去血清饥饿法对卵巢颗粒细胞自噬因子LC3和Beclin-1表达的影响

目的观察去血清饥饿法对卵巢颗粒细胞自噬因子LC3和Beclin-1表达的影响。方法用去血清的培养液诱导处于对数生长期的颗粒细胞,0、4、12、24 h后用单丹磺酰戊二胺(MDC)荧光染色法检测自噬体的形成,反转录-聚合酶链反应(RT-PCT)和Western blot方法分别检测颗粒细胞微管相关蛋白1轻链3(MAPLC3)和Beclin-1 mRNA和蛋白的表达。结果随着去血清时间的延长,MDC阳性细胞数及自噬泡数量增多;4 h后LC3-Ⅱ及Beclin-1mRNA表达开始增加,且随着时间增加有增加趋势[LC3-Ⅱ:(0.21±0.02)、(0.45±0.12)、(0.60±0.05)、(0.74±0.03),P0.05;Beclin-1:(0.20±0.06)、(0.37±0.11)、(0.52±0.07)、(0.69±0.07),P0.05];4 h后蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加,Beclin-1蛋白表达亦增加,且随时间增加有增加的趋势[LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ:(0.12±0.05)、(0.32±0.09)、(0.63±0.07)、(0.92±0.04),P0.01;Beclin-1:0,(61±0.01)、(0.83±0.11)、(1.09±0.05)、(1.35±0.10),P0.05]。结论去血清饥饿可诱导颗粒细胞自噬的发生,这可能与卵泡发育和闭锁的发生、发展有关。     

二仙汤对自然衰老小鼠卵巢颗粒细胞线粒体的改善作用

目的:观察二仙汤对自然衰老小鼠卵巢颗粒细胞线粒体的改善作用。方法:昆明种小鼠分为3组:2月龄青年对照组,11月龄老年空白对照和11月龄二仙汤30 g/kg实验组。分别灌胃给予相应药物或生理盐水,连续用药60天。实验结束后分离卵巢颗粒细胞。采用生物发光法测定ATP含量,测定线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性,电镜和荧光染色观察线粒体的数目、形态和结构,JC-1染色观察线粒体膜电位,Western blot法检测PCG-1α、OPA1和PINK1的蛋白表达水平。结果:和青年小鼠比,衰老小鼠卵巢颗粒细胞ATP含量明显降低,线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ活性显著提高,线粒体数目减少,碎片物增多,膜电位降低,PCG-1α和PINK1蛋白水平下调,而二仙汤30 g/kg组可以显著提高衰老细胞的ATP含量,改善线粒体数目和结构,提高线粒体膜电位,促进PCG-1α和PINK1的表达。结论:线粒体功能降低可能是小鼠卵巢颗粒细胞衰老的机制之一,而二仙汤能够改善衰老的线粒体功能,这种改善很可能是通过促进线粒体自我更新的动力过程进行的。     

β2糖蛋白I(β2GPI)在卵泡液中的表达水平及其与卵泡发育的关系

目的:探讨β2糖蛋白I(β2GPI)与卵泡发育的关系。方法:选取体外受精/卵胞质内单精子注射(IVF/ICSI)助孕治疗的卵巢功能正常者100例(NC组)、多囊卵巢综合征(PCOS)患者85例(PCOS组),卵巢储备功能低下(DOR)患者62例(DOR组),长方案促排卵,收集人绒毛膜促性腺激素(h CG)注射日血清及取卵日优势卵泡的卵泡液,应用酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定各组卵泡液中β2GPI的水平;电化学发光法测定h CG注射日血清E2水平,并对IVF/ICSI周期卵泡液中β2GPI水平与h CG注射日血清E2水平、获卵数以及卵成熟率进行相关性分析。结果:各组卵泡液中β2GPI浓度相比均无统计学差异(P0.05);NC组IVF/ICSI周期中卵泡液中β2GPI的水平与h CG注射日血清E2水平、获卵数及卵成熟率均呈负相关(r=-0.279,P0.05;r=-0.243,P0.05;r=-0.711,P0.01)。结论:卵泡液中β2GPI的水平与卵巢功能无显著相关性,卵泡液中β2GPI的表达水平与IVF/ICSI周期中卵泡的发育存在负相关。     

过氧化氢诱导人卵巢颗粒细胞氧化应激模型的建立

目的 探讨构建过氧化氢(H2O2)诱导人卵巢颗粒细胞氧化应激模型的方法.方法 不同浓度H2O2处理人卵巢颗粒细胞COV434,采用Western blot检测Caspase-3表达,流式细胞仪和DAPI/TUNEL双染色法检测细胞凋亡情况,H2DCF-DA检测细胞内活性氧族(ROS)水平,通过量效关系和时效关系来确定H2O2的最佳作用条件.结果 1 ～ 1.5 mmol/L浓度H2 O2处理COV434细胞2～4h后Caspase-3表达量升高最明显.随着H2 O2浓度增加及作用时间的延长细胞凋亡率不断升高.细胞内ROS水平随着H2 O2浓度的增加而增加.1.5mmol/L浓度H2 O2处理1h后细胞内ROS水平上升最明显.结论 H2 O2诱导人卵巢颗粒细胞氧化应激模型的最适宜浓度为1 ～ 1.5 mmol/L,采用细胞凋亡情况评价作用时间是2～4h,采用ROS评价作用时间为1h.     

瘦素受体蛋白在人卵巢黄素化颗粒细胞的表达

目的　通过检测人卵巢卵泡液中瘦素 (leptin)的浓度及瘦素受体蛋白在人卵巢黄素化颗粒细胞的表达 ,探讨瘦素对人卵巢的作用。方法　体外受精胚胎移植 (IVF -ET)患者经阴道超声引导下取卵时留取卵泡液 ,采用酶联免疫吸附测定 (ELISA)方法检测血清与人卵泡液中瘦素浓度并分离颗粒细胞体外培养 ,采用免疫细胞化学方法检测瘦素受体蛋白的表达。结果　人卵巢黄素化颗粒细胞检测到瘦素受体蛋白的表达 ,即荧光显微镜下观察到颗粒细胞发出黄绿色荧光 ;卵泡液中瘦素浓度平均为 ( 19 2 8± 4 2 2 )ng/ml,与血清中瘦素浓度 ( 2 0 0 2± 3 45 )ng/ml比较差异无显著性(P >0 0 5 )。结论　卵泡液中检测到瘦素的存在 ,并在人卵巢黄素化颗粒细胞上检测到瘦素受体蛋白的表达 ,提示卵巢为瘦素作用的靶器官 ,瘦素可能参与卵巢功能的调节。     

不同组织膜蛋白及二甲基亚砜对小脑颗粒细胞突起生长的影响

目的探讨不同组织膜蛋白提取物和二甲基亚砜对大鼠小脑颗粒细胞（CGC）突起生长的影响。方法提取成年大鼠肝、坐骨神经和脑白质的组织膜蛋白包被盖片，接种CGC于盖片上，同时将二甲基亚砜（DMSO）作为添加剂加入培养液，观察CGC突起的生长。结果①脑白质膜蛋白能明显抑制CGC突起的生长，随浓度增加抑制效应更加明显；坐骨神经膜蛋白对CGC突起生长抑制不明显，肝组织膜蛋白则能促进突起生长；②随DMSO浓度升高CGC突起生长逐渐受到抑制，当DMSO浓度小于1％时，CGC突起长度与对照对照差别不大。结论脑白质膜蛋白对CGC突起生长有明显抑制作用，而DMSO添加到培养液中在低浓度时不会显著影响神经元突起生长，可用于检测药物及疏水性分子对体外培养的神经细胞突起生长的作用。     

环鸟苷酸依赖性蛋白激酶拮抗酒精性中枢神经细胞毒性机制研究

目的 探讨环鸟苷酸依赖性蛋白激酶对酒精致鼠小脑颗粒细胞(cerebellar granule cells,CGC)毒性作用的影响机制.方法 通过光学显微镜观察一氧化氮(NO)释放剂,环鸟苷酸及环鸟苷酸依赖性蛋白激酶抑制剂对鼠小脑颗粒细胞存活的影响.结果 NO释放剂,环鸟苷酸在无酒精组中促进细胞的生存,并能对CGC产生保护作用,减少酒精对细胞的杀死.环鸟苷酸依赖性蛋白激酶抑制剂可抑制二者对细胞的作用.结论 环鸟苷酸依赖性蛋白激酶在NO释放剂和环鸟苷酸促鼠小脑颗粒细胞的存活和抵抗酒精性神经毒性过程中具有重要的作用.     

超排卵时卵巢对促性腺激素的反应与颗粒细胞促卵泡激素受体的表达

目的 :探讨促排卵周期卵巢对促性腺激素反应性与颗粒细胞促卵泡激素受体 (FSHR)表达的关系。方法 :根据取卵时卵泡发育数不同 ,将卵巢对促排卵药物的反应分为低反应型 (卵泡数≤ 3个 )、中反应型 (卵泡数 4～13个 )和高反应型 (卵泡数≥ 14个 ) ,分别为 11例、15例和 13例。采用逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)测定 3种反应类型的卵泡颗粒细胞 FSHR m RNA的表达量。结果 :低反应型 FSHR m RNA表达量显著低于中、高反应型 (相对积分值分别为 0 .5 4± 0 .0 7、0 .90± 0 .17和 1.2 0± 0 .4 5 ,P<0 .0 5 )。结论 :卵巢对促性腺激素的反应与颗粒细胞FSHR m RNA的表达量高低有关。     

垂体腺苷酸环化酶激活肽增加新生大鼠小脑颗粒细胞钙通道电流

应用膜片箝"全细胞"电流记录方法，研究了垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）对新生大鼠小脑颗粒细胞高电压激活（HVA）的钙电流作用。实验结果发现：PACAP－38、PACAP－27能明显增加小脑颗粒细胞钙电流的幅值，两者增加钙内流的效应无显著差异，并且都具有脱敏现象；而出于同一家族的血管活性肠肽（VIP）对此电流却没有任何影响。当记录电极内加入GTPγS后，PACAP增加钙电流的效应成为不可逆；而细胞内液加入GDPβS或预先用百日咳毒素孵育细胞12h后，PACAP的钙通道激活作用完全消失。此外，细胞内应用cAMP和磷酸二酯酶抑制剂3－isobutyl－1－methylxanthine（IBMX），既不影响钙通道本身的活动，也不修饰PACAP增加颗粒细胞钙通道电流的效应。我们的结果提示：新生大鼠小脑颗粒细胞上存在着具有功能意义的PACAP受体，该受体被PACAP－38和PACAP－27激活后可增加细胞膜上钙通道的开放，促进钙内流。PACAP的这种作用与百日咳毒素敏感的G蛋白偶联，但并不依赖腺苷酸环化酶参与的第二信使系统。