新型HIV-1核酸定量内标构建及验证

目的构建一种稳定的以病毒颗粒为基础的HIV核酸定量检测内标。方法在实验室原有新型表型耐药载体pcDNA6.2-LTR gagpol的基础上,利用PCR扩增法在不改变p24保守区基础上突变核苷酸,经Gateway重组得到含突变碱基的pNL43-△ENV-LUC-ATTR表达载体,该载体与水泡性口膜炎病毒(VSV)质粒共转染293细胞48 h后收集上清中HIV-1内标假病毒颗粒,检测p24抗原含量,定量假病毒滴度,以倍比稀释内标质粒、内标质粒与阳性标本混合品、内标假病毒颗粒与阳性标本混合品为模板进行实时定量PCR法,观察内标质粒、内标假病毒颗粒内的核酸与内标引物探针的匹配情况,以及是否受样本探针引物的干扰。结果定点突变表型耐药载体pcDNA6.2-LTR gagpol内的p24保守区片段;获得仅具有1次感染性的HIV-1假病毒颗粒(3.61×10~9IU/ml);p24抗原检测含量为283.2 pg/ml;实时定量PCR法确定内标质粒、内标假病毒颗粒内的核酸与内标引物探针匹配良好,内标引物探针对阳性标本探针无干扰。结论成功建立了一种以假病毒颗粒为基础的HIV-1核酸定量检测内标。     

慢病毒介导绿色荧光蛋白基因转染大鼠软骨细胞表达的研究

[目的]构建携带绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)的慢病毒载体系统,通过感染大鼠软骨细胞,观察其感染能力及GFP的表达情况.[方法]以载体质粒pLentiLox 3.7、包装质粒pRSV-REV、pMDL g/p RRE及包膜质粒VSV-G共转染293T细胞制备慢病毒.分离、培养大鼠关节软骨细胞,将制备好的慢病毒颗粒感染软骨细胞,在荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达情况.[结果]重组慢病毒载体系统转染293T细胞96 h后可观测到较强的绿色荧光蛋白的表达,收集上清测得病毒滴度约为3.0×103ifu/μl,并且在80%大鼠软骨细胞中观察到GFP的表达.[结论]成功构建了携带GFP的重组慢病毒载体系统,对大鼠关节软骨细胞转染效果良好,为将来结合RNA干扰技术对软骨细胞进行基因改造提供了基础.     

四环素调控系统修饰永生化大鼠星形胶质细胞株的构建及鉴定

目的构建四环素及其衍生物强力霉素诱导表达目的基因的永生化大鼠星形胶质细胞株。方法用脂质体法将逆转录病毒载体四环素调控系统中的质粒pRevTet-On转染病毒包装细胞 PT67,经筛选培养后获得病毒载体RevTet-On,采用RT-PCR进行鉴定,并应用NIH313细胞测定病毒滴度。将RevTet-On感染永生化大鼠星形胶质细胞,用有限稀释法挑选阳性细胞单克隆后扩大培养,每个克隆瞬时转染含萤光素酶报告基因的质粒pRevTRE-Lue,加入强力霉素48h后分别检测其萤光素酶活性值,挑选出强力霉素诱导表达高、背景表达低的细胞株并检测其诱导表达的时效、量效关系。结果 RT-PCR结果显示逆转录病毒包装成功,病毒最高滴度为7．4×105CFU／ml。RevTet-On转染永生化大鼠星形胶质细胞后挑选出48个单克隆,瞬时转染pRevTER-Luc后筛选出1株高表达低背景细胞株, 其诱导表达值为876．1 RLU,背景表达值为42．5 RLU,诱导倍数为20．6。该细胞株在加入诱导因子强力霉素1 h后目的基因即开始表达,在24 h时达到高峰,在强力霉素浓度100-2 000 ng/ml的范围内, 其诱导表达活性与药物浓度呈剂量依赖性。结论含四环素调控系统的永生化大鼠星形胶质细胞株诱导活性可靠,可用于调控表达外源基因的研究。     

CNP2线粒体定位信号以及磷酸酯酶活性对抑制HIV-1 Gag蛋白组装作用的影响

目的研究CNP2在线粒体上的定位以及磷酸酯酶活性是否参与抑制HIV-1病毒颗粒组装。 方法采用RT-PCR扩增野生型CNP2编码区,插入到真核表达载体pcDNA5,构建融合蛋白Flag-CNP2的表达质粒pcDNA5-Flag-CNP2。应用融合PCR诱导突变法构建CNP1及CNP2突变表达载体。CNP表达载体分别与HIV-1假病毒包装质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG、pLenti6-EGFP共同瞬时转染293T细胞。集落形成实验检测上清病毒滴度,Western blot检测细胞中Gag蛋白p55、p24以及细胞培养上清中p24的表达情况。 结果与对照组比较,CNP2、CNP1、CNP2-S9/22A可以显著抑制细胞中病毒的释放,培养上清中病毒滴度显著降低（滴度分别为5.66、4.20、5.75、6.63 Log₁₀IU/ml,NC组为7.65 Log₁₀ IU/ml;t = 58.23、17.24、12.77、6.131,P = 0.0035、0.0066、0.0004、0.0039）。CNP1抑制HIV-1病毒颗粒组装作用更强,Western blot检测培养上清中病毒蛋白完全p24消失。磷酸酯酶结构域（2HM）突变后CNP2抑制HIV-1病毒颗粒组装的作用显著降低。 结论CNP2抑制HIV-1病毒颗粒组装需要磷酸酯酶结构域（2HM）的参与,CNP2的线粒体定位信号可能会影响其抑制HIV病毒颗粒组装的作用。     

构建携带hTERT基因的慢病毒重组载体及其包装和表达

目的构建含hTERT基因的慢病毒重组载体,进行病毒包装并检测hTERT在293T细胞中的表达。方法PCR扩增hTERT．插入慢病毒载体,并与包装质粒转染293T细胞,进行病毒包装,并测定其滴度。Western—Blot检测慢病毒液感染293T细胞后hTERT的表达。结果成功构建了含hTERT的慢病毒重组载体,滴度为2．79×10^7Tu／mL,Western-B10t检测显示慢病毒液感染的293T细胞中hTERT基因高表达。结论含hTERT的慢病毒重组载体成功构建并包装后能够顺利感染293T细胞．并阳性表达目的基因。     

小鼠RelB基因siRNA慢病毒载体的构建及鉴定

默效率.用pVSVG,plp1,plp2慢病毒包装系统质粒在磷酸钙介导下共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 聚合酶链反应(PCR)和测序证实,成功构建RelB-shRNA的慢病毒载体pLentiLox-sh-RelB.Western blot鉴定最有效的siRNA序列为5'-TGTGGTCAGGcATCTGCTTG-3',病毒液过滤后测定滴度为8×1010 pfu/L.结论 成功构建小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体.     

低氧诱导因子-1的病毒载体制备及感染效果

目的 制备低氧诱导因子(HIF)-1腺病毒载体并评价其对表皮角质细胞的感染效果.方法 Ad/HIF-1质粒经酶切鉴定后,以4μg质粒转染1.2×106个HEK293细胞,2 d后荧光显微镜下观察转染效率.1周后收集细胞及上清并感染HEK293细胞进行病毒扩增,待扩增的细胞及上清量达300 ml时进行病毒纯化及滴度测定.最后用制备的病毒载体感染表皮角质细胞,流式测定其感染效果.结果 Ad/HIF-1质粒酶切鉴定正确;转染或感染HEK293细胞后有绿色荧光蛋白(GFP)表达;获得的腺病毒滴度为1.8×1011PFu/ml.病毒以MOI=50感染表皮细胞,2 d后GFP阳性细胞的比例为97.46%.结论 成功制备了HIF-1腺病毒载体,且感染表皮角质细胞后能得到较高的感染效率,从而为腺病毒介导的基因功能研究提供理论基础.     

免疫基因CD1d和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建人免疫基因CD1d与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体。方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得CD1d的全外显子片段,使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿梭质粒转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定。取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞,荧光显微镜观察荧光表达。结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的CD1d基因序列完全一致。重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞,荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光。结论:成功构建了CD1d与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究CD1d基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体。     

负载PCA3启动子及CD-TK自杀基因腺病毒载体的构建及包装

目的 构建负载PCA3启动子联合CD-TK基因的腺病毒载体,并对其进行包装及滴度测定.方法 将PCA3启动子无缝克隆到pHBAd-U6-GFP上,取代原有U6启动子形成pHBAd-PCA3-GFP,AgeI单酶切该重组载体,将CD-TK基因片段无缝克隆至线性化pH-BAd-PCA3-GFP上,抽提质粒抗性筛选后经PCR及测序鉴定为pHBAd-PCA3-CD-TK载体.取上述重组载体质粒及骨架质粒pHBAd-BHG,用LipofiterTM转染试剂进行转染HEK293细胞包装成病毒,大量扩增并测定病毒感染性滴度.结果 经PCR及测序验证证实成功构建负载PCA3启动子及CD-TK自杀基因的重组腺病毒pHBAd-PCA3-CD-TK并包装扩增,病毒滴度为1×1010PFU/mL.结论 构建负载PCA3启动子及CD-TK自杀基因的重组腺病毒,为进一步体内外对前列腺癌细胞的杀伤效应研究奠定了基础.     

高表达蛋白hSav1对人胚肾HEK293增殖能力的影响

目的 观察高表达人Salvadorl(hSav1)蛋白对人胚肾293(HEK293)细胞增殖的影响.方法 构建含有绿色荧光蛋白(GFP)的hSav1质粒GFP-N1-hSav1;将构建好的GFP-N1-hSav1质粒在脂质体Lipofectamine 2000的介导下转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察质粒转染效率;分别在转染后12、24、36、48 h通过噻唑蓝(MTT)比色法计算细胞增殖抑制率,抑制率=[(对照-空白)-(给药-空白)]/(对照-空白)×100%;转染后36 h加入5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU),通过其掺入比率来显示hSav1对细胞增殖的影响.结果 质粒GFP-N1-hSav1构建成功,转染效率为70%-80%左右,蛋白hSav1明显高表达;MTT结果显示转染质粒后12、24、36、48 h,高表达蛋白hSav1组的细胞增殖抑制率分别为2%、5%、15%、23%,而阴性对照分别为2%、3%、2%、2%;BrdU结果显示,在HEK293细胞中高表达蛋白hSav1后细胞增殖抑制率为(27.3±3.8)%,阴性对照组的细胞增殖抑制率为(12.9±5.3)%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 在人胚肾HEK293中高表达蛋白hSav1可明显抑制细胞增殖能力.     

慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在椎间盘髓核细胞中的表达

目的本研究构建含绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒,并观察其在人椎间盘髓核细胞中的表达情况。方法应用分子克隆技术将绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因导人慢病毒载体质粒pLenti6／V5 TOPO,应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统（包括包装质粒、包膜蛋白质粒等）共转染入293细胞进行包装,48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72h收集病毒上清并感染髓核细胞,在荧光显微镜下感染情况。结果重组慢病毒滴度测定约为10^7U／mL。感染人椎间盘髓核细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达。结论成功构建了含GFP的慢病毒载体,且能成功将目的基因转入椎间盘髓核细胞并表达。     

人碱性成纤维生长因子基因重组慢病毒载体的构建

目的 构建携带人碱性成纤维生长因子(bFGF)基因的重组慢病毒表达载体.方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法钓取人源性的bFGF和FGF4两个目的 基因片段,将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU[含绿色荧光蛋白(GFP)]中,得到pGC FU-FGF4-bFGF,通过PCR、酶切、测序和对比验证bFGF后,通过Lipofectamine 2000的介导把pGC FU-FGF4-bFGF质粒和包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染至包装细胞293T,经同源重组产生重组慢病毒pGC FU-FGF4-bFGF,pGC FU-FGF4-bFGF在293T细胞内大量扩增,应用实时定量PCR法鉴定和测定滴度.结果 克隆得到500bp目的 bFGF全长基因,经过PCR扩增、酶切鉴定、序列测定证实,bFGF基因成功克隆到慢病毒载体中,可实现bFGF基因的表达,且病毒滴度为2.0×109 TU/ml.结论 成功构建表达人bFGF基因的慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够高的病毒滴度,可作为后续基因治疗研究工作的基因转染工具.     

HIV-1 Nef induces proliferation and anchorage-independent growth in podocytes

HIV-associated nephropathy (HIVAN) is now the third leading cause of end-stage renal disease in the African American population. HIV-1 infects renal tubular and glomerular epithelial cells or podocytes, cells that are a critical part of the filtration barrier. HIV-1 infection induces the loss of podocyte differentiation markers and increases podocyte proliferation. It has been previously shown that HIV-infection induces loss of contact inhibition. Here, the HIV-1 gene responsible for proliferative changes is identified by using cultured podocytes in vitro. The HIV-1 proviral construct, pNL4-3 was rendered noninfectious by replacing the HIV-1 gag/pol sequences with an EGFP reporter gene (pNL4-3: DeltaG/P-EGFP). This construct was then pseudotyped with VSV.G envelope to infect podocytes that were conditionally immortalized with SV-40 T antigen. In addition, mutated constructs were engineered with premature stop codons in the HIV-1 env, vif, vpr, vpu, nef, or rev genes. The parental construct and all the other mutated constructs, with the exception of nef, induced proliferation under nonpermissive conditions and anchorage-independent growth (colony formation in soft agar) under permissive conditions. In contrast, deletion of nef markedly reduced proliferation and colony formation. Although tat alone, or tat plus rev induced marginal levels of anchorage-independent growth, coexpression with nef significantly increased colony formation. Finally, stable expression of Nef in a retroviral vector, pBabe-puro, was sufficient to induce increased proliferation and colony formation. Moreover, nef induced saturation density and loss of contact inhibition. These data indicate that Nef induces multiple proliferative effects in podocytes in culture and that nef may therefore be an important gene in the pathogenesis of HIVAN in vivo.     

hVEGF165及hBMP-7双基因共表达腺相关病毒载体的构建及鉴定

目的通过引入内部核糖体进入位点序列（internal ribosome entry site，IRES），构建带有hVEGF165及hBMP-7双基因的重组腺相关病毒载体（adeno—associated virus，AAV），并对其进行鉴定。方法以AAV腺相关病毒包装系统（helper—free system）为基础，将真核表达质粒pIRES中的IRES片段定向克隆至腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS中，形成含有IRES序列及上、下游多克隆位点的重组骨架质粒pAAV-MCSA—IRES—MCSB。PCR扩增hVEGF165和hBMP-7基因，先后亚克隆入重组腺相关病毒骨架质粒IRES序列上、下游的多克隆位点，获得重组质粒pAAV-hVEGF165—IRES—hBMP-7。将其和包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper三质粒共转染AAV-293细胞，包装重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-IRES—hBMP-7，同时包装含有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的重组病毒rAAV-IRES—GFP作平行对照。荧光显微镜下监测病毒包装效率，收获重组病毒后感染AAV-HT1080细胞测定病毒滴度，并通过病毒基因组外源基因扩增鉴定重组病毒的包装是否成功。结果重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hVEGF-165-IRES—hBMP-7经双酶切鉴定正确。荧光显微镜下观察三质粒共转染AAV-293细胞72h后，病毒包装效率达95％～100％，收获的重组病毒具有较高浓度及活性，感染AAV-HT1080效率达90％，荧光计数法测定病毒感染滴度达5．5&#215;10^11 vp／mL。提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因hVEGF。及hBMP-7片段，重组病毒包装成功。结论成功构建带有hVEGF165及hBMP-7双基因的重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-IRES—hBMP-7，收获的病毒具有较高滴度，为今后利用腺相关病毒载体进行hVEGF。及hBMP-7双基因共表达影响骨修复的体外及体内研究提供实验基础。     

人PPFP基因的重组慢病毒载体的构建和表达

目的 构建含人PAX8/PPARγ/融合基因(PPFP)基因重组慢病毒载体并检测其表达性能.方法 从已构建好的含PPFP的质粒克降模板PEGFP-C-PPFP中,利用聚合酶链反应(PCR)方法钓取目的 基因PPFP,将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含Flag基因)中,得到重组的pGC-FU-PPFP,通过PCR、酶切、测序和分析比对验证PPFP基因后,将pGC-FU-PPFP质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞,获得携带PPFP基因和Flag基因的重组慢病毒,收集并浓缩病毒上清液,测定重组病毒的滴度.通过Western blot鉴定PPFP-Flag融合蛋白在靶细胞内的表达进一步验证目的 基因在靶细胞中的表达.结果 经PCR扩增获得2591 bp的目的 基因片段,构建的重组质粒经PCR、酶切及测序和分析比对鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达3.5×10~7转导单位TU/ml;感染的293T细胞,Western blot结果显示条带大小为90 KDr,可判断目的 基因PPFP在293T细胞中表达.结论 成功构建PPFP基因慢病毒载体质粒pGC-FU-PPFP,并建立慢病毒过表达系统.     

活化T细胞核因子-2可介导高迁移率族蛋白B1促进白细胞介素-2转录表达

目的 观察活化T细胞核因子-2(NFAT2)在高迁移率族蛋白B1(HMGB1)促进白细胞介素-2(IL-2)转录表达中的介导作用.方法 将构建好的HMGB1和NFAT2质粒单独或共同转染人胚胎肾细胞株293T,同时转染IL-2报告基因,并在此基础上应用小分子干扰RNA(siRNA)质粒对内源性及外源性NFAT2表达进行特异性抑制,观察对IL-2报告基因活性的影响.结果 在293T细胞中,内源性转染实验促使IL-2报告基因活性增加到17.81±1.49,但随着siRNA质粒转染剂量从0 μg/孔逐渐增加到4.8μg/孔,IL-2报告基因活性在内源性抑制实验中降低最小到1.42±0.17,在外源性抑制实验中活性最高为54.16±5.49,受抑制后降低最小到2.97±0.34.结论 NFAT2介导HMGB1促进IL-2报告基因转录表达.     

表达前强啡肽基因的Ad5型腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建且鉴定含前强啡肽基因(prodynorphin)的血清5型腺病毒载体(Ad5).方法 应用分子生物学方法 将前强啡肽基因序列克隆入腺病毒穿梭质粒pDC316-PDP,后者与骨架质粒共转染HEK293细胞,包装得到含前强啡肽转基因的腺病毒Ad5-PDP.用聚合酶链反应(PCR)方法 对转基因病毒进行鉴定,TCID50法测定病毒滴度.结果 PCR法证实转基因正确插入了Ad5型病毒基因组内,且没有野生型病毒污染,病毒滴度为1×1012v.p./mL.PCR鉴定Ad5-PDP重组成功.结论 获得的Ad5-PDP滴度高,感染性好,可以用于转基因治疗的实验研究.     

人白细胞介素10基因慢病毒载体的构建及重组

目的:拟构建含人白细胞介素10(hIL-10)基因的慢病毒载体(LV-hIL-10)，为进一步探讨慢性疼痛的治疗研究奠定基础。方法:从pCYIL-10质粒中选择适当的引物进行PCR后得到含Pme I 多功能酶切位点的IL-10 基因片段，将其构建到慢病毒载体pWPXL上得到重组的pWPXL- IL-10质粒，对所抽提的质粒进行酶切及测序检测正确后大量提取备用。将重组质粒pWPXL- IL-10、包膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2共转染293T细胞后包装出复制缺陷的慢病毒颗粒，进行病毒滴度的测定。结果:重组质粒酶切鉴定结果显示，pWPXL- IL-10质粒中有一个530 bp左右的插入片断，大小与IL-l0 cDNA（534 bp）基本符合。测序结果显示pWPXL- IL-10质粒上插入片段的序列与基因库中hIL-10基因序列完全一致。转染后获得了高滴度（2×1010）、高纯度的病毒颗粒。结论:成功构建了含人白细胞介素10基因的慢病毒载体LV-hIL-10，为慢性疼痛治疗的研究奠定了基础。     

新型人骨形成蛋白2逆转录病毒载体的构建及活性检测

目的 构建表达重组人骨形成蛋白2(BMP2)基因的重组逆转录病毒,对其在成骨细胞中的生物学作用进行探讨.方法 克隆BMP2基因,与pDNR-CMV连接构成pDNR-CMV-BMP2,然后将重组质粒pDNR-CMV-BMP2和逆转录病毒质粒pLP-LNCX以loxP位点进行同源重组,构成逆转录病毒载体pLP-LNCX-BMP2,转染包装细胞PT67进行病毒包装,NIH3T3细胞测定病毒滴度;将逆转录病毒感染人成骨细胞,噻唑蓝(MTT)法检测细胞生长变化,Western blot检测BMP2蛋白表达.结果 重组逆转录病毒载体pLP-LNCX-BMP2经鉴定连接正确;病毒载体pLP-LNCX-BMP2转染PT67后,上清液中病毒滴度可达到5×108pfu;MTT检测见逆转录病毒组与对照组比,48和72h细胞抑制率(5.1%比5.3%,8.5%比8.3%)差异无统计学意义(P>0.05),转染48 h后Westernblot可见BMP2蛋白高表达.结论 成功构建了BMP2逆转录病毒,为BMP2基因治疗及其功能研究提供了有效的手段.