR-21+DOX组、miR-21抑制剂+DOX组、Sirtinol+miR-21+DOX组、Sirtinol+DOX组,miR-21 mimics、miR-21抑制剂和Sirtinol（SIRT1抑制剂）分别于DOX处理前24 h加入细胞培养液中。DOX处理24 h后检测心肌细胞的细胞活力、凋亡率、凋亡相关蛋白和SIRT1信号通路表达情况。结果 与对照组相比,DOX处理24 h后心肌细胞活力降低,Bcl-2和SIRT1表达量降低,而Bax和cleaved Caspase-3表达量增加,细胞凋亡率增高,差异均有统计学意义（P<0.05）。与DOX组相比,miR-21可明显提高心肌细胞活力,上调Bcl-2和SIRT1表达,下调Bax和cleaved Caspase-3表达,降低细胞凋亡率,差异均有统计学意义（P<0.05）。抑制SIRT1信号通路可削弱miR-21对心肌细胞的保护作用（P<0.05）。结论 miR-21可通过激活SIRT1信号通路抑制心肌细胞凋亡,提高细胞活力,缓解DOX心肌毒性。     

灵芝多糖对阿霉素所致心肌损伤的作用及机制研究

目的 探讨灵芝多糖对阿霉素（多柔比星）所致心肌损伤的作用及可能的机制。方法 腹腔注射阿霉素复制大鼠急性心肌损伤模型，观察低、高剂量灵芝多糖对大鼠血清心肌酶指标、心肌组织及抗氧化酶活力的影响；低、高剂量灵芝多糖预处理大鼠H₉C₂心肌细胞，再与阿霉素共培养，通过CCK-8法检测细胞活力，ELISA法检测H₉C₂大鼠心肌细胞和大鼠心肌组织中的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-６）及白细胞介素-10（IL-10）水平。结果 灵芝多糖高剂量+阿霉素组和灵芝多糖低剂量+阿霉素组大鼠一般情况明显优于阿霉素组；阿霉素组大鼠心肌酶水平升高、心肌组织结构受损；灵芝多糖高剂量+阿霉素组和灵芝多糖低剂量+阿霉素组较阿霉素组心肌酶水平降低、心肌组织结构受损程度减轻（P <0.05）；阿霉素组H₉C₂心肌细胞存活率降低，灵芝多糖高剂量+阿霉素组和灵芝多糖低剂量+阿霉素组较阿霉素组升高（P <0.05）；灵芝多糖高剂量+阿霉素组和灵芝多糖低剂量+阿霉素组大鼠心肌组织及H₉C₂细胞与阿霉素组比较，抗氧化酶活力升高，促炎症因子减少，抗炎症因子增加（P <0.05）。结论 灵芝多糖在体内和体外均有减轻阿霉素所致心脏毒性的作用。     

壳聚糖耦联杂大环Cu(II)配合物的制备及其催化释放NO性能

【目的】 寻求高效低毒的内源性一氧化氮供体型前药,并探究其在生理条件下催化一氧化氮前驱体释放一氧化氮性能。 【方法】 采用常规法与微波法考察关键中间体制备条件;应用壳聚糖成膜策略耦联杂大环Cu(II)化合物,通过¹HNMR、¹³CNMR、SEM等手段对中间体及目标前药分子的结构和组成进行表征;利用重氮化反应探究其催化一氧化氮前驱体释放一氧化氮性能。 【结果】 (1)探寻出关键中间体的高效、节能制备方法;(2)成功制备并表征了各中间体及其目标前药;(3) 制备的目标前药具有良好的催化一氧化氮前驱体释放一氧化氮性能。 【结论】 为人工合成高效低毒的一氧化氮供体型前药的设计开辟了新思路,也为一氧化氮的供药方式提出了新的供药途径。     

灵芝酸对2型糖尿病肾病大鼠免疫调节作用

【立论依据】 糖尿病肾病已成为终末期肾病的主要原因,其发生、发展与免疫因素密切相关,灵芝酸具有调节免疫等多种药理作用。 【设计思路】 观测2型糖尿病大鼠肾组织形态结构和免疫因子的变化,探讨灵芝酸对2型糖尿病大鼠肾病的干预作用。 【实验内容】 (1)制备糖尿病大鼠模型;(2)检测肾脏内生肌酐清除率(Ccr)和尿白蛋白排泄率(UAER)等指标;(3)察肾组织形态结构;(4)检测肾脏T/B细胞标志分子(CD4和CD8α/β)和效应分子(TNF-α、IFN-γ和TGFβ)的变化。 【材料】 8周龄SD大鼠,随机分为正常对照(A)组,模型(B)组、灵芝酸低浓度(C)组、灵芝酸高浓度(D)组,每组20只。适应性饲养7 d,B、C、D组高脂高糖喂养4周,静脉30 mg/kg注射1%链脲佐菌素(STZ)制备模型,C组灵芝酸3.0 mg/(kg·d)灌胃,D组灵芝酸6.0mg/(kg·d)灌胃,A和B组等体积生理盐水灌胃。20周龄,监测24 h尿量、尿白蛋白及尿肌酐(Ucr)、Ccr和UAER水平;分离血清,测定血糖,血肌酐及尿素氮水平;肾脏称重,计算肾脏指数;H-E,PAS和Masson染色观察肾组织病理变化、肾小球胶原纤维及ECM聚集情况;免疫组化SP法检测TGFβ;应用流式细胞术检测肾脏CD4和CD8α/β;ELISA方法检测TNF-α、IFN-γ和TGFβ。 【可行性】 前期实验结果表明:(1)20周龄时,与A组比较,B组各肾功能指标均表现出显著性差异(P<0.05),出现糖尿病肾病的明显特征;与B组比较,C组和D组各肾功能指标均有显著性差异(P<0.05);(2)与A组比较,B组出现肾小球肥大、纤维化,基底膜增厚等病理改变,肾小球面积及系膜增殖指数明显增大;与B组比较,C组和D组肾脏病变明显减轻,肾小球面积及系膜增殖指数明显降低。 【创新性】 系统研究灵芝酸对对大鼠肾组织保护作用,对临床糖尿病肾病的防护具有理论指导意义。     

维甲酸诱导基因I对氧固醇7α羟化酶的调控作用研究

【立论依据】 基因芯片结果显示,敲除维甲酸诱导基因I(RIG-I)的小鼠体内氧固醇7α羟化酶(下文称CYP7B1)基因水平发生变化,说明两者存在慢反应联系,本实验目的旨在探究这两个基因之间是否存在直接调控的快反应联系。 【设计思路】 本实验首先需要对基因芯片的结果进行确定,随后通过多种方式改变RIG-I的表达水平(干扰素刺激、质粒转染等),观察CYP7B1是否存在明显的协同表达变化。如果能确定两者之间确实存在直接调控关系,将进一步探究调控的具体机制,从分子水平阐释调控的环节。 【实验内容】 利用real-time PCR检测基因芯片结果;利用IFNγ上调RIG-I表达水平,并运用real-time PCR检测CYP7B1的表达水平变化;构建载有RIG-I基因的质粒并进行质粒转染,运用real-time PCR和蛋白质印迹法检测CYP7B1的基因表达和蛋白表达变化情况;转染RIG-I promoter,探究其调控CYP7B1的具体机制。 【材料】 细胞:293T细胞、Hela细胞、HepG2细胞等;其他:RIG-I、CYP7B1引物、一抗、二抗及其他常规所需试剂。 【可行性】 预实验中已经确定了RIG-I与CYP7B1间存在慢反应调控关系,同时也确定了相关文献中IFN-γ对RIG-I的上调作用,实验器材、试剂齐备。 【创新性】 本实验首次提出RIG-I基因与CYP7B1及其所参与的脂代谢过程有调控关系,对胆固醇代谢、神经甾体代谢、及CYP7B1缺乏所引起的一系列疾病的研究也可以提供一定的实验依据和理论支持。     

利用脱细胞骨软骨纤维支架形成可修复软骨缺损的软骨-骨复合组织

【立论依据】 目前,因自体软骨组织修复力极其有限,故对软骨缺损的治疗是临床上的一大难题。现在的治疗方式多为手术移植治疗,包括自体骨移植,单一软骨组织移植以及高分子材料支架移植,但存在损伤大,细胞存活率低和机体相容性差等不足。对此,体外构建一种克服传统治疗缺点的新的组织工程材料显得极其重要。 【设计思路】 因自体骨移植损伤大,故设计体外构建组织材料;因单一软骨组织移植机体相容性差,故设计构建软骨骨复合组织;因软骨细胞存活率低,故设计构造脱细胞骨软骨纤维支架种植细胞,提供骨、软骨细胞最佳生长微环境。所以,实验设计体外利用异体脱细胞骨软骨纤维支架构建软骨-骨复合组织,再移植到动物体内生长,从而提供一种治疗软骨缺损性疾病的新的组织工程材料。 【实验内容】 (1)分离、纯化与培养兔骨髓中的间充质干细胞。(2)体外脱细胞处理家兔髌骨股骨侧的骨软骨块构建骨软骨纤维支架,对支架进行力学测试、镜下观察、异体免疫性观测等。(3)将间充质干细胞移植到脱细胞支架上,利用支架双层存留细胞外基质的诱导作用在骨和软骨层分别诱导干细胞分化形成成骨细胞和软骨细胞。(4)将得到的复合组织移植到裸鼠背部皮下,跟踪观测组织直径大小变化、生长状况、组织构成等。(5)构建兔膝关节股骨关节面软骨缺损模型,进行移植手术,持续观测实验对象膝关节活动度及应力性、影像学表现,最后做缺损修补处切片镜下观察对比,分析评估实验构建组织工程材料是否优于传统移植材料。 【材料】 实验动物家兔、裸鼠;30 g/L戊巴比妥钠、胎牛血清、0.35 mmol/L苯甲基磺酰氟、1% TritonX-100等。 【可行性】 实验动物和相关试验方法为常规操作,且已有相关实验基础。 【创新性】 实验设计的骨软骨复合组织克服了传统移植所用单一软骨组织机体相容性低和细胞存活率低的缺点,可以实现从试验台到临床的转化医学概念,为软骨缺损性疾病的移植治疗提供思路,有重要的临床意义。