HIV-1假病毒包装方法的探讨

目的：通过不同方案包装HIV-1假病毒,确定获得高重复性、高稳定性和高滴度假病毒的方法。方法从转染效率影响因素出发,通过不同的转染方案,利用pNL4-3 LucR-E-质粒与VSV-G质粒共转染293细胞包装病毒,分别于48 h和72 h收取假病毒并重新感染293细胞,48 h后测荧光素酶报告基因。结果成功包装出HIV-1假病毒,不同包装方案的病毒滴度不同,测得报告基因最高接近107 RLUs。结论应用PEI转染试剂、大提质粒pNL4-3︰VSV-G为4︰1时,转染效率最高,包装的假病毒滴度最高。     

HIV-1感染者中枢神经系统的病毒学特征研究

目的 探讨HIV-1感染者中枢神经系统(CNS)的病毒学特征.方法 通过克隆测序分析病毒亚型,观察CNS中HIV-1变异性和离散率;依据V3环11/25法则并结合10例有偿献血HIV-1感染者尸检脑组织标本免疫荧光试验分析中枢神经HIV-1复合受体的使用.结果 有偿献血人群感染的HIV-1显示B和B’亚型特征,脑脊液(CSF)和外周血序列有嵌合现象;CSF C2-V5区序列变异性明显低于外周血,两者的离散率差异无统计学意义;依据11/25法则分析V3环序列可见中枢神经HIV-1大多数使用CCR5复合受体.结论 CNS HIV-1病毒变异性明显小于外周血;CNS HIV-1具有CCR5嗜性.     

带有CFP标签的LC3自噬表达载体的构建

目的构建带有樱桃红色荧光蛋白(cherry fluorescent protein,CFP)标签的微管相关蛋白1轻链3(LC3)自噬真核表达载体,并进行初步表达鉴定。方法采用PCR方法,从质粒载体pCMV-GFP-LC3为模板扩增LC3片段,通过T4 DNA连接酶将纯化后的PCR产物LC3与经过ApaI和BamHI双酶切的pm-cherry-c1载体连接,命名为PM-CFP-LC3。该载体经酶切及测序验证后,在fugene6转染试剂介导下转染293细胞,通过荧光显微镜观察CFP在细胞内的分布来观察LC3表达情况。结果带有CFP标签的LC3表达载体构建成功,在荧光显微镜下可观察到转染细胞中樱桃红色荧光以及细胞自噬现象。结论成功构建了带有CFP标签LC3的重组质粒并成功表达,为深入研究细胞的自噬奠定了实验基础。     

饥饿诱导DRAM介导的自噬与HepG2和Hep3B细胞凋亡的关系

目的探讨饥饿诱导损伤调节自噬调控基因(DRAM)介导的自噬在HepG2细胞和Hep3B细胞凋亡中的作用。方法 HepG2细胞和Hep3B细胞经饥饿处理后,观察DRAM的表达和自噬的发生;利用DRAM小干扰RNA(siRNA)阻断DRAM,观察饥饿诱导的自噬水平;采用Calcein AM/PI染色,观察DRAM siRNA对饥饿引起的细胞凋亡的影响。结果经饥饿处理后12、24、36h,HepG2细胞和Hep3B细胞内DRAMmRNA均显著高于处理前(P﹤0.001),细胞凋亡明显增加(P﹤0.01),但两种细胞系间细胞凋亡计数的差异无统计学意义。DRAM siRNA阻断DRAM的功能后,HepG2和Hep3B细胞自噬减少,但对饥饿引起的细胞凋亡没有明显影响。结论 DRAM参与了饥饿诱导的自噬,可能不是饥饿引起肝癌细胞凋亡的机制。     

HIV-1膜蛋白gp120V3环的神经毒性研究

目的 体外观察人类免疫缺陷病毒-1（human immunodeficiency virus-1,HIV-1）膜蛋白gp120 V3环的神经毒性.方法通过小鼠大脑皮质原代神经细胞培养条件下TUNEL检测和培养上清乳酸脱氢酶释放试验,结合抗微管蛋白-2（microtubule associated protein-2,MAP-2）免疫荧光试验,观察人重组gp120蛋白神经毒性,并通过蛋白印迹法初步探讨其与凋亡调控蛋白bax与bcl-2的关系.结果重组人gp120 V3环多肽可诱导神经元凋亡和抑制神经突起形成,并呈浓度依赖性.gp120 V3环诱导神经细胞凋亡与抑制bcl-2表达有关.结论 HIV-1膜蛋白gp120 V3环具有神经毒性.     

核苷类似物对小鼠中枢神经线粒体毒性研究

目的探讨长期使用核苷类似物是否产生中枢神经元线粒体损伤。方法取7周龄Balb/C小鼠40只,分为4组,每组10只。实验组每天分别喂饲司它夫定（D4T）50 mg/kg、齐多夫定（AZT）100 mg/kg和拉米夫定（3TC）50 mg/kg,每周5 d,连续16周;对照组喂服双蒸水。通过激光单细胞捕获技术抓取小鼠大脑皮层神经元,每组200个细胞,通过实时定量PCR观察线粒体DNA（mtDNA）含量变化。结果 COXⅡ基因扩增显示,喂饲核苷类似物可明显减低小鼠大脑皮层神经元mtDNA拷贝数,其中D4T组减少至对照组的（22.2±3.2）%,AZT组减少至对照组的（53.6±7.1）%,3TC组减少至对照组的（34.6±8.2）%。同时,与对照组相比,ND4基因扩增显示,mtDNA主环拷贝数明显减低,D4T、AZT、3TC组分别为对照组的（25.2±7.3）%、（46.3±9.1）%和（42.3±7.4）%。与对照组比较,差异均有统计学意义（P﹤0.05）。但是,3组ND1基因扩增显示,mtDNA小环拷贝数依次为对照组的（67.7±5.2）%、（53.5±9.2）%和（94.4±8.3）%。AZT与对照组比较,mtDNA小环拷贝数明显降低（P﹤0.05）,其他两组与对照组比较则无明显变化。结论长期使用核苷类似物可产生小鼠神经元mtDNA损伤,且以主环缺失为主。     

射频消融亚致死性温度对肝癌干细胞的影响

目的 研究亚致死温度射频消融(RFA)对肝癌干细胞(LCSC)产生及其相关转录因子表达的影响.方法 利用小鼠Hep1-6肝癌细胞株和肝细胞癌(HCC)患者临床样品,检测LCSC相关标志物和转录因子的表达.结果 不同温度分别刺激Hep1-6细胞后发现,45℃是不能诱导细胞死亡的亚致死性温度.流式细胞仪(FCM)检测显示45℃处理可引起CD13+、CD44+、CD90+、CD133+ Hep1-6细胞水平明显上调,提示45℃温度导致Hep1-6细胞中以上各型LCSC产生增加;实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测显示45℃温度导致CD13、CD90、CD133 mRNA水平明显上调.CD13 mRNA水平在5例HCC患者复发肝癌组织中均明显上调,CD133 mRNA在4例复发肝癌中上调,CD90 mRNA仅在1例复发肝癌中上调;FCM检测显示CD13+ LCSC水平在4例复发肝癌中明显上调,CD133+ LCSC水平仅在1例复发肝癌中上调,提示CD13+ LCSC水平上调与45℃温度关系更密切.RT-qPCR检测显示4例CD13+ LCSC上调的复发肝癌患者13个LCSC相关转录因子中Sox2、Stat1明显上调,FCM检测显示45℃处理Hep1-6细胞后Sox2、Stat1 mRNA明显上调.用Sox2、Stat1 siRNA分别沉默了Sox2、Stat1基因,表明Sox2 、Stat1均参与了45℃温度诱导的CD13+ LCSC产生.结论 RFA治疗中45℃亚致死性温度所致CD13+ LCSC水平增高与Sox2、Stat1表达有关.该结果对肝癌复发研究有一定借鉴意义.     

单核细胞病毒库在HIV相关痴呆症发病机制中的作用

尽管联合抗病毒治疗,HIV仍能在淋巴细胞和单核细胞中持续存在.而且,即使体外研究证实HIV病毒颗粒nef、gp120和tat具有神经毒性,HIV相关痴呆症(HAD)的发生主要还是由于单核/巨噬细胞及与其相关的胶质细胞的间接免疫应答.因此,外周病毒库的循环单核细胞中的HIV在HAD发病机制中发挥着重要作用.针对循环单核细胞中HIV的导向治疗不仅有利于消灭外周病毒库,也有利于HAD及其他HIV并发症的防治.此文就单核细胞病毒库与HAD发病之间的关系进行了综述.     

司他夫定中枢神经毒性研究

目的 探讨核苷类抗HIV药物司他夫定(D4T)的中枢神经毒性.方法 原代培养小鼠大脑皮层神经细胞,应用不同浓度D4T作用于细胞,采用乙酰甲氧基钙黄绿素-(AM)和碘化丙啶(PI)染色法检测神经细胞凋亡,免疫荧光法检测神经元细胞形态学变化,实时定量PCR检测环氧合酶-2 (COX-2)拷贝数来评估细胞线粒体DNA含量,同时检测胸苷激酶2(TK2) mRNA表达的变化.采用卡方检验、t检验和Wilcoxon非参数检验进行统计分析.结果 D4T 0 μmol/L组、D4T25 μmol/L组和D4T 50 μmol/L组凋亡细胞所占比例分别为24.9％±8.2％、26.5％ ±10.6％和51.3％±12.4％,后者与前两者比较,差异有统计学意义(x2=7.25、6.93,均P＜0.01).D4T0 μmol/L组、D4T 25μmol/L组和D4T 50 μmol/L组平均每个神经元神经突起的数量分别为11.2±3.6、8.6±2.8和4.3±2.4,D4T 25 μmol/L组与D4T 0μmol/L组、D4T 50 μmol/L组与D4T25 μmol/L组之间差异有统计学意义(t=4.06、4.35,均P＜0.01);D4T 0 μmol/L组、D4T 25 μmol/L组与D4T 50 μmol/L组神经突起长度分别为(319.9±100.2)、(298.3±83.9)和(258.4±82.2) μm,D4T 25 μmol/L组与D4T 0μmol/L组、D4T 50μmol/L组与D4T 25 μmol/L组之间差异有统计学意义(t=4.58、4.65,均P＜0.01).PCR相对定量显示,D4T 25 μmol/L组和D4T50μmol/L组TK2 mRNA拷贝数分别是D4T 0 μmol/L组的0.34和0.08倍,D4T 25mol/L组与D4T 0 μmol/L组、D4T 50 mol/L组与D4T 25 μmol/L组之间差异有统计学意义(Z=-3.28、-4.25,均P＜0.01);D4T 25μmol/L组和D4T 50 μmol/L组COX-2拷贝数分别是D4T 0 μmol/L组的1.01和1.12倍,D4T 25 μmol/L组与D4T 0 μmol/L组、D4T 50 μmol/L组与D4T 25 μmol/L组之间差异均无统计学意义(Z=0.98、1.24,均P＞0.05).结论 短期接触D4T可诱导神经元凋亡,抑制其突起形成,并可抑制TK2表达,但对线粒体含量无影响.     

感染HIV-1儿童经抗病毒治疗后乳酸浓度检测及其相关因素研究

目的研究中国感染艾滋病毒(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)儿童经抗病毒治疗后血浆乳酸浓度及相关影响因素。方法选择31例抗病毒治疗的感染HIV-1儿童与30例正常对照儿童,检测血浆乳酸浓度,结合儿童的基本信息、治疗方案及实验室检测结果进行综合分析。结果感染HIV-1患儿血浆乳酸浓度(2.32±0.60)mmol/L显著高于对照组儿童(1.60±0.88)mmol/L(P<0.01);d4T治疗组和AZT治疗组间血浆乳酸浓度、基线CD4+T淋巴细胞计数、基线病毒载量、性别、年龄以及HIV-1传播途径差异均无统计学意义(P>0.05)。结论外周血乳酸浓度可反映感染HIV-1儿童经抗病毒治疗后的线粒体毒性,有望成为线粒体毒性检测指标。