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应用同源重组技术构建小鼠Cchl1a3基因R528H突变型打靶载体的策略 总被引:1,自引:0,他引:1
目的构建小鼠Cchl1a3基因R528H突变型基因敲入打靶载体,模仿低血钾周期性麻痹患者中的对应发现。方法采用置换型载体,分为长短、短臂设计(1.5~2.0kb),以便用聚合酶链反应(PCR)方法筛选中靶载体和ES细胞(embrgonic stem cell)。首先以Cchl1a3基因为模板设计引物,并引入与质粒内插入位点酶切序列相配的内切酶序列,扩增用于套取的同源臂a和b,以及用于插入筛选基因和实行定点突变的同源臂c和d,c和d首尾相接,用点突变特异性PCR在c内实现R528H突变。将a和b定向插入pBR322,借助于温度敏感的pSC101-BAD-gba-(tet)质粒的表达Red/ET重组酶,使其与携带Cchl1a3基因的细菌人工染色体(BAC)实现同源重组,套取含目的突变点、长约8kb的Cchl1a3的基因片断,形成pBR322-Cchl1a3。将c和d定向插入PL451质粒Frt-Neo-Frt片段两侧,酶切c-Frt-Neo-Frt-d片断纯化后,再与pBR322-Cchl1a3质粒一同转入含Red/ET重组酶基因的大肠杆菌EL250菌株,在重组酶的催化下再次实现同源重组,在Cchl1a3基因的给定位点实现R528H突变并插入包含筛选基因和重组酶识别位点的Frt-Neo-Frt片断,完成载体的构建。载体构建过程中,酶切位点变化导致的片断程度改变作为初筛,PCR产物测序结果作为最后的鉴定依据。结果打靶载体符合设计要求。结论运用点突变特异性PCR,结合Red/ET重组技术构建基因定点突变的基因敲入型打靶载体,在重组酶催化下仅需要2次同源重组即可完成。该策略成熟简便,省时省力,构建的载体易于鉴定。 相似文献
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甲亢性低血钾型周期性麻痹家系基因突变的初步研究 总被引:2,自引:0,他引:2
目的筛查甲亢性低血钾型周期性麻痹家系的钙离子通道α1亚基和电压门控钠离子通道α亚基基因是否存在突变。方法总结甲亢性低血钾型周期性家系Ⅵ代患者的临床特点,并应用酶联免疫测定和测序技术筛查编码钙离子通道α1亚基的528位及1239位精氨酸和钠离子通道α亚基669位及672位精氨酸基因的突变点。结果钠离子通道α亚基基因2012位碱基序列发生错义突变(T→C),671位苯丙氨酸变为丝氨酸,而其他3个已知突变点的碱基序列完全正常。结论华人甲亢性低血钾型周期性麻痹家系患者中存在突变,致使钠离子通道α亚基基因671位苯丙氨酸为丝氨酸替代,该位点国内外未见报道,是一个新的突变位点。 相似文献
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瘦素在风湿病中的研究进展 总被引:5,自引:1,他引:4
流行病学调查发现,贫穷国家感染性疾病的发生率高,而富裕国家自身免疫性疾病发病率逐年增高,可见疾病谱与营养状态密切相关。肥胖基因于1994年被成功地从遗传性肥胖小鼠(ob/ob)定向克隆,同时发现了该基因的表达产物,命名为leptin。该词源于希腊文.意为“消瘦”,国内可见翻译为消脂素、抗肥胖激素、瘦素等名称,以瘦素称谓多见,是一种主要调节机体能量平衡的激素。 相似文献
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目的 研究过氧化物酶体增殖物活化型受体γ(PPARγ)激动剂吡格列酮对胶原诱导的关节炎(CIA)大鼠滑膜表达细胞因子的影响,并探讨其作用机制.方法 以RT-PCR法检测两组剂量为4、20 mg/(kg*d)的吡格列酮对大鼠出现CIA后14 d滑膜表达肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、干扰素-γ(IFN-γ)及IL-4的影响.结果 与对照组比较吡格列酮用药组滑膜表达TNF-α和IFNγ明显降低,IL-4表达明显增高,IFN-γ/IL-4比值显著降低,IL-1β无明显差别.结论 吡格列酮对CIA的抗炎作用与抑制TNF-α和IFN-γ,促使Th1/Th2平衡向Th2的优势转化有关. 相似文献
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目的为进一步了解吡格列酮的抗炎机制,观察其对炎症组织细胞中免疫及炎性调节因子S100A8和S100A9的mRNA表达的影响,探讨其痛风防治作用机制。方法大鼠单侧踝关节腔一次性注射尿酸钠(MSU)晶体建立急性痛风性关节炎模型;腹腔一次性注射MSU诱导急性腹膜炎模型。MSU注射诱发模型前3d,大鼠灌胃口服吡格列酮(20mg.kg-1.d-1),连续给药5d;模型诱发当天,在吡格列酮给药后2h注射MSU。以RT-PCR检测关节炎诱发后48h滑膜组织中和腹膜炎诱发后4,8,24,48及72h腹腔巨噬细胞S100A8和S100A9的mRNA的表达以及吡格列酮给药的影响。结果S100A8和S100A9的mRNA在正常大鼠滑膜中仅有微量表达(0.01±0.01,0.20±0.07),但在诱发关节炎后48h,滑膜组织中呈现高表达(1.21±0.20,1.44±0.20),吡格列酮则显著抑制其高表达(0.26±0.14,0.25±0.16)。S100A8和S100A9的mRNA在正常大鼠腹腔巨噬细胞未见表达,但在诱发腹膜炎后4,8,24,48和72h大鼠腹腔巨噬细胞中均有较高表达。吡格列酮仅在48和72h显示出明显的抑制作用(S100A8mRNA:1.17±0.38vs0.03±0.02和0.70±0.20vs0.02±0.01;S100A9mRNA:0.90±0.31vs0.10±0.01和0.77±0.10vs0.02±0.01)。结论吡格列酮具有抑制S100A8和S100A9的mRNA表达的作用,很可能与其对痛风炎症的防治作用密切相关。 相似文献
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吡格列酮对大鼠痛风性关节炎滑膜细胞因子表达的作用 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)激动剂吡格列酮。对大鼠急性痛风性关节炎滑膜表达细胞因子的调控作用,探讨其作用机制。方法:大鼠单侧踝关节注射人工尿酸钠晶体制作急性痛风性关节炎模型,于注射48h后取关节滑膜,以RT—PCR法检测吡格列酮(20mg·kg^-1·d^-1)口服给药对滑膜表达肿瘤坏死因子α(TNF—α)、白介素1β(IL-1β)、白介素1受体拮抗剂(IL—IRα)、细胞因子诱导中性粒细胞化学趋化因子(CINC,相当于人的白介素8)、干扰素γ(IFN-γ)和白介素4(IL-4)的作用。结果:吡格列酮用药组滑膜表达TNF—α、CINC和IFN-γ显著低于对照组,抑制率分别为81.7%、90.9%、65.3%;IL-4表达高于对照组,增加率为340.0%;IFN-1/IL-4比值显著低于对照组,抑制率为92.6%。2组IL-1β和IL-IRa的表达差别无统计学意义。结论:吡格列酮对急性痛风性关节炎的抗炎作用与抑制TNF—α和CINC的表达。并促使Th1/Th2平衡向Th2为优势转化有关。 相似文献
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目的研究过氧化物酶体增殖物活化型受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)激动剂吡格列酮对大鼠胶原诱导关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)滑膜表达S100A8 mRNA和S100A9 mRNA的影响,探讨其作用及可能机制。方法 Wistar雄性大鼠随机选择3只作为正常对照组;以Ⅱ型胶原免疫诱导大鼠,按发生关节炎时间先后顺序再随机入组,分为模型对照组、吡格列酮用药大剂量组[20mg/(kg.d)]和吡格列酮用药小剂量组[4 mg/(kg.d)],每组3只。以逆转录-聚合酶链反应法检测吡格列酮两种剂量对大鼠出现CIA 14 d后滑膜表达S100A8 mRNA和S100A9 mRNA的影响。结果 PPARγ、S100A8、S100A9 mRNA在关节炎后14 d大鼠滑膜表达均明显增高;吡格列酮用药组滑膜表达S100A8 mRNA和S100A9 mRNA明显低于对照组,小剂量用药组S100A8 mRNA和S100A9 mRNA分别减低62.7%和34.2%,大剂量用药组S100A8 mRNA和S100A9 mRNA分别减低82.1%和71.9%。结论吡格列酮可能通过抑制CIA的S100A8 mRNA和S100A9 mRNA表达产生抗炎作用。 相似文献
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目的应用超声探讨早期定量评价糖尿病患者颈动脉血管弹性。方法随机选取2013年度体检者168人,分为对照组36例及糖尿病组132例。测定体质量指数(BMI)、收缩压、舒张压、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)、空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、糖化血红蛋白(Hb A1c)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、同型半胱氨酸(Hcy)、尿微量白蛋白(U-MA)、餐后2 h血糖(P2h BG)及餐后2 h胰岛素(PINS)等指标。应用血管回声跟踪技术(ET)测量内-中膜厚度(IMT)、僵硬度(β)、弹性系数(EP)、顺应性(AC)、膨大指数(AI)以及脉搏波传导速度(PWVβ)。比较对照组与糖尿病组、糖尿病组中正常与异常Hb A1c的颈动脉弹性指标,Spearman分析糖尿病组中血糖相关指标与颈动脉血管弹性指标的相关性。结果糖尿病组与对照组的双侧IMT、β、Ep、PWVβ差异有统计学意义;糖尿病组中Hb A1c正常组与异常组的β、Ep、AC、PWVβ差异有统计学意义;糖尿病组颈动脉的β、Ep、PWVβ与FINS、PBG、PINS成正相关,β、PWVβ与Hb A1c成正相关,AC与PBG成负相关。结论 ET可用于检测糖尿病患者的动脉弹性,对血管内皮功能作出早期评估,在糖尿病患者早期动脉粥样硬化的诊断、治疗和预防中有重要的应用价值。 相似文献
10.
目的研究并比较肉芽肿性多血管炎(granulomatosis with polyangiitis,GPA)和显微镜下多血管炎(microscopic polyangiitis,MPA)死亡病例的死因及临床特点。方法回顾性分析北京协和医院因MPA或GPA住院的病例,评估疾病活动度,并统计分析两组死因及疾病特点。结果 455例诊断为GPA或MPA的住院患者中,死亡49例(GPA 15例,MPA 34例),MPA病死率明显高于GPA(14.6%vs.6.8%,P0.05)。GPA死亡患者的平均年龄明显低于MPA[(47.2±17.7)岁vs.(69.4±9.3)岁,P0.001]。MPA生存时间中位数明显低于GPA(3.85个月vs.10.00个月,P0.05)。起病3个月内死亡的MPA患者明显高于GPA(44.1%vs.6.7%,P0.05)。MPA患者五因子评分明显高于GPA[(3.2±1.0)vs.(1.5±0.5),P0.001]。GPA患者首要死因是原发病活动导致出血(53.4%),而MPA首要死因是感染(55.9%)。两组死因累及的首要系统均为呼吸系统,MPA占82.4%,GPA占66.7%。MPA组合并肺间质病变明显高于GPA(44.1%vs.13.3%,P0.05);而合并耳鼻喉表现明显低于GPA组(2.9%vs.66.7%,P0.001)。肺部感染病原分析显示,最常见为细菌感染,其次是真菌感染;且MPA组合并真菌感染(58.8%vs.26.7%,P0.05)及混合感染(44.1%vs.13.3%,P0.05)的发生率均高于GPA组。结论与GPA相比,MPA病死率高,且MPA患者病情重,进展快,易发生严重感染。 相似文献