趋化因子受体7基因绿色荧光慢病毒载体构建及在未成熟树突状细胞中的表达

背景：趋化因子受体7（chemokine receptor-7,CCR7）是树突状细胞从外周迁移至淋巴系统发挥作用的最重要的启动和调节者,但未成熟树突状细胞表面不表达CCR7,因此利用携带CCR7基因的未成熟树突状细胞可以更好地诱导免疫耐受。目的：构建携带小鼠CCR7基因的绿色荧光蛋白重组慢病毒载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达。方法：采用RT-PCR扩增小鼠CCR7基因并克隆至pCR-Blunt载体。将CCR7DNA片段及IRES-GFP连入慢病毒转移质粒LV-Lac,生成重组慢病毒质粒LV-CCR7。采用脂质体转染法将慢病毒系统3质粒（重组慢病毒质粒LV-CCR7、包装质粒ΔNRF及包膜质粒pVSVG）共转染包装慢病毒,重组慢病毒感染未成熟树突状细胞,光学显微镜观察细胞状态,流式细胞术鉴定CCR7蛋白的表达。结果与结论：实验成功扩增出小鼠CCR7DNA片段并克隆至pCR-Blunt载体,亚克隆构建慢病毒表达载体LV-CCR7,经3质粒包装系统感染293FT细胞后,24h于荧光显微镜下均观察到绿色荧光蛋白阳性表达,病毒滴度为108U/L以上,获得携带CCR7基因的重组慢病毒。慢病毒颗粒可有效感染未成熟树突状细胞,荧光显微镜可见大量GFP蛋白表达,阳性细胞达50%,流式细胞术检测到CCR7蛋白表达,LV-CCR7基因修饰的未成熟树突状细胞仍保持在未成熟状态。结果证实,实验成功构建携带小鼠CCR7基因绿色荧光慢病毒载体LV-CCR7,并可在未成熟树突状细胞细胞中表达。     

携带人VE-cadherin基因的慢病毒载体的构建及其在Sup-B15白血病细胞株的表达

本研究旨在构建携带人血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)基因的重组慢病毒载体及探讨VE-cadherin蛋白在Sup-B15细胞中的表达。采用RT-PCR扩增人VE-cadherin基因并克隆至pCR-Blunt载体。将VE-cadherinDNA片段连入慢病毒转移质粒pLB,生成重组慢病毒质粒pLB-VEC。用三质粒共转染法包装慢病毒,重组慢病毒感染Sup-B15细胞,在光学显微镜下观察细胞状态,用流式细胞术及Western blot法鉴定VE-cadherin蛋白表达。结果表明,成功扩增出人VE-cadherinDNA片段并克隆至pCR-Blunt载体;亚克隆构建慢病毒载体pLB-VEC。经三质粒包装系统包装后获得高滴度慢病毒颗粒,体外可有效感染Sup-B15细胞。感染后细胞发生明显的形态改变,流式细胞术及Western blot检测到VE-cadherin蛋白表达。结论 :成功构建携带人VE-cadherin基因的慢病毒载体pLB-VEC,并可在Sup-B15白血病细胞株获得有效的表达。     

截短型小鼠成纤维细胞生长因子受体-1基因慢病毒载体构建及在真核细胞中的表达

本研究旨在克隆小鼠成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,fgfr1)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的截短型fgfr1(△fgfr1)重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以BALB/c胎鼠脑组织为模板克隆全长型fgfr1基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,通过反向PCR技术删除胞内磷酸化区域获得△fgfr1,限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移质粒,构建携带EGFP及△fgfr1双顺反子自身失活型重组慢病毒表达质粒,通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,用荧光显微镜及流式细胞术(FCM)检测EGFP的表达,免疫印迹法(Western blot)鉴定截短型FGFR1蛋白表达。结果表明,成功克隆小鼠fgfr1基因,构建重组慢病毒转移载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1及对照载体LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度达到108 TU/ml。以重组病毒载体转染293FT细胞后第4天在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测转染效率可达95%,Western blot检测显示,转染后293FT细胞表达截短型FGFR1蛋白。结论:成功构建了自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1,并在真核细胞中获得表达。     

小鼠CXCR4基因慢病毒载体构建与真核表达

本研究旨在克隆小鼠CXC型趋化因子受体4（CXCR4）基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的CXCR4重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）以C57BL／6小鼠骨髓细胞为模板克隆全长型CXCR4基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,经限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移载体,构建携带EGFP及CXCR4双顺反子结构的自身失活型重组慢病毒表达质粒;同时构建LV-IRES-EGFP作为对照质粒;通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,采用荧光显微镜和流式细胞术（FCM）检测EGFP的表达,Western blot鉴定CXCR4蛋白表达。结果表明,成功克隆小鼠CXCR4基因,构建重组慢病毒转移质粒LV-IRES-EGFP-CXCR4及对照质粒LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度可达到10^8TU／ml。以重组慢病毒颗粒感染293Fr细胞后第3天,在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测显示感染效率可达95％,FCM及Western blot结果显示感染后293Fr细胞表达CXCR4蛋白。结论：成功构建自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-CXCR4,并在真核细胞中获得表达。     

Tiam1基因慢病毒表达载体构建及其在HT29细胞中的表达

目的:构建Tiam1与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒表达载体,观察其在人结直肠癌HT29细胞中的表达.方法:通过酶切Tiam1/C1199HA质粒获得Tiam1 cDNA片段,并将其克隆到慢病毒载体表达质粒pCDF1-copGFP中,经酶切、测序鉴定.慢病毒表达质粒和包装质粒共转染293FT细胞,获得携带Tiam1和GFP融合基因的重组慢病毒.取病毒上清感染人结直肠HT29细胞株,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白及免疫细胞化学检测Tiam1在靶细胞中的表达.结果:重组慢病毒质粒pCDF1-Tiam1-copGFP酶切鉴定结果与目的基因条带吻合,克隆测序结果与NCBI收录的Tiam1基因序列(NM_003253)完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染293FT细胞,病毒包装效率为88.34%.收获慢病毒上清可高效感染HT29细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光,感染效率为55.89%,感染后靶细胞中Tiam1稳定高表达.结论:成功构建了携带Tiam1与GFP融合基因的慢病毒表达栽体pCDF1-Tiam1-copGFP,并使目的基因在靶细胞中得到稳定表达,为进一步研究Tiam1基因的相关功能提供了优质的稳定转染载体.     

携带小鼠RORγt基因慢病毒载体的构建及其在293FT细胞中的表达

本研究构建携带小鼠ROFγt和glp基因的重组慢病毒载体,检测RORγt蛋白在293FT细胞中的表达。用RT-PCR扩增小鼠RORγt基因,将其克隆至PCR2.1T载体,酶切制备RORγtDNA片段,插入MigR1质粒后将RORγt-IRES-GFP定向连入慢病毒转移质粒pTK208,生成pXZ9-RORγt。用脂质体介导三质粒共转染法转染293FT细胞,荧光显微镜下观察GFP表达情况,以Western blot鉴定RORγt的表达。结果表明,RT-PCR扩增出RORγt基因并克隆入PCR2.1T载体;经亚克隆构建了慢病毒转移质粒XZ9-RORγt。质粒经脂质体转染293FT细胞获慢病毒颗粒,慢病毒颗粒体外高效感染293FT细胞,感染后Western blot检测到RORγt蛋白表达。结论：成功构建慢病毒载体pXZ9-RORγt,并在293细胞内获得表达。     

IGFBP7基因慢病毒载体的构建及在K562细胞中的表达

本研究构建胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)基因的慢病毒载体,为研究该基因在白血病中的作用提供基础。采用限制性内切酶酶切获得目的基因,基因重组构建慢病毒载体质粒venus-IGFBP7,用293T细胞包装慢病毒颗粒,感染K562细胞,并采用多种方法鉴定。结果表明,所获IGFBP7基因经测序与GenBank比对序列一致,慢病毒载体质粒venus-IGFBP7经BamHⅠ酶切鉴定片段大小正确,荧光显微镜及流式细胞术检测到绿色荧光蛋白在293T及K562细胞中表达,RT-PCR和Western blot检测到IGFBP7 mRNA和蛋白在K562细胞表达。结论:成功构建带有IGFBP7基因的慢病毒载体,为研究IGFBP7基因在K562细胞中的作用奠定了基础。     

PTEN基因重组慢病毒的构建

目的:构建PTEN基因重组慢病毒,转染真核细胞Ishikawa并检测PTEN基因在真核细胞内的表达.方法:分子克隆重组人PTEN基因与含有CMV启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体PLIG,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.将重组子PLIG-PTEN和包装质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,感染子宫内膜癌细胞株Ishikawa,观察慢病毒表达载体所携带的GFP基因在细胞内的表达,使用RT-PCR和western-blot检测PIEN基因在细胞内的表达水平.结果:PCR和测序证实,成功克隆慢病毒载体PLIG-PTEN,包装慢病毒,感染真核细胞Ishikawa后48 h,观察到绿色荧光的广泛表述并检测出宿主细胞内表达的PTENmRNA成功表达PTEN蛋白.结论:本实验成功地构建了人PTEN基因慢病毒载体,并观察到PTEN基因在真核细胞中的成功表达.     

慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达

本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统,并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道(PPT)元件、泛醌启动子(PUB)和绿色荧光蛋白基因(GFP)连接至pLO134载体,构建成pTK153载体。之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统(包括包装质粒△NRF、转移质粒pTK153和包膜蛋白质粒VSV-G)共转染293T细胞,12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞,在荧光显微镜下和应用流式细胞仪(FACS)观察感染情况。结果表明:慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,FACS分析转染效率为(63.04±7.24)%,病毒滴度测定为(3.09±0.61)×106U/ml。感染小鼠T淋巴细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达,FACS分析转导效率为(37.98±6.26)%。结论:成功构建了含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体,对小鼠T淋巴细胞有较高的感染效率。     

核糖体蛋白L8重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建鼠核糖体蛋白L8(RPL8)基因的重组腺病毒载体,为转染小鼠树突状细胞(DC)为制备DC疫苗奠定基础。方法:用RT-PCR克隆目的基因RPL8,与载体连接、酶切、插入、并转移到pAdxsi腺病毒骨架载体上,包装扩增成腺病毒颗粒。用重组腺病毒及空病毒Ad-EGFP(作为阴性对照)转染小鼠DC细胞,荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白的表达。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建了携带RPL8基因的重组腺病毒载体,并制备出高滴度(1.6×1010PFU/mL)的重组腺病毒。结论:成功构建了携带RPL8的重组腺病毒,为进一步研究RPL8基因修饰DC疫苗奠定基础。     

人GLIPR-2基因慢病毒RNAi载体的构建及鉴定

目的 构建人GLIPR-2基因慢病毒RNA干扰（RNAi）载体,并鉴定其感染人肝癌细胞系HepG2后缺氧条件下的GLIPR-2基因表达变化.方法 根据GLIPR-2基因序列合成siRNA片段,克隆至慢病毒载体pMAGic7.1上,转染293T细胞进行包装,收获并浓缩重组慢病毒颗粒.感染HepG2细胞,流式细胞术检测GFP的表达率,并用Western blot检测目的 蛋白在缺氧条件下的表达变化.结果 重组RNAi质粒pMAGic7.1-shRNA-GLIPR-2经菌落PCR鉴定及测序证实构建正确;稳定感染HepG2 细胞后,GFP的表达率为分别为84.48%、69.97% 和39.82%;Western blot结果显示慢病毒转染组GLIPR-2蛋白的表达水平较对照组明显降低.结论成功构建了GLIPR-2基因慢病毒RNAi载体,该载体在缺氧条件下可明显抑制目的 蛋白在HepG2细胞中表达,为进一步研究GLIPR-2的生物学功能奠定了基础.     

小鼠单核巨噬细胞Ufm1基因shRNA慢病毒载体构建及鉴定

目的 构建小鼠Ufm1基因RNA干扰慢病毒载体,并实现该基因在小鼠单核巨噬细胞系（RAW264.7）中的稳定表达抑制.方法 根据小鼠Ufm1基因设计两条RNA干扰序列,合成靶序列双链DNA,与pFU-GW-RNAi载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.pFU-GW-RNAi载体、pHelper 1.0载体及pHelper 2.0载体共转染293T细胞包装产生慢病毒颗粒,并测定其滴度,随后感染RAW264.7细胞,建立稳定转染细胞株.将RAW264.7细胞分为空白组、阴性对照组及RNA干扰慢病毒感染组,用Real-time PCR检测Ufm1基因mRNA的表达量.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,shRNA片段完全正确插入慢病毒载体pFU-GW-RNAi中.在荧光显微镜下观察可见,293T细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为9×105 TU/μl.重组慢病毒感染RAW264.7后,用Real-time PCR检测到Ufm1基因mRNA的表达受到抑制.结论 成功构建了小鼠RNA干扰慢病毒载体,并能够在RAW264.7细胞中有效沉默靶基因.     

携带人OCT4A基因的慢病毒载体的构建及其稳定转染K562白血病细胞株的建立

本研究旨在构建共表达人OCT4A与绿色荧光蛋白（GFP）慢病毒载体pLVX-OCT4A-ZsGreen1,并通过感染获得稳定表达重组质粒的白血病K562细胞系,观察OCT4A在其中的表达。根据Gen Bank数据库提供的OCT4A mRNA序列,合成编码mRNA基因的特异性引物序列,通过RT-PCR技术扩增出OCT4A全长片段,克隆至pCR-Blunt载体。将OCT4A DNA片段酶切回收后克隆至经EcoR1酶切线性化的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1,构建pLVX-OCT4A-ZsGreen1慢病毒重组质粒,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确。经三质粒包装系统包装后获得高滴度慢病毒颗粒并感染人白血病细胞系K562,通过流式细胞仪分选获得稳定表达的白血病细胞系,应用Real-time PCR和Western blot方法分别检测稳定转染细胞系的OCT4A mRNA和OCT4A蛋白表达。应用CCK-8法和平板细胞克隆形成试验测定OCT4A对K562细胞增殖能力的影响。结果表明,经限制性内切酶检测及基因测序证实成功构建了携带OCT4A基因的重组慢病毒;包装病毒颗粒超速离心后病毒滴度达（1.43±0.25）×10^8U/ml;病毒感染K562细胞后经流式细胞仪分选获得GFP＋细胞,实时定量PCR及Western blot证实病毒感染后OCT4A基因及蛋白的表达可有效上调;CCK-8法及平板集落形成试验显示病毒感染的K562细胞体外增殖活性明显升高,与对照组相比均有统计学差异（P〈0.05）。结论：成功构建了表达OCT4A基因的慢病毒载体,并且获得可稳定上调OCT4A表达的K562细胞株。     

碱性成纤维细胞生长因子-慢病毒真核表达载体的构建及转染

背景：以往研究多采用质粒载体,由于其转染效率不高,且转染时需借助脂质体转染剂进行转染,转染具有细胞毒性,操作复杂等难以应用于临床。目的：构建携带人碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）基因的慢病毒载体,转染成骨方向诱导的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,鉴定bFGF基因表达。方法：实验组：设计人bFGF基因引物,用Trizol法提取胎盘组织RNA,用RT-PCR的方法扩增出bFGF基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO表达质粒,经Xho-Ⅰ、BamH-Ⅰ双酶切和DNA测序证实质粒正确构建。在脂质体转染剂Lipofectamine2000的介导下,将bFGF-pLenti6/V5-D-TOPO表达质粒同包装质粒pLP1、pLP2、包膜质粒pLP/VSVG共转染293FT细胞株,收集bFGF-慢病毒上清转染诱导后第2代的兔BMSCs。对照组：设计GFP基因引物,以GFP-PMSLV-Plazmid为模板,PCR的方法扩增出GFP基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO表达质粒,构建GFP-慢病毒载体,并转染BMSCs。RT-PCR和Wetern-blot方法检测bFGF、GFP基因的表达。结果与结论：转染48h后,对照组BMSCs可见绿色荧光蛋白表达;实验组BMSCs在转染15d后,RT-PCR方法扩增出bFGF基因,Western-blot检测出目的蛋白表达。提示成功构建携带人bFGF和GFP基因的真核表达载体,建立转染兔BMSCs的方法。     

Beclin1基因慢病毒表达载体的构建和鉴定

背景：Beclin 1基因是哺乳动物的自噬调控基因。目的：实验拟构建Beclin 1基因慢病毒过表达载体。方法：聚合酶链反应扩增目的基因Beclin 1后插入慢病毒表达载体pLenex中,构建重组载体pLenex-Beclin 1。使用聚合酶链反应、双酶切和DNA的测序方法对其进行鉴定,并与辅助包装质粒共感染293T细胞。慢病毒颗粒转染非小细胞肺癌A549细胞后,用蛋白质印迹法检测Beclin 1基因的过表达效率。结果与结论：聚合酶链反应鉴定结果显示扩增的阳性片段已插入pLenex载体,聚合酶链反应、双酶切和DNA测序结果表明,重组慢病毒载体pLenex-Beclin 1的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染A549细胞后,细胞内Beclin 1蛋白高效表达。结果证实,实验成功构建了Beclin 1基因慢病毒过表达载体。     

携带人血管内皮生长因子165慢病毒表达载体的构建与表达

背景:已有研究证实血管内皮生长因子在正常肝脏肝部分切除后余肝的再生过程中发挥着重要的作用,但关于其对肝硬化肝脏是否也有相同作用国内外鲜有报道。目的:构建携带人血管内皮生长因子165基因的慢病毒载体,体外转染BLR3A大鼠肝细胞并观察该细胞中人血管内皮生长因子165基因的表达。方法:采用DNA重组技术将人血管内皮生长因子165基因克隆入pLenti6/V5-D-TOPO慢病毒表达载体中,筛选出阳性克隆与慢病毒包装系统ViraPowerTM Packaging Mix共转染293T细胞产生病毒颗粒,通过实时定量-聚合酶链反应法测定病毒滴度;携带人血管内皮生长因子165基因的慢病毒载体体外转染BLR3A大鼠肝细胞72h后,利用反转录-聚合酶链反应及Western blot法检测细胞中人VEGF165mRNA及蛋白的表达。结果与结论:成功构建了表达人VEGF165基因的慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO-VEGF165,测得病毒滴度为1.18×107VP/mL。重组慢病毒载体转染BLR3A大鼠肝细胞72h后,荧光蛋白表达率超过80%,反转录-聚合酶链反应及Western blot法测得转染组人血管内皮生长因子165mRNA及血管内皮生长因子165蛋白表达阳性。提示构建的携带人血管内皮生长因子165的慢病毒载体可有效转染BLR3A大鼠肝细胞,并促使该细胞表达人血管内皮生长因子165mRNA及蛋白。     

携带人Gfi1基因重组慢病毒载体稳定转染32D细胞株的建立

本研究建立真核细胞表达的Gfi1基因重组慢病毒载体包装系统,并实现Gfi1在32D细胞中长期、稳定的表达,为进一步研究Gfi1基因在恶性血液病中的发生发展建立一个有效的平台。制备完整的重组慢病毒载体三质粒系统：转移质粒（pLOX—Gfi1／pLOX）、包装质粒（pCMVAR8．2）及包膜蛋白质粒（pMD．G）。用脂质体法将三质粒共转染包装细胞293T,48小时后收集病毒上清,并转染靶细胞32D;用Western—blot法检测293T及32D细胞中Gfi1的整合及表达。结果表明：慢病毒的3种质粒可以高效转染293T细胞,并成功包装出慢病毒。目的基因Gfi1能被重组慢病毒高效导入靶细胞32D,并稳定表达,在荧光显微镜下可直接观察到GFP。Western—blot能检测到Gfi1蛋白在包装细胞293T及32D细胞中的表达。结论：慢病毒介导的Gfi1基因可以高效稳定转染32D细胞并持续表达,证明本研究建立了一种有效的基因转移系统。