去甲斑蝥素降低人胃癌细胞程序性细胞死亡因子4的表达

目的 研究去甲斑蝥素(NCTD)降低程序性细胞死亡因子4(PDCD4)表达的机制。方法MTT法测定NCTD 5~640 μmol·L^-1与人胃癌BGC-823细胞作用24,48和72 h细胞存活率;Western蛋白质印迹法测定NCTD 0, 6, 30和60 μmol·L^-1作用BGC-823细胞24 h PDCD4蛋白表达水平;NCTD 60 μmol·L^-1作用20 h后加入MG132 10 μmol·L^-1作用4 h对PDCD4蛋白表达的影响;逆转录PCR法测定NCTD 60 μmol·L^-1作用BGC-823细胞24 h后PDCD4 mRNA表达的变化;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定NCTD 60 μmol·L^-1作用BGC-823细胞6, 12和24 h后microRNA-21(miR-21)的表达。Western蛋白质印迹法测定细胞转染miR-21抑制剂对PDCD4蛋白表达的影响。结果 NCTD作用后BGC-823细胞存活率明显下降,NCTD作用BGC-823细胞24, 48和72 h IC₅₀分别为74.5, 35.0和10.3 μmol·L^-1。NCTD 6, 30和60 μmol·L^-1作用于BGC-823细胞24 h,PDCD4蛋白分别降低9%, 47%和62%。NCTD对PDCD4 mRNA表达无影响。与NCTD处理组相比,MG132和NCTD共处理对PDCD4蛋白表达无明显影响。NCTD 60 μmol·L^-1作用BGC-823细胞12和24 h后,细胞中miR-21的表达显著升高(P<0.01)。细胞转染miR-21抑制剂后,可抑制NCTD降低PDCD4蛋白表达的作用。结论 NCTD通过调控miR-21降低PDCD4蛋白的表达。     

吡格列酮对脂多糖诱导星形胶质细胞诱导型一氧化氮合酶表达的抑制作用

目的 研究吡格列酮(Pio)对脂多糖 (LPS) 诱导星形胶质细胞(AC)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的抑制作用及其作用机制。方法 AC分别加入Pio 0.1, 1.0和10.0 μmol·L^-1, c-Jun氨基端激酶(JNK)抑制剂SP600125 20.0 μmol·L^-1, p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)抑制剂SB203580 20.0 μmol·L^-1或过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)抑制剂GW9662 10.0 μmol·L^-1,1 h以后加入LPS 10.0 mg·L^-1, 继续作用24 h。Griess法测定培养AC上清液中一氧化氮(NO)含量。免疫印迹法和免疫荧光法检测iNOS的表达水平。结果 与正常对照组相比,LPS 10.0 mg·L^-1组iNOS表达水平和NO分泌水平均显著增高(P<0.01)。Pio 0.1, 1.0和10.0 μmol·L^-1可明显抑制LPS诱导的iNOS表达上调及NO分泌增加(P<0.05),Pio 10.0 μmol·L^-1组iNOS蛋白表达水平由LPS组1.711±0.283下降到0.157±0.082(P<0.01),NO分泌量由LPS组(16.63±2.25)μmol·L^-1下降到(6.92±1.30)μmol·L^-1(P<0.01)。GW9662 10.0 μmol·L^-1可抑制Pio 1.0 μmol·L^-1的上述作用,iNOS蛋白表达水平由Pio 1.0 μmol·L^-1组0.562±0.100增加到0.847±0.088(P<0.01),NO分泌量由(9.27±1.23)μmol·L^-1增加到(15.54±2.30)μmol·L^-1(P<0.01)。SB203580 20.0 μmol·L^-1和SP600125 20.0 μmol·L^-1的作用与Pio作用相似,使iNOS蛋白表达水平降低到0.434±0.082和0.434±0.076,NO分泌量下降到(11.53±2.40)μmol·L^-1和(8.81±0.58)μmol·L^-1;而单独应用SB203580 20.0 μmol·L^-1和SP600125 20.0 μmol·L^-1对AC的iNOS表达和NO分泌没有影响。结论 Pio能通过抑制LPS诱导的大鼠皮质AC的iNOS表达,从而减少NO的分泌,这种抑制作用可能与其激活PPARγ和阻断JNK和p38MARK信号转导通路有关。     

水胺硫磷在大鼠肝微粒体的生物转化和代谢动力学

目的 探讨水胺硫磷在大鼠肝微粒体的体外代谢活化产物及代谢动力学特征。方法 应用液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(LC/QTOF MS)筛查并鉴定水胺硫磷在大鼠肝微粒体孵育液中的氧化产物。用乙酰胆碱酯酶抑制法考察水胺硫磷及其氧化产物水胺氧磷的抑酶活性。应用液相色谱-三重四级杆串联质谱(LC/Triple-Q MS/MS)定量检测肝微粒体中的水胺硫磷及其代谢产物水胺氧磷,研究水胺硫磷及其产物的消长动力学和氧化产物生成的酶动力学。结果 筛查并鉴定了水胺硫磷在大鼠肝微粒体的氧化脱硫产物水胺氧磷。水胺氧磷对乙酰胆碱酯酶的抑制活性远高于水胺硫磷,IC₅₀值比水胺硫磷低4个数量级,表明水胺硫磷的氧化脱硫反应是一个代谢活化过程。水胺硫磷在大鼠肝微粒体中的半衰期(t_1/2)为14.6 min,外推得到体内肝清除率Cl_H为43.8 ml·min^-1·kg^-1。水胺氧磷的生成符合双相酶动力学模型,K_m,app1为1.12 μmol·L^-1,产物生产最大速率(V_max1)为0.43 μmol·min^-1·g ^-1;蛋白K_m,app2为67.92 μmol·L^-1,V_max2为1.28 μmol·min^-1·g ^-1蛋白。结论 水胺硫磷在大鼠肝微粒体中能快速代谢消除,生成抑酶活性更高的产物水胺氧磷而产生毒性。     

异丙嗪加重清开灵注射液导致的心律失常

目的 研究异丙嗪(PMZ)对清开灵注射液(QKL)所致心律失常的影响。方法 ① 豚鼠在体心脏实验:按照QKL 3.1→15.5→31→93 ml·kg^-1的顺序累加静脉推注,每组持续5 min,于处理后5 min记录心电图;按照QKL 31 ml·kg^-1→PMZ 7.67 mg·kg^-1→PMZ 38.35 mg·kg^-1的顺序累加静脉推注,每组持续5 min,于处理后5 min记录心电图。② 豚鼠离体心电图实验:按照QKL 3.3→33→66→99 ml·L^-1的顺序灌流,每一组灌流持续5 min,分别记录各浓度组给药5 min后的心电图;按照QKL 33 ml·L^-1→QKL 33 ml·L^-1+PMZ 1 μmol·L^-1→QKL 33 ml·L^-1+PMZ 10 μmol·L^-1→QKL 33 ml·L^-1+PMZ 30 μmol·L^-1→QKL 33 ml·L^-1+PMZ 50 μmol·L^-1→QKL 33 ml·L^-1,每一组灌流持续5 min,分别记录各浓度组给药5 min后的心电图。③ 记录左心室乳头肌动作电位实验:按照QKL 3.3→33→66→99→165 ml·L^-1→洗脱的顺序灌流,分别记录每个浓度组的动作电位图形。按照QKL 99 ml·L^-1→QKL 99 ml·L^-1+PMZ 1 μmol·L^-1→QKL 99 ml·L^-1+PMZ 10 μmol·L^-1→洗脱顺序,分别记录每个浓度组的动作电位图形。结果 ① QKL 31 ml·kg^-1明显延长豚鼠在体心电图QRS及QTc间期。合用PMZ 38.35 mg·kg^-1进一步延长P-R, QRS间期及QTc间期,并能显著减慢心率(P<0.05)。② QKL 33 ml·L^-1延长豚鼠离体心电图QRS间期。合用PMZ 1, 10, 30或50 μmol·L^-1呈浓度依赖性延长P-R, QRS间期及QTc间期,并能显著减慢心率(P<0.05)。③ QKL 99 ml·L^-1合用PMZ 10 μmol·L^-1使豚鼠左心室乳头肌动作电位部分消失。结论 PMZ能加重QKL诱发的豚鼠心律失常,临床上应该谨慎使用PMZ抢救QKL导致的严重不良反应的患者。     

海南粗榧新碱衍生物HH07A对肿瘤细胞内DNA拓扑异构酶Ⅱ和蛋白激酶C活性的影响

HH07A 5.5 μmol·L^-1作用L1210细胞24 h后, 可使细胞的DNA拓扑异构酶Ⅱ活性下降; 在无细胞系统, HH07A 0.55 mmol·L^-1也能直接促进DNA拓扑异构酶Ⅱ引起的DNA链断裂. 经HH07A (L1210细胞5.5 μmol·L^-1, HL-60细胞8.25 μmol·L^-1)作用24 h后, L1210及HL-60细胞的胞浆蛋白激酶C(PKC)活性升高, 胞膜PKC活性下降, 而全细胞PKC活性变化不大. 在无细胞系统中, HH07A 1.1 mmol·L^-1能明显抑制PKC的活性.     

游离脂肪酸对肝细胞L02的脂毒性及氧化应激机制

目的 探讨游离脂肪酸(FFA)对人正常肝细胞L02的脂毒性及其机制。方法 用含FFA 0.2, 0.4和0.8 mmol·L^-1的培养液培养L02细胞48 h,通过油红O染色和甘油三酯(TG)含量检测胞内脂质蓄积,测定培养上清谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)活性分析肝细胞损伤,锥虫蓝拒染计数法分析细胞存活率,测定琥珀酸脱氢酶(SDH)活性分析线粒体功能,DCFH-DA法检测活性氧类(ROS)水平,比色法检测总谷胱甘肽和丙二醛(MDA)含量,FITC-AnnexinⅤ/PI法检测细胞凋亡。结果 经FFA处理L02细胞48 h后,FFA 0.4和0.8 mmol·L^-1组TG含量131±50和(267±71)μmol·g^-1蛋白较正常对照组(32±6)μmol·g^-1蛋白显著升高(P<0.05),FFA 0.2, 0.4和0.8 mmol·L^-1组GPT活性分别为2.05±0.06, 2.78±0.64和(2.43±0.55)U·L^-1,较正常对照组(1.10±0.05)U·L^-1显著升高(P<0.05)。锥虫蓝拒染法显示各FFA组细胞存活率无显著变化;FFA 0.4和0.8 mmol·L^-1组SDH活性(A_{490 nm})分别为2.10±0.11和1.95±0.11,均较正常对照组1.46±0.06显著升高(P<0.01);FFA 0.8 mmol·L^-1组ROS水平为642±58,较正常对照组559±31显著升高(P<0.01)。FFA 0.2, 0.4和0.8 mmol·L^-1组总谷胱甘肽水平分别为176±6, 180±11和(96±4)μmol·g^-1蛋白,较正常对照组(202±13)μmol·g^-1蛋白显著降低(P<0.05),FFA 0.4和0.8 mmol·L^-1组MDA水平分别为33.8±5.5和(50.4±7.4)mmol·g^-1蛋白,均较正常对照组(8.08±5.48)mmol·g^-1蛋白显著升高(P<0.01)。各组间凋亡率无显著差异。结论 FFA对肝细胞L02有一定损伤,这种损伤对细胞存活无明显影响,亦不会引起细胞凋亡,其细胞损伤机制与肝细胞氧化应激有关。     

用选择性可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂研究大鼠小脑内NO-cGMP神经通路

应用清醒大鼠脑微透析技术以选择性可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂1H-［1,2,4］噁二唑［4,3-a］喹喔啉-1-酮（ODQ）为工具药研究大鼠小脑NO-cGMP神经通路. 小脑内局部灌流ODQ(5,10,50,100 μmol·L^-1,5 μL·min^-1)可剂量依赖性降低细胞外基础cGMP水平, 最大可使细胞外基础cGMP水平降低80%. ODQ 100 μmol·L^-1可完全对抗N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA, 200 μmol·L^-1）或α-氨基羟甲基异噁唑丙酸（AMPA,100 μmol·L^-1）引起的细胞外cGMP水平增加,ODQ也可抑制NO供体S-亚硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP,1.5 mmol·L^-1)引起的细胞外cGMP水平增加. 说明在基础条件下小脑内cGMP 80%来源于可溶性鸟苷酸环化酶激活. 进一步证明了NO通过激活可溶性鸟苷酸环化酶使cGMP增加.     

物质对人中性粒细胞超氧阴离子生成的活化作用

神经肽P物质能激活多种参与炎症和免疫反应的细胞. 然而P物质直接刺激人粒细胞产生超氧阴离子(O^÷₂)需要较高的浓度(>10 μmol·L^-1). 本实验观察了低浓度P物质对人粒细胞超氧阴离子生成的活化作用. 结果表明, P物质在低浓度时(3 μmol·L^-1)能活化人粒细胞, 使?甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基苯丙氨酸(fMLP)刺激产生的超氧阴离子明显增多. P物质的这一活化作用呈剂量和时间依赖性. 在无细胞外钙的情况下，P物质没有这种活化作用. P物质活化fMLP引起的O^÷₂生成增多作用可被神经激肽(NK)-1受体阻断剂spentide (1 μmol·L^-1), 磷脂酶C抑制剂U-73122 (10 nmol·L^-1)以及Ca²⁺通道阻断剂尼卡地平 (1 μmol·L^-1)所抑制. 这些发现提示, P物质活化人粒细胞可能是经NK-1受体偶联的磷脂酰肌?醇代谢途径, 并且是细胞外钙依赖性的.     

皮质酮对原代培养大鼠海马神经细胞的毒性作用及其与兴奋性氨基酸的关系

探讨了皮质酮对原代培养海马神经细胞的毒性作用及作用机理. 结果显示,无血清培养基中加入皮质酮（10 nmol·L^-1-0.1 mmol·L^-1）可浓度依赖地损伤原代培养的海马和皮层神经细胞,其EC₅₀分别为3.2 和85 μmol·L^-1. 预先加入N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂地佐环平(MK 801,终浓度为50 μmol·L^-1）可显著拮抗皮质酮（10 μmol·L^-1）对海马神经细胞的毒性作用. 皮质酮同海马脑薄片共同孵育10和20 min可明显增加海马脑薄片谷氨酸和谷氨酰胺的释放,对天冬氨酸的释放则无明显影响. 实验结果提示,皮质酮可选择性地损伤原代培养海马神经细胞,该毒性作用可能与其增加兴奋性氨基酸释放有关.     

溶血磷脂酰胆碱刺激脑微血管平滑肌细胞增殖的细胞内信号转导途径

通过测定［³H］胸腺嘧啶核苷(［³H］TdR)参入和结晶紫染色法测定平滑肌细胞增殖,研究了溶血磷脂酰胆碱(LPC)刺激牛脑微血管平滑肌细胞(BCMSMC)增殖的细胞内信号转导途径. 结果显示,LPC能浓度依赖性(1 nmol·L^-1-10 μmol·L^-1)诱导BCMSMC摄取［³H］TdR,在LPC的浓度为10 μmol·L^-1时作用达最大,cpm由366±142升至1761±296(P<0.01);LPC亦能浓度依赖性(1 nmol·L^-1-10 μmol·L^-1)诱导BCMSMC增殖,在LPC浓度为1 μmol·L^-1时促增殖作用达坪值,A_{595 nm}由0.060±0.009增至0.100±0.015(P<0.01). 丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)特异性抑制剂PD 98059(2-50 μmol·L^-1),血小板衍生生长因子受体抑制剂酪氨酸磷酸化抑制剂AG 1296(2-50 μmol·L^-1)以及蛋白质酪氨酸激酶抑制剂除莠霉素A(2-10 μmol· L^-1)能浓度依赖性地抑制LPC的上述作用. 表明LPC能促进BCMSMC增殖,其细胞内信号转导与MAPK途径有关.     

米哚妥林对P糖蛋白介导的多药耐药的逆转作用

目的评价新型激酶抑制剂类抗癌药米哚妥林逆转P糖蛋白(P-gp)介导肿瘤细胞多药耐药的作用,并探讨其可能机制。方法米哚妥林0.5,1和5μmol·L-1分别加入P-gp高表达的K562/A02和K562细胞中培养72 h,MTS法测定细胞存活率以检测细胞毒性。米哚妥林0.125,0.25和0.5μmol·L-1在K562/A02和K562细胞中与无毒剂量的P-gp底物多柔比星、紫杉醇或长春新碱共培养72 h,MTS法测定细胞存活率以检测逆转耐药作用。米哚妥林0.5和10μmol·L-1与P-gp荧光底物罗丹明123在耐药和敏感细胞中共同孵育30 min后用流式细胞术分析底物积累的变化。米哚妥林0.5μmol·L-1与耐药和敏感细胞共同孵育72 h,Western印迹法检测耐药蛋白和信号分子的表达,定量PCR检测MDR1基因表达的变化。将米哚妥林与P-gp膜蛋白共孵育,化学发光法测定剩余ATP的量,检测米哚妥林对P-gp ATP酶活性的影响。结果米哚妥林对P-gp高表达的K562/A02和亲本敏感细胞K562的细胞毒性无明显的差异,其中米哚妥林0.5μmol·L-1时2种细胞的存活率均达80%以上。米哚妥林0.5μmol·L-1在细胞水平即可有效逆转K562/A02对多种底物的耐药,而对敏感细胞无显著作用;米哚妥林能显著抑制P-gp的外排作用,增加底物Rh-123在K562/A02细胞中的积累,且效果好于阴性对照维拉帕米0.5和10μmol·L-1;米哚妥林对P-gp基因和蛋白表达以及AKT和ERK的表达与磷酸化水平均无影响;米哚妥林对P-gp的ATP酶活性具有明显的抑制作用。结论米哚妥林可抑制P-gp介导的药物外排并逆转P-gp介导的肿瘤多药耐药。     

Cr(Ⅵ)对肝细胞线粒体ATP酶6和ATP酶8基因表达的影响以及与能量代谢障碍的关系

目的探讨Cr(Ⅵ)对肝细胞线粒体ATP酶6和ATP酶8基因表达水平与能量代谢的影响及其相互联系。方法用Cr(Ⅵ)2,8和32μmol·L-1分别处理体外培养的人胚L-02肝细胞24 h后,用细胞总RNA提取试剂盒分离RNA,线粒体ATP酶6和ATP酶8 mRNA表达水平用逆转录-荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定;细胞ATP含量、线粒体呼吸链复合体酶Ⅴ活性与细胞活性氧(ROS)含量分别用化学发光法、紫外分光光度法和荧光分光光度法检测。结果与正常对照组相比,Cr(Ⅵ)2,8和32μmol·L-1使ROS显著升高(P<0.05);与正常对照组相比,Cr(Ⅵ)2μmol·L-1可使ATP酶6和ATP酶8基因表达水平增高(P<0.05),Cr(Ⅵ)8和32μmol·L-1使之明显降低(P<0.05);而呼吸链复合体酶Ⅴ活性及细胞内ATP含量均随Cr(Ⅵ)浓度的增加而显著降低(P<0.05)。ATP酶6和ATP酶8基因表达与呼吸链复合体酶Ⅴ活性及细胞内ATP含量呈正相关(r=0.858,0.795,0.809,0.766,P<0.01),与ROS水平呈负相关(r=-0.738,-0.801,P<0.01)。结论 Cr(Ⅵ)能诱导肝细胞ATP酶6和ATP酶8基因表达水平改变,导致线粒体呼吸链复合体酶Ⅴ活性及细胞内ATP含量降低。     

金纳米粒子对CHO-K1细胞毒性的谷胱甘肽作用机制

目的探讨金纳米粒子(AuNP)对卵巢细胞CHO-K1的毒性作用及谷胱甘肽(GSH)的对抗作用。方法 AuNP 10～100μmol.L-1作用卵巢细胞CHO-K1 72 h,MTT比色法检测细胞存活。AuNP10μmo.lL-1,丁硫氨酸-亚砜亚胺(BSO)20μmo.lL-1及GSH 1 mmo.l L-1单独或联合作用细胞72 h,MTT比色法检测细胞增殖,倒置相差显微镜观察细胞形态,AnnexinⅤ-FITC和PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡;AuNP 10μmo.l L-1,BSO 20μmo.l L-1及GSH 1 mmo.l L-1单独或联合作用细胞48 h,共聚焦显微镜检测细胞骨架微丝,JC-1染色流式细胞仪检测线粒体膜电位。结果 AuNP 10～100μmo.lL-1对正常的CHO-K1细胞存活无明显影响。与正常对照组相比,AuNP 10μmol.L-1和BSO 20μmol.L-1联合作用,可明显抑制CHO-K1细胞存活,抑制率为(80±2)%(P<0.01),胞体皱缩、变圆,细胞骨架微丝破坏;凋亡率为(66±6)%(P<0.01);细胞线粒体膜电位显著增加(P<0.01);加入外源性的GSH可逆转AuNP对因细胞GSH水平受抑而产生的细胞毒性。结论 AuNP对CHO-K1细胞损伤可能与GSH水平降低有关。     

去甲斑蝥素诱导人卵巢癌SK-OV-3细胞发生有丝分裂期阻滞与凋亡

目的考察去甲斑蝥素(NCTD)对人卵巢癌SK-OV-3细胞生长的抑制作用,探究其诱导细胞发生有丝分裂期阻滞及凋亡的过程及相关性。方法 NCTD 30,60,120和240μmol.L-1分别作用人卵巢SK-OV-3细胞24,48和72 h后,MTT法检测细胞存活率;NCTD 60μmo.lL-1分别作用SK-OV-3细胞0,6,12和24 h后,流式细胞术测定细胞周期的变化;NCTD 60μmol.L-1分别作用SK-OV-3细胞0,6,12和24 h,倒置显微镜下检测其对细胞形态学变化的影响;Giemsa染色检测细胞核的变化;间接免疫荧光术结合激光扫描共聚焦显微镜技术检测细胞内微管分布及有丝分裂期纺锤体形成的影响。NCTD 60μmol.L-1分别作用12和36 h后,流式细胞术检测细胞凋亡情况;再将NCTD 60μmo.lL-1作用12 h后的细胞,采用温和的机械振荡法分离为悬浮细胞和贴壁细胞,继续作用24 h,流式细胞术及Giemsa染色检测分析两个时相两种细胞凋亡的影响。结果 MTT结果显示,NCTD 30～240μmol.L-1对SK-OV-3细胞的生长抑制作用存在明显的时间(P<0.05)和浓度依赖性(P<0.05);NCTD作用SK-OV-3细胞24,48和72 h的IC50分别为(261.3±2.4)μmo.lL-1,(48.3±1.7)μmol.L-1和(10.9±1.0)μmol.L-1。NCTD 60μmol.L-1分别作用于SK-OV-3细胞0,6,12和24 h,SK-OV-3细胞逐渐表现出G2/M期阻滞,呈时间依赖性;倒置相差显微镜下观察,NCTD引起SK-OV-3细胞逐渐收缩变圆,与周围细胞分离;Giemsa染色可见处于有丝分裂期的细胞显著增多,多个核细胞比例增多;免疫荧光染色发现,NCTD组细胞的微管系统受到干扰,有丝分裂期细胞纺锤体形成异常。NCTD作用细胞12和36 h凋亡率分别达20.4%和62.3%;将NCTD作用12 h的细胞,人工振荡分离为悬浮细胞和贴壁细胞,检测凋亡情况,同时检测继续作用24 h后两组细胞凋亡情况,发现处于有丝分裂间期的SK-OV-3细胞凋亡率大于处于有丝分裂期的细胞。结论 NCTD主要通过诱导人卵巢癌SK-OV-3细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡抑制细胞生长。干扰细胞有丝分裂过程中微管的组装和纺锤体的形成可能是NCTD诱导SK-OV-3细胞M期阻滞的原因之一。NCTD诱导的SK-OV-3细胞发生凋亡可不依赖细胞M期阻滞。     

雪胆素乙通过破坏微丝结构和促进p21~(Cip1)表达抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖

目的分析雪胆素乙(CuⅡb)对人前列腺癌PC-3细胞增殖及细胞周期的影响,探讨其作用机制。方法 MTS法检测CuⅡb 0.064～200μmol·L-1作用48 h后PC-3细胞增殖;CuⅡb 2和20μmol·L-1作用24 h,相差显微镜观察细胞形态;CuⅡb 2和20μmol·L-1作用48 h,流式细胞术分析细胞周期分布;免疫荧光染色分析CuⅡb 20μmol·L-1分别作用1,4和24 h后微丝和微管细胞骨架变化;免疫印迹法测定CuⅡb20μmol·L-1分别作用1,4和24 h后G肌动蛋白、F肌动蛋白、p21Cip1及细胞周期蛋白A,B1,E和D1的表达。结果 CuⅡb以浓度依赖方式抑制PC-3细胞的增殖(r=0.9817,P<0.05)。CuⅡb 20μmol·L-1作用48 h,使细胞周期阻滞于G2/M期,从溶剂对照组的(27.7±1.5)%上升为(45.3±1.8)%(P<0.01),相差显微镜见细胞发生明显收缩。CuⅡb 20μmol·L-1作用24 h,使G肌动蛋白水平显著下降,F肌动蛋白发生严重聚集(P<0.05),而对微管只有轻微影响。与溶剂对照组相比,CuⅡb 20μmol·L-1作用24 h后,细胞p21Cip1表达明显升高,细胞周期蛋白A表达显著下调,其他细胞周期蛋白表达上调(P<0.05)。结论 CuⅡb能明显抑制人前列腺癌PC-3细胞的增殖,其机制可能是通过诱导肌动蛋白聚集,破坏微丝骨架,促进抑癌因子p21Cip1表达,阻滞细胞周期的进程。     

抗抑郁新化合物SIPI-C和SIPI-F对PC12细胞内游离钙离子浓度的影响

目的研究抗抑郁新化合物SIPI-C和SIPI-F对PC12细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响,初步探讨其神经毒性的机制。方法 接种PC12细胞于经胶原Ⅰ包被的培养皿,加入钙离子荧光探针Fluo-3/AM染色后,用激光共聚焦显微镜分别记录①有钙外液中,10μmo.lL-1的SIPI-A,B,C和F对PC12细胞[Ca2+]i的影响;②有钙外液中,1,10和100μmol.L-1的SIPI-C和SIPI-F对[Ca2+]i的影响;③有钙外液中,硝苯地平10μmo.lL-1对10μmo.lL-1的SIPI-C或SIPI-F作用的影响;④无钙细胞外液中,10μmo.lL-1SIPI-C和SIPI-F对[Ca2+]i的影响。结果 有钙外液中,SIPI-A 10μmol.L-1给药后[Ca2+]i下降,10μmol.L-1的SIPI-B,SIPI-C和SIPI-F分别使[Ca2+]i增加27%(P<0.05),84%(P<0.05)和87%(P<0.01);SIPI-C和SIPI-F明显升高[Ca2+]i;同时给予SIPI-C 10μmol.L-1和硝苯地平10μmo.lL-1或SIPI-F 10μmo.l L-1和硝苯地平10μmo.lL-1,给药后荧光强度立即上升达到峰值,随后下降,[Ca2+]i分别增加24%和15%(P<0.05)。在无钙外液中,SIPI-C和SIPI-F 10μmo.lL-1分别使[Ca2+]i增加16%和18%(P<0.01)。结论 抗抑郁化合物SIPI-C和SIPI-F可以引起PC12细胞中[Ca2+]i显著增加,此影响可能与其神经毒性有关。     

穿琥宁抗炎作用的血红素加氧酶-1的信号转导机制

目的初步探讨穿琥宁抗炎作用的信号转导机制。方法用WST-8细胞计数试剂盒检测穿琥宁的细胞毒性;用IN Cell Analyzer 2000活细胞成像系统及组成型增强表达绿色荧光蛋白偶联NF-κBP65(EGFP-NF-κBP65)融合蛋白的CHO细胞和EGFP偶联促分裂原活化蛋白激酶APk2(EGFP-MAPK-APk2)融合蛋白的BHK细胞观察穿琥宁对白细胞介素1β(IL-1β)或肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导NF-κBP65核转位及脂多糖(LPS)诱导的P38MAPK下游分子MAPK-APk2核转位的影响;Western印迹法检测穿琥宁和血红素加氧酶-1(HO-1)特异性抑制剂锌原卟啉(ZnPP)对RAW264.7细胞HO-1、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶2(COX-2)表达的影响;Griess反应和ELISA法测定穿琥宁对RAW264.7细胞一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)生成的影响。结果穿琥宁3～100μmol·L-1作用24 h对RAW264.7细胞无细胞毒性。穿琥宁不能抑制由IL-1β诱导的NF-κBP65核转位和LPS诱导的MAPK-APk2核转位,对TNF-α诱导的NF-κBP65核转位有较弱的抑制作用,抑制率为20%,无明显浓度效应关系。穿琥宁3,10,30和100μmol·L-1作用4 h能诱导RAW264.7细胞HO-1表达,穿琥宁100μmol· L-1作用6 h显著抑制IL-1β诱导的COX-2表达和PGE2产生,作用12 h抑制iNOS表达和NO产生。HO-1活性抑制剂ZnPP能部分逆转穿琥宁的上述作用。结论穿琥宁的抗炎作用可能主要通过HO-1信号转导,继而抑制iNOS和COX-2的表达及NO和PGE2的产生。对NF-κB信号传导系统的调节作用尚不清楚。     

白藜芦醇和紫檀芪体外抗肿瘤转移作用

目的比较白藜芦醇和紫檀芪体外抗肿瘤转移作用。方法白藜芦醇和紫檀芪5～50μmol·L-1分别与小鼠黑色素瘤细胞B16F1和内皮细胞ECV304作用48 h,再分别用磺基罗丹明B染色法测定细胞增殖率。白藜芦醇和紫檀芪10μmol·L-1与细胞作用48 h,用划痕实验评价B16F1和ECV304细胞体外迁移能力,用明胶酶电泳和ELISA测定B16F1细胞分泌基质金属蛋白酶2(MMP-2)的活性和含量。用重建基底膜法观察白藜芦醇和紫檀芪10μmol·L-1作用24 h对ECV304细胞拟管腔形成的抑制作用。结果白藜芦醇和紫檀芪作用48 h均能显著抑制B16F1和ECV304细胞增殖,抑制B16F1细胞增殖的IC50分别为119.7μmol·L-1和37.3μmol·L-1,抑制ECV304细胞增殖的IC50分别为72.2μmol·L-1和37.2μmol·L-1。白藜芦醇和紫檀芪10μmol·L-1作用48 h,B16F1细胞愈合率分别为58.0%和36.8%,ECV304细胞愈合率分别为61.8%和28.9%,明显低于正常对照组的67.7%和88.4%(P<0.01),而且紫檀芪组明显低于白藜芦醇组(P<0.01)。与正常对照组相比,白藜芦醇和紫檀芪10μmo·L-1作用48 h使B16F1细胞MMP-2蛋白表达分别降低7.4%和13.9%(P<0.01),MMP-2活性分别降低19.3%和78.9%(P<0.01)。白藜芦醇和紫檀芪作用24 h均可使ECV304细胞管腔样结构破坏,且紫檀芪的作用较白藜芦醇更加明显。结论白藜芦醇和紫檀芪均具有抑制B16F1和ECV304细胞增殖和转移的作用,并能抑制ECV304细胞拟管腔形成;浓度为10μmol·L-1时紫檀芪的抑制作用强于白藜芦醇。     

cAMP-PKA信号通路对L02细胞药物代谢酶CYP3A的调控作用

目的 探讨cAMP-PKA信号通路对细胞色素P4503A(CYP3A)在正常肝细胞L02表达中的作用.方法 102细胞中分别加入8-溴-环腺苷酸(8-Br-cAMP)10μmol·L<'-1>及抑制剂H-8910μmol·L<'-1>,培养48 h,分别采用完整细胞免疫组化法、Western印迹法和红霉素-N-脱甲基法...