正常人和Duchenne肌营养不良肌细胞培养的研究

报道正常人和假肥大型肌营养不良（ＤＭＤ）患者肌细胞体外培养技术，对两者在细胞生物学、生化学及形态学上的不同特征进行了观察。结果表明，ＤＭＤ组在肌细胞培养的３个阶段均呈现异常，尤以肌管形成期最显著，ＤＭＤ肌细胞生肌能力差，多数不能发育成正常的有功能的肌管。     

周期性麻痹性副肌强直一家系临床及分子生物学特点

目的 报道1个伴永久性肌病的周期性麻痹性副肌强直汉族家系的临床特点,并对其热点基因进行突变分析.方法 收集1个伴永久性肌病的周期性麻痹性副肌强直汉族家系的病史、临床特点,并于发作间期对部分患者进行常规肌电图检查、运动和冷水试验;对该家系中部分成员成人骨骼肌钠通道的仅亚单位(SCN4A)基因进行突变分析.结果 该家系4代中有15例成员患病,同时表现出正常血钾性周期性麻痹和副肌强直的特点,临床表现严重,中年后进展为进展性肌病.肌电图可见强直放电,运动试验复合肌肉动作电位(CMAP)波幅下降>4JD%,冷水试验CMAP下降大于运动实验.基因分析发现SCN4A基因存在Met1592Val突变.结论 该家系为常染色体显性遗传,外显率完全,表现型与基因型的关系与国外报道大致一致,但表现型更为严重;肌电图运动试验和冷水试验是一种简单、可靠、易行的辅助诊断方法.周期性麻痹和副肌强直可由同一个突变所引起,对于伴有永久性肌病的周期性麻痹性副肌强直患者SCN4A Met1592Val可作为筛查对象.     

Ezrin蛋白在肌病患者骨骼肌中的表达及意义

目的 研究Ezrin蛋白在肌病患者骨骼肌中的表达及意义.方法 取肌纤维再生活跃的假肥大型肌营养不良(DMD,9例)和多发性肌炎(PM,5例)患者的骨骼肌标本,冰冻连续切片,进行HE染色及抗-Ezrin、抗-神经细胞黏附分子(NCAM)单克隆抗体免疫组化染色,观察被检肌的病理改变和Ezrin蛋白的表达.结果 DMD、PM患者被检肌HE染色所见再生肌纤维直径较小、核位于中央、胞浆嗜碱性;NCAM染色再生肌纤维深染;再生肌纤维Ezrin呈阳性表达,伴随肌纤维成熟Ezrin表达逐渐减弱,成熟肌纤维无Ezrin表达;成肌细胞Ezrin呈阳性表达.结论 Ezrin蛋白与DMD、PM肌病患者骨骼肌纤维再生可能存在密切关系.     

坏死性肌病

坏死性肌病是一种与炎症性肌病、特别是多发性肌炎（PM）相类似的肌病,其病因大多是肿瘤。主要表现为近端肢体对称性无力、肌肉疼痛;血清肌酶、尤其是肌酸磷酸激酶（CK）升高;病理学上有肌细胞的变性、坏死、再生,部分肌纤维有吞噬现象,但无或极少炎性细胞浸润,部分患者毛细血管壁增厚,呈杆状,上皮细胞内可出现包涵体;肌电图呈肌源性损害;大部分患者对类固醇激素反应良好。目前为止,本病个案报告已有10余篇,40余例。现结合文献综述如下。     

MAPK/ERK激酶-ERK信号通路参与外源性bFGF对缺氧-复氧损伤后星形胶质细胞内Egr-1结合活性的调节

目的 静脉注射碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）可以明显降低实验性脑缺血大鼠的脑梗死面积,但该作用的分子机制尚不清楚。本文旨在研究外源性bFGF 作用的信号转导通路。方法缺氧-复氧损伤星形胶质细胞。Western blot检测外源性bFGF作用后丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶激酶（mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase,MEK）-细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK） 信号通路活化。电泳变动迁移率分析实验检测外源性bFGF 作用后核转录因子早期生长反应因子-1（early growth respons factor 1, Egr-1）的结合活性变化。结果外源性bFGF可以保护胞外信号调节激酶MEK-ERK信号通路蛋白不被氧自由基降解。MEK-ERK信号通路在外源性bFGF作用后活化。这一信号通路进一步使Egr-1结合活性升高。结论外源性bFGF可能通过激活ERK信号通路,促进内源性转录因子Egr-1的结合活性升高,进而促进内源性bFGF的表达。     

抑郁症患者脑源性神经营养因子Val66Met多态性与血清浓度的关系

目的探讨脑源性神经营养因子（BDNF）基因Val66Met多态性与抑郁症之同的关系以及Val66Met多态性是否影响血清BDNF浓度。方法对76例未经药物治疗的抑郁症患者和50例正常人,用限制性片段长度多态性方法分析Val66Met多态性,采用酶联吸附反应方法对血清BDNF浓度进行检测。结果（1）抑郁症患者血清BDNF浓度（24．7±12．7）ng／m1显著低于正常对照组（36．6±16．4）pg／m｜,差异有统计学意义（P〈0．01）;（2）抑郁症组和对照组之间的Val66Met多态性位点的等位基因频率和基因型分布差异无统计学意义（P〉0．05）;（3）在抑郁症组和对照组,Val／Met＋Met／Met基因型组与Val／Val基因型相比,血清BDNF浓度差异无统计学意义（P〉0．05）。结论抑郁症患者存在较低的血清BDNF水平,BDNF基因Val66Met多态性与抑郁症之间无相关性,Val66Met多态性对血清BDNF水平浓度无明显影响。     

肢带型肌营养不良2B型与多发性肌炎的临床及病理鉴别诊断

目的 分析肢带型肌营养不良2B型(LGMD2B)与多发性肌炎(PM)的临床、病理诊断与鉴别诊断要点.方法 对8例首诊为PM,再诊时高度怀疑LGMD2B的患者做开放式骨骼肌活体组织检查,行组织化学及抗dysferlin、dystrophins、sarcoglycans、MHC-Ⅰ、CD8单克隆抗体免疫组织化学染色,与4例PM进行临床、病理对比分析.结果 (1)组织化学染色2组患者均呈不同程度的肌纤维变性、坏死,炎细胞浸润;临床可疑LGMD2B患者dystrophins、sarcoglycans蛋白表达正常,dysferlin蛋白表达缺失,MHC-Ⅰ弱或阴性表达,少数炎细胞CD8阳性表达,因此确诊为LGMD2B;4例PM患者肌纤维膜上dysferlin蛋白表达正常,MHC-Ⅰ在肌纤维膜及炎细胞浸润区呈强阳性表达,部分炎细胞CD8阳性表达.(2)LGMD2B与PM临床均表现为近端肌无力,血肌酸激酶显著增高,肌电图呈肌源性异常.LGMD2B肌痛不明显,红细胞沉降率、C反应蛋白正常,有别于PM.结论 LGMD2B与PM在临床、骨骼肌组织化学染色病理上相似,易误诊;LGMD2B患者dysferlin蛋白表达缺失及PM患者的MHC-Ⅰ、CD8强阳性表达可作为两者诊断与鉴别诊断的重要方法.     

骨骼肌钠通道α1亚基基因R1129Q新突变导致正常钾和低钾性周期性瘫痪一家系

目的 报道1个骨骼肌钠通道α1亚基(SCN4A)基因新突变导致的正常钾和低钾性周期性瘫痪家系的临床和病理改变特点.方法 本家系为常染色体显性遗传,共有9例患者,男性4例,女性5例,发病年龄7～25岁.5例患者为正常钾性周期性瘫痪,其中4例伴随肌强直症状;3例患者为低钾性周期性瘫痪;1例发作时血钾浓度不详.对先证者进行左肱二头肌活体组织检查.先证者和7例家系患者、3名无症状家系成员以及50名健康人行SCN4A基因测序.结果 先证者的肌纤维出现轻度肥大和萎缩,伴随核内移和肌纤维内空泡,部分肌纤维内氧化酶分布异常.所有患者均存在SCN4A基因的R1129Q突变,3名无症状家系成员以及50名健康对照无此突变.结论 SCN4A基因R1129Q新突变在同一家系内可以导致低血钾性和正常血钾性周期性瘫痪共存.     

骨骼肌钠通道α1亚基基因R1129Q新突变导致正常钾和低钾性周期性瘫痪一家系

目的 报道1个骨骼肌钠通道α1亚基(SCN4A)基因新突变导致的正常钾和低钾性周期性瘫痪家系的临床和病理改变特点.方法 本家系为常染色体显性遗传,共有9例患者,男性4例,女性5例,发病年龄7～25岁.5例患者为正常钾性周期性瘫痪,其中4例伴随肌强直症状;3例患者为低钾性周期性瘫痪;1例发作时血钾浓度不详.对先证者进行左肱二头肌活体组织检查.先证者和7例家系患者、3名无症状家系成员以及50名健康人行SCN4A基因测序.结果 先证者的肌纤维出现轻度肥大和萎缩,伴随核内移和肌纤维内空泡,部分肌纤维内氧化酶分布异常.所有患者均存在SCN4A基因的R1129Q突变,3名无症状家系成员以及50名健康对照无此突变.结论 SCN4A基因R1129Q新突变在同一家系内可以导致低血钾性和正常血钾性周期性瘫痪共存.     

不同浓度胰岛素对小鼠神经干细胞分化的影响

目的 体外培养获得神经干细胞并初步探讨不同浓度胰岛素对神经干细胞分化能力的影响。方法 小鼠胎脑细胞体外培养获得神经干细胞,并行免疫荧光检测鉴定。25ng／ml、50ng／ml、100ng／ml、125ng／ml、150ng／ml胰岛素诱导分化后,免疫荧光染色观察不同浓度胰岛素对神经干细胞分化的影响。结果 体外培养的神经球表达巢蛋白（nestin）,神经球分化的细胞表达神经丝和胶质纤维酸性蛋白。不同浓度胰岛素作用下的神经元分化率有差别。其中100ng／ml组的分化率最高。结论 体外培养的细胞为神经干细胞,100ng／ml浓度的胰岛素可以起到较好的促进神经元分化的效果。     

Permanent myopathy caused by mutation of SCN4A Metl592Val: Observation on myogenesis in vitro and on effect of basic fibroblast growth factor on the muscle

Objective

The present study is to observe in vitro the proliferation ability of the muscle cells from permanent myopathy (PM) patients of nomokalaemic periodic paralysis (normKPP), which is caused by mutations of Met1592Val in the skeletal muscle voltage gated sodium channel (SCN4A) gene on chromosome 17q23.1. We also evaluate the possible effect of the foreign basic fibroblast growth factor (bFGF) in preventing and curing PM.

Methods

The gastrocnemius muscle cells were taken from two male patients with PM of the same Chinese family with Met1592Val mutation of SCN4A, determined by gene screening. Four male patients suffering from the skeletal injury without PM were taken as control. All preparations were protogenerationally cultured in vitro. Proliferation of the cultured preparations was measured by MTT. Activities of the lactic dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK), and protein content in these cells were also detected. The effects of bFGF with different doses (10 ng/mL, 20 ng/mL, 40 ng/mL, 80 ng/mL, 120 ng/mL and 160 ng/mL) on the above mentioned parameters were also evaluated.

Results

Cells from both PM and control subjects were successfully cultured in vitro. The cultivation of the muscle cells from PM patients in vitro was not yet seen. Results indicated the obvious stimulation of bFGF on cell proliferation, activities of LDH and CK, protein synthesis, in a dose dependent manner. The optimal dose of bFGF was 120 ng/mL (P<0.05), beyond which greater dose caused a less effect. The effect of bFGF on 160 ng /mL was stronger than that on 80 ng/mL, but there was no significant difference (P>0.05).

Conclusion

Myoblastic cells from patients with PM had a weaker ability of developing into the myotubules, thus they were unable to perform effective regeneration, which resulted in a progressive necrosis. The exogenous bFGF could promote the division and proliferation of the muscle cells in vitro. These results shield a light on bFGF’s potential role in preventing and treating PM.     

β-淀粉样蛋白对体外培养的血管平滑肌细胞的作用及同型半胱氨酸对其影响

目的观察同型半胱氨酸（Hcy）对受β-淀粉样蛋白1-40（Aβ1-40）作用的体外培养的血管平滑肌细胞（VSMC）的影响。方法取大鼠主动脉段,体外进行培养,分别加入不同浓度Aβ1-40和同型半胱氨酸,光镜下观察细胞数量及形态,利用MTT法观察细胞增殖及细胞活力,流式细胞技术检测观察细胞凋亡情况,SOD以及H2O2试剂盒分别检测细胞超氧化物歧化酶的活力以及过氧化氢产生情况。结果（1）光镜下观察可见,Aβ1-40、Hcy与血管平滑肌细胞共同培养时细胞较Aβ1-40单独作用时明显减少;（2）MTT结果显示Aβ1-40抑制体外培养的血管平滑肌细胞的增生并可致其凋亡,在有同型半胱氨酸存在的时候Aβ1-40对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用以及促进凋亡作用都有增加,此作用具有时间及浓度依赖性;（3）SOD活力以及H2O2检测示Aβ1-40、Hcy共同作用时SOD活力以及H2O2含量较Aβ1-40单独作用时明显增加。结论同型半胱氨酸对于β-淀粉样蛋白1-40所致的体外培养血管平滑肌细胞损伤有促进作用。     

VEGF在人胚胎干细胞向神经元分化中作用的研究

目的观察血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）在人胚胎干细胞分化为神经元过程中是否发挥作用及相关机制。方法人胚胎干细胞经拟胚体向神经元分化,分为3组：A组为常规诱导组,B组为常规诱导＋VEGF（10ng／mL）作用组,C组为常规诱导＋VEGF（10ng／mL）＋VEGFR2／Fc嵌合体（10ng／mL）作用组;用RT-PCR、免疫荧光法检测各阶段细胞标志物,计算并用流式细胞仪检测各组不同阶段细胞阳性率。结果用RT-PCR分别检测到OCT4、Nestin、MAP2表达;免疫荧光法检测显示B组产生神经干细胞、分化为神经元的阳性率明显高于A、C两组,差异有统计学意义（P〈0．01）,A、C两组之间无显著性差异（P〉0．05）;流式细胞仪检测与免疫荧光法相似。结论人胚胎干细胞体外分化过程中血管内皮生长因子通过血管内皮生长因子受体2来促进神经干细胞增殖及向神经元分化。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向GABA能神经元分化

目的研究骨髓间充质干细胞（BMSCs）在体外向γ-氨基丁酸（GABA）能神经元方向的分化。方法大鼠股骨骨髓分离出BMSCs,培养传代,通过10%胎牛血清（FBS）、20 ng/ml表皮生长因子（EGF）和改良Eagle培养基（DMEM/F12）预诱导24 h,随之加入含10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、10 ng/ml骨形成蛋白-2（BMP-2）和10 ng/ml脑源性神经营养因子（BDNF）作用48 h后,再以10μmol/L全反式维甲酸（ATRA）培养48 h,最后用40 mmol/L KCl刺激15 min完成诱导分化。对照组用10%FBS和DMEM/F12培养不添加任何诱导因子。形态学观察和Western blot对分化后的细胞进行鉴定分析。结果实验组细胞在形态学上表现出典型的神经元样细胞形态,对照组无明显变化;Western blot分析知实验组Ⅰ和实验组Ⅱ都有分化为GABA能神经元的趋势,但实验组Ⅱ的分化率高于实验组Ⅰ。结论BMSCs可在体外分化为GABA能神经元。     

bFGF和BDNF对小鼠神经干细胞体外增殖分化的影响

目的观察碱性成纤维生长因子（bFGF）和脑源性神经生长因子（BDNF）对小鼠源性神经干细胞（NSCs）体外增殖及分化的影响。方法用无血清培养与单克隆技术对小鼠胚胎脑组织进行分离、培养,根据培养液中所加营养因子的不同将传代的NSCs分为bFGF组、BDNF组、bFGF＋BDNF组,观察不同组别对NSCs的定向分化作用。结果与bFGF和BDNF组相比,bFGF＋BDNF组细胞分化为神经元的比例较高（P〈0.05）。结论 bFGF可以提高BDNF诱导小鼠NSCs向神经元分化的比例。     

骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化前后BMP4基因差异表达的初步研究

目的初步探讨骨髓基质干细胞（BMSC）向神经元样细胞分化前后骨形态发生蛋白4（BMP4）基因的表达变化情况。方法体外培养大鼠BMSC,用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）对其进行诱导,分别于诱导前和诱导后第7天行基因芯片检测BMP4基因表达水平,并采用实时定量PCR进行验证。结果在BMSC向神经元样细胞诱导分化后的芯片表达谱中,BMP4基因的表达明显上调,且实时定量PCR亦证实此结果。结论在BMSC向神经元样细胞的分化过程中,BMP4基因可能发挥着重要的作用。     

骨髓基质细胞分化为神经元样细胞后与皮质神经元间突触的建立

目的 观察与大脑皮质神经元共培养的骨髓基质细胞(BMSCs)经诱导分化成神经元样细胞后,与脑皮质神经元之间形成功能性突触的情况.方法 无菌条件下取绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓,用贴壁筛选法体外培养获得GFP转基因小鼠BMSCs(GFP-GM-BMSCs),在体外培养、扩增、纯化.取第3代GFP-GM-BMSCs,种植到源于小鼠大脑的原代皮质神经元和胶质细胞中,培养介质为加有20 ng/mL表皮生长因子(EGF)、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清培养基(Neurobasal-A+2%B27),体外模拟建立细胞移植的共培养体系.共培养第10天,利用FM1-43荧光染料染色活动突触小泡的特性,通过荧光显微镜观察共培养的两种细胞之间形成的突触.结果 与神经元共培养的GFP-GM-BMSCs在含有EGF、bFGF的无血清培养基中7 d后分化为神经元样细胞.共培养10 d后,FM1-43染色阳性的突触囊泡明显增加,主要位于神经元样细胞胞体、突起及其末端结构上.结论 在体外模拟细胞移植共培养体系中,分化自GFP-GM-BMSCs的神经元样细胞能与神经元之间形成突触样连接.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向神经元样细胞分化的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）离体分离和培养方法,探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、全反式维甲酸（RA）、神经营养因子（BDNF）在体外诱导BM—SCs向神经元样细胞分化的作用。方法采用出生3周SD大鼠的全骨髓细胞进行培养,传至第3代时,分为三组：A组,bFGF＋EGF＋RA进行诱导分化;B组,BDNF＋RA进行诱导分化;C组,RA诱导分化。在倒置显微镜下每日观察、记录BMSCs的诱导分化情况,并应用免疫细胞化学技术对细胞进行兔抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）单抗鉴定。结果A组诱导5d后有大部分细胞具备神经元样细胞形态,胞体呈锥形或圆形,有较长单极或多极的突起,有NSE阳性细胞表达。而B组可有部分NSE阳性细胞、C组细胞有少量NSE阳性细胞。结论bFGF＋EGF＋RA、BDNF＋RA和RA均可在诱导BMSCs向神经样元细胞分化,bFGF＋EGF＋RA组更优于和BDNF＋RA组及RA组。     

免疫磁珠法分离、培养人脑胶质瘤干细胞

目的建立免疫磁珠法分离，并培养人脑胶质瘤干细胞的方法。方法将术中取得的脑胶质瘤标本，通过剪切、消化和吹打成单细胞悬液，筛网过滤，免疫磁珠分选试剂盒分选出CD133^＋细胞，用神经干细胞无血清培养法培养出具有单细胞克隆能力的细胞球，取第3代进行诱导分化，分化前后用免疫细胞荧光化学方法鉴定肿瘤干细胞及分化后细胞。结果免疫磁珠分选出的CD133^＋细胞，可悬浮生长并形成神经干细胞样细胞球，有较强的增殖能力，干细胞标志物巢蛋白（nestin）阳性，分化后细胞表达神经元小管相关蛋白β-3（β-tubulin3）和星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白质（GFAP）特异性抗原，而巢蛋白、CD133^＋阴性，并具有肿瘤的核型。结论免疫磁珠分选法可避免原代培养中众多细胞混杂生长的发生，能够从大量肿瘤细胞中分离出只占极少比例的肿瘤干细胞，细胞结合磁珠后在体外可以长期培养和传代，进一步证实了肿瘤干细胞的存在，并为胶质瘤干细胞的研究奠定基础。     

细胞外基质成分对于平滑肌表型及增殖的影响

目的观察层粘连蛋白（LN）、纤维连接蛋白（LN）、Ⅳ型胶原蛋白（collagenⅣ,ColⅣ）等细胞外基质成分对于体外培养平滑肌细胞（VSMC）表型转化和增殖活性的影响。方法将原代和传代培养的大鼠主动脉VSMC分别接种于不同细胞外基质蛋白包被的培养板上,作用24、48、72h后,以RT—PCR和Western blot法检测VSMC表型标志平滑肌肌动蛋白（SMA-α）、骨桥蛋白（OPN）mRNA和蛋白表达水平,MTT法检测VSMC增殖活性。结果与对照组相比,LN包被组SMA-α基因及蛋白表达增强,OPN则表达减弱,且可维持48h以上,于72h后,与对照组趋于一致,FN包被组OPN基因及蛋白表达增强,SMA-α表达减弱,ColⅣ包被组SMA-α、OPN与对照组无统计学意义,FN组增殖活性显著增强,并与作用时间呈正比,LN包被组与ColⅣ包被组对VSMC增殖活性无明显影响。结论LN可延迟VSMC表型转化,FN则促进VSMC表型转化与增殖,细胞外基质成分对于VSMC表型转化和增殖具有重要的调节作用。