葛根素对高糖诱导的RSC96细胞凋亡和自噬相关蛋白的影响

目的探讨葛根素对高糖诱导的RSC96细胞损伤的保护作用是否与自噬调节有关。方法建立体外RSC96细胞高糖损伤模型,根据Westernblot检测CleavedCaspase-3蛋白判断造模成功与否。通过CCK-8法确定葛根素干预浓度。免疫细胞化学法检测Beclin-1蛋白的表达;Western blot检测Cleaved Caspase-3、LC3-Ⅱ、p62、Beclin-1蛋白的表达。结果与高糖组相比,葛根素预处理可显著提高高糖诱导后RSC96细胞的存活率(P0.05),抑制Cleaved Caspase-3蛋白的表达(P0.05),抑制LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白的表达(P0.05),增强p62蛋白的表达(P0.05)。结论葛根素可改善由高糖诱导的RSC96细胞损伤,其机制可能与其抑制LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达、提高p62蛋白表达有关。[营养学报,2020,42(3):281-286]     

早发型和晚发型子痫前期自噬与凋亡水平差异及相互关系研究

目的探讨早发型子痫前期(early-onset preeclampsia, EOPE)和晚发型子痫前期(late-onset preeclampsia, LOPE)胎盘组织中自噬和凋亡水平的差异,利用人绒毛膜滋养层细胞株HTR 8/SVneo缺氧模型探讨自噬与凋亡的关系,为解释子痫前期(preeclampsia, PE)的发病机制提供新的思路。方法选取2018年1～6月上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院产科剖宫产分娩孕妇26例的临床资料。按照PE发生程度分为EOPE组10例,LOPE组6例,正常孕妇组10例。通过透射电镜观察EOPE组、LOPE组和正常孕妇组胎盘组织滋养层细胞中的自噬溶酶体;采用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应和免疫印迹方法检测EOPE组、LOPE组和正常孕妇组胎盘组织中自噬相关基因(LC 3和Beclin-1)、抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax mRNA和蛋白水平的表达;利用HTR 8/SVneo缺氧模型,检测LC 3、Beclin-1、Bcl-2和Bax mRNA水平的表达。结果与正常孕妇组胎盘组织相比,EOPE组自噬溶酶体含量降低,LC 3、Beclin-1和Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平降低,Bax表达升高,差异均有统计学意义(P0.05)。LOPE组自噬溶酶体含量增加并且出现凋亡细胞,LC 3、Beclin-1和Bax表达均升高,Bcl-2表达降低,差异均有统计学意义(P0.05)。缺氧模型中,与正常HTR 8/SVneo细胞相比,缺氧12 h组LC 3和Beclin-1 mRNA表达水平均升高,Bcl-2和Bax mRNA表达水平均降低,差异有统计学意义(P0.05),抑制自噬活性后,Bax mRNA表达水平显著升高,差异有统计学意义(P0.05);24 h和48 h组LC 3、Beclin-1、Bcl-2和Bax的mRNA表达均降低,差异有统计学意义(P0.05);72 h组LC 3、Beclin-1和Bax表达均升高,Bcl-2表达降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论 EOPE组胎盘滋养层细胞中自噬活性受损,凋亡水平增加;而LOPE组中自噬和凋亡水平均增加;短期缺氧激活滋养层细胞自噬,凋亡降低,抑制自噬凋亡增加;长期缺氧引发过度自噬和凋亡。     

糖尿病足感染患者病原菌分布及创面组织中细胞自噬相关蛋白表达

目的 探究糖尿病足感染(DFI)患者病原菌分布特征及创面组织中细胞自噬相关蛋白表达。方法 选取2015年11月-2019年11月医院收治的196例DFI患者(感染期126例，感染控制期70例),分析患者病原菌分布，检测微管结合轻链蛋白-3(LC3)、自噬特异性基因(Beclin-1)和泛素结合蛋白(P62)的表达量和白细胞计数(WBC)、C-反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)水平，分析检测结果。结果 126例感染期DFI患者共培养分离病原菌147株，包括革兰阴性菌84株、革兰阳性菌52株、真菌11株，主要病原菌为铜绿假单胞菌、奇异变形菌、金黄色葡萄球菌；感染期患者LC3、Beclin-1表达水平均低于感染控制期患者，P62表达水平和WBC、CRP、PCT水平均高于感染控制期患者，差异有统计学意义(P<0.05);重度感染患者LC3、Beclin-1表达低于中度、轻度感染患者，P62表达高于中度、轻度感染患者，中度感染患者LC3、Beclin-1表达低于轻度感染患者，P62表达高于轻度感染患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 DFI患者感染病原菌主要为革兰阴性菌，常见菌为铜绿假单胞菌、奇异变形菌、金黄色葡萄球菌，感染后DFI患者LC3、Beclin-1表达降低而感染指标水平和P62表达提高，且三者表达水平与感染程度有关。     

肺炎克雷伯菌调控肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬的机制研究

目的探讨肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬体与肺炎克雷伯菌相互作用的分子机制。方法建立体外肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)感染A549细胞模型,分为感染组(Pneu)、自噬抑制组(Pneu+3-MA)、自噬诱导组(Pneu+rapa)、阴性对照组(ctrl),每组3个样本;通过免疫荧光染色与western-blot实验检测肺炎克雷伯菌不同时间点及不同浓度感染后细胞中自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达变化及分布情况;进一步采用自噬抑制剂3-Methyladenine (3-MA)与激动剂雷帕霉素(Rapamycin)干预细胞,观察K.pneumoniae感染A549细胞后自噬水平的变化。结果与未感染肺炎克雷伯菌的对照组相比,共聚焦显微镜观察感染组细胞LC3自噬体发生明显改变(P<0.05),western-blot检测感染组细胞LC3Ⅱ蛋白表达上升(P<0.05),且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高(P<0.05),表明肺炎克雷伯菌能够促进细胞自噬,随着细菌感染细胞比例(MOI)的增大,细胞自噬随之增多,随着时间的延长,肺炎克雷伯菌对细胞的入侵能力减弱(自噬增加),LC3Ⅱ蛋白的表达逐渐增加。自噬抑制剂和激动剂处理细胞后,免疫荧光和western-blot检测结果显示,感染组、自噬诱导组的LC3Ⅱ蛋白高于对照组(P<0.05),采用3-MA处理的感染组LC3Ⅱ蛋白低于感染组(P<0.05),表明3-MA能够抑制细胞的自噬,Rapamycin可以促进细胞的自噬。结论自噬在肺泡Ⅱ型上皮细胞抵抗肺炎克雷伯菌过程中发挥着非常重要的作用。     

亚慢性砷暴露对大鼠肝脏自噬作用影响

目的从细胞自噬角度探讨亚慢性砷暴露对大鼠肝脏自噬作用的影响及相关分子机制。方法 40只150～180 g SD大鼠,随机分为对照组、砷暴露高、中、低剂量组(NaAsO_2 8、4、2 mg/kg);灌胃给予不同浓度的含砷水,对照组给予等量生理盐水,连续12周,每周6 d。12周后处死大鼠取肝组织与全血。苏木素–伊红染色(HE)法观察大鼠肝脏病理变化;透射电子显微镜观察大鼠肝脏细胞超微形态;生化法检测血清谷丙转氨酶(ALT)与谷草转氨酶(AST)含量;Western blot法检测自噬相关蛋白微管轻链蛋白–3(LC3)、P62/sequestosome-1(SQSTM1)、哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)、磷脂酰肌醇3–激酶(PI3K)、beclin 1(BECN 1)蛋白表达。结果 HE染色结果显示,砷暴露可造成肝组织病理损害,其损伤程度呈剂量依赖性;肝组织的超微结构可见砷暴露组大鼠肝脏双层膜自噬小体与自噬空泡明显增多;与对照组比较,高剂量NaAsO_2组ALT、AST [分别为(98.68±22.46)、(125.00±13.34)U/L]活力上升(P 0.05);与对照组[LC3-II/LC3-I(1.03±0.02)、P62(1.36±0.29)、beclin 1(1.27±0.13)、PI3K(0.96±0.037)、mTOR(0.97±0.05)]比较,NaAsO_2高、中剂量组大鼠肝脏中LC3-II/LC3-I比值[(1.63±0.11)、(2.91±0.05)]升高,beclin 1蛋白表达[(0.84±0.27)、(0.98±0.10)]与mTOR蛋白表达[(0.49±0.02)、(0.56±0.11)]下降(P 0.05),高、中、低剂量NaAsO_2组大鼠肝脏中P62蛋白表达[分别为(0.32±0.05)、(0.13±0.01)、(0.34±0.05)]均下降(P 0.05)。结论 NaAsO_2暴露可诱导大鼠肝脏细胞自噬的发生,其机制可能与调控PI3K/mTOR信号通路有关。     

益生菌对力竭运动大鼠肠上皮细胞自噬的影响

目的研究补充益生菌对力竭运动大鼠肠上皮细胞自噬水平的影响。方法将SD大鼠随机分为安静对照组、力竭运动组,力竭运动+益生菌低、中、高剂量组。各组灌胃不同剂量的益生菌溶液,6周力竭运动训练后,经腹腔注射麻醉后迅速剖腹大鼠,取远端回肠30cm。通过透射电镜观察大鼠肠上皮细胞自噬变化和测定大鼠肠上皮细胞Atg16L1、Beclin-1和LC3 mRNA及蛋白表达。结果力竭运动组大鼠肠黏膜上皮细胞可见大量的自噬体,力竭运动+益生菌低剂量组大鼠自噬体数目明显较少,而力竭运动+益生菌中剂量和力竭运动+益生菌高剂量组大鼠没有自噬体的产生。ME组大鼠肠上皮细胞Atg16L1、Beclin-1、LC3 mRNA和蛋白表达均高于安静对照组(P0.01或P0.05);MEYZ组和MEYG大鼠肠上皮细胞Atg16L1、Beclin-1、LC3 mRNA表达均低于ME组(P0.01)。MEYZ组大鼠肠上皮细胞Beclin-1蛋白表达低于ME组(P0.05)。MEYD、MEYZ和MEYG组大鼠LC3蛋白表达均低于ME组(P0.01)。结论长时间的力竭运动诱发大鼠肠上皮细胞自噬体的产生,起到防御氧化应激致使肠上皮细胞受到损伤。通过补充益生菌后降低了Atg16L1、Beclin-1和LC3的表达。表明益生菌起到保护肠上皮细胞受到损伤和有效抑制反复力竭运动大鼠肠上皮细胞自噬的产生。     

1,4苯醌对K562细胞自噬的影响及机制

[目的]研究1,4苯醌(1,4-BQ)对人慢性髓系白血病K562细胞自噬的影响及其机制。[方法]选择人慢性髓系白血病K562细胞,采用1,4-BQ、自噬早期抑制剂LY294002和自噬晚期抑制剂氯喹(CQ)进行染毒处理,分为对照组、1,4-BQ染毒组(5、10、20μmol/L)、LY294002组(10μmol/L)、CQ组(10μmol/L)、1,4-BQ(20μmol/L)+LY294002(10μmol/L)组和1,4-BQ(20μmol/L)+CQ(10μmol/L)组。应用MTT法检测细胞增殖率;采用CYTO-ID荧光探针并运用荧光染色法和流式细胞术法对细胞自噬水平进行定性、定量检测;采用丫啶橙染色法检测细胞溶酶体pH值;运用实时定量PCR法和Western blot法检测LC3-Ⅱ和P62自噬相关基因和蛋白的表达水平。[结果]10、20μmol/L的1,4-BQ分别作用K562细胞24、48、72 h后,细胞相对增殖率明显降低(P0.05)。CYTO-ID自噬荧光染料特异性聚集在K562细胞胞质内,随着染毒浓度增加荧光强度明显增强。流式细胞术结果显示,与对照组相比,5、10、20μmol/L 1,4-BQ组自噬水平均明显增加,差异具有统计学意义(P0.05)。丫啶橙染色结果显示,不同浓度1,4-BQ组红色荧光强度均高于对照组,即1,4-BQ组溶酶体pH明显降低。Western blot结果显示,当1,4-BQ浓度为10、20μmol/L时,LC3-Ⅱ和P62蛋白表达量明显高于对照组(P0.05),且在染毒24 h时增幅最大。干预自噬后,与1,4-BQ组相比,1,4-BQ+LY294002组的自噬水平和LC3-Ⅱ蛋白表达量均降低(P0.05)。与1,4-BQ组相比,1,4-BQ+CQ组自噬水平增加(P0.05),而与CQ组的差异无统计学意义。此外,与对照组相比,CQ组LC3-Ⅱ蛋白表达明显增加(P0.05)。与1,4-BQ组相比,1,4-BQ+CQ组LC3-Ⅱ蛋白表达水平差异无统计学意义(P0.05)。[结论]1,4-BQ可引起K562细胞LC3-Ⅱ、P62蛋白表达增加,可能是通过增加自噬体的合成和减少自噬体的降解从而增加细胞自噬。     

隐丹参酮对人肝癌HepG2细胞自噬及PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

目的观察隐丹参酮对人肝癌HepG2细胞自噬的影响,并探讨其可能机制。方法体外培养HepG2细胞,采用CCK-8检测细胞活力,并计算IC_(50);Annexin V-FITC/PI双染法检测HepG2细胞凋亡;mRFP-GFP-LC3转染HepG2细胞,检测自噬流情况;Western blot分析检测自噬相关蛋白LC3,Beclin-1及PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白的表达。结果隐丹参酮可显著抑制HepG2细胞活力,并诱导细胞凋亡;隐丹参酮显著增加HepG2细胞自噬小体及自噬溶酶体数量(P0.05);隐丹参酮显著升高HepG2细胞LC3-II/LC3-I比值及Beclin-1表达(P0.05),同时降低p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR(P0.05)。结论隐丹参酮可诱导HepG2细胞自噬,其机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路有关。     

自噬及凋亡因子在慢性氟中毒大鼠肝脏中表达

目的探讨自噬相关因子LC3A、Beclin-1及凋亡因子Bcl-2、Bax在慢性氟中毒大鼠肝脏中的表达意义。方法将36只健康SD大鼠按体重随机分为对照组、低氟组、高氟组,分别用含氟量1 mg/L的自来水和含氟5、50 mg/L的含氟水饲养6个月,观察氟斑牙形成情况;测定尿氟、骨氟含量以及大鼠肝功能;苏木素-伊红染色观察肝脏病理形态学改变;免疫组织化学法检测大鼠肝组织中微管相关蛋白轻链3A(LC3A)、哺乳动物ATG6同源蛋白(Beclin-1)及B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤/白细胞基因伴随蛋白x(Bax)的蛋白表达水平。结果与对照组比较,低、高氟组大鼠尿氟含量分别为[(2.18±0.14)、(2.40±0.19)mg/L]、骨氟含量分别为[(237.42±18.48)、(248.00±14.72)mg/kg]均明显升高(P0.05);染氟组大鼠肝脏肝细胞索排列紊乱,肝细胞肿大,部分肝细胞胞质透亮,呈空泡样改变;与对照组比较,染氟组大鼠血清中谷丙转氨酶活性及谷草转氨酶活性明显升高(P0.05);低、高氟组大鼠肝脏LC3A[(35.35±2.71)、(44.10±6.72)]、Beclin-1[(57.56±12.1)、(74.76±18.67)]及Bax[(51.1±9.23)、(62.32±10.3)]蛋白表达明显高于对照组,Bcl-2蛋白表达分别为[(55.18±8.36)、(39.05±6.91)]明显低于对照组(P0.05)。结论过量氟可激活大鼠肝组织中自噬和凋亡因子,自噬和凋亡可能共同参与慢性氟中毒所致肝脏损伤的发病过程。     

孕哺期及成年期饮水高氟暴露致子代大鼠学习记忆损伤及大脑海马组织凋亡与自噬

目的研究饮水途径高氟暴露对大鼠学习记忆能力的影响,并探索凋亡和自噬在高氟致海马组织损伤的作用。方法妊娠的清洁级SD大鼠饮用含氟量不同(10、50、100 mg/L NaF)的自来水,子代鼠从出生至断乳前通过母乳接触NaF;断乳后,各组子代鼠接受与亲代相同的氟暴露处理至出生后第60天,以Morris水迷宫试验检测大鼠的空间学习记忆能力,通过Western blot方法检测海马组织中与凋亡相关蛋白(Bcl-2和Bax)以及与自噬相关蛋白(Beclin-1、mTOR、LC3-Ⅱ和p62)的表达水平。结果与对照组相比,雄性子代大鼠100 mg/L NaF染毒组到达平台的潜伏期和路径距离明显增加(P0.05),雌性子代大鼠100 mg/L和50 mg/L NaF染毒组到达平台的潜伏期和路径距离也明显增加(P0.05);雌、雄子代大鼠100 mg/L和50 mg/L NaF染毒组子代大鼠海马组织中Bax、Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平均明显上调(P0.05),Bcl-2、mTOR和p62蛋白表达水平均明显下调(P0.05)。结论孕哺期及成年期饮水高氟暴露致子代大鼠空间学习记忆能力的损伤可能与海马组织自噬作用增强有关,同时可能伴随海马组织凋亡发生。     

miR-138-5p在锰致SH-SY5Y细胞自噬中的作用

[目的]探讨miR-138-5p在氯化锰(MnCl_2)诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞自噬中的作用及其机制。[方法]以生理盐水处理组作为对照,0.125、0.25、0.5、1 mmol/L MnCl_2染毒SH-SY5Y细胞6 h后,利用MTT法检测细胞活力;0.25和0.5 mmol/L MnCl_2处理细胞6 h后,采用Western blot检测自噬相关蛋白LC3和Beclin1的表达;MnCl_2染毒6 h后,使用反转录PCR和Western blot检测miR-138-5p和组蛋白脱乙酰酶SIRT1 mRNA以及蛋白表达的变化;使用miRNA模拟物转染细胞实现miR-138-5p过表达,然后0.25 mmol/L MnCl_2染毒6 h,检测SIRT1 mRNA和蛋白的表达以及自噬相关蛋白LC3和Beclin1的变化。[结果]MnCl_2可剂量依赖性地降低SH-SY5Y细胞活力(趋势χ~2=12.42,P0.05)。与对照组相比,0.25、0.5 mmol/L MnCl_2染毒后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值和Beclin1表达水平明显增加(P0.05);miR-138-5p表达下调,SIRT1 mRNA及蛋白表达上调(均P0.05)。miR-138-5p过表达后,相比未过表达的MnCl_2染毒组,SIRT1 mRNA及蛋白表达均出现下调,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值及Beclin1蛋白表达也相应下调(P0.05)。[结论]miR-138-5p过表达可通过调节SIRT1的表达抑制锰诱导的SH-SY5Y细胞自噬。     

活性氧在1,4-苯醌诱导的线粒体自噬中的作用

目的探讨苯的代谢产物1,4-苯醌(1,4-BQ)能否活化PINK1/Parkin介导的线粒体自噬,以及活性氧(ROS)在线粒体自噬发生中的作用。方法以人早幼粒白血病细胞HL60为受试细胞,将其分为对照组、1,4-BQ组、N-乙酰半胱氨酸(NAC)组和1,4-BQ+NAC组。采用透射电镜观察细胞超微结构,采用蛋白免疫印迹法检测自噬蛋白LC3、PINK1和Parkin表达,采用DCFH-DA染色法测定胞内ROS含量。结果对照组细胞线粒体呈正常杆状结构,嵴线分明;1,4-BQ组可见呈椭圆肿胀变形的线粒体和包含双层膜性结构的线粒体自噬体。与对照组比较,1,4-BQ组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、PINK1、Parkin蛋白表达和ROS含量均增加(P0.05);1,4-BQ+NAC组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、PINK1、Parkin蛋白表达和ROS含量均低于1,4-BQ组(P0.05)。结论 1,4-BQ可诱导PINK1/Parkin途径的线粒体自噬,且ROS在诱导的线粒体自噬中起重要作用。     

苯代谢物氢醌促进人T细胞白血病细胞自噬的研究

目的探讨苯代谢物氢醌(hydroquinone,HQ)对人T细胞白血病细胞株(Jurkat细胞)自噬水平的影响及其作用机制。方法取对数生长期的Jurkat细胞,分别暴露于含终浓度为0(对照)、6.25、12.5、25、50μmol/L HQ的培养基处理24 h。采用单丹黄酰尸胺(MDC)染色法检测Jurkat细胞内自噬囊泡的生成;通过透射电子显微镜观察Jurkat细胞内自噬体的超微结构;采用Western blot法检测自噬标志性蛋白微管相关蛋白1A/1B轻链3B(LC3B)、P62蛋白及经典的自噬调节通路磷脂酰肌醇3激酶/丝苏氨酸蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路中人第10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源等位基因(PTEN)、Akt与磷酸化Akt(p-Akt)蛋白的表达情况。结果 Jurkat细胞内MDC荧光强度随着HQ浓度的升高而增强,在胞浆中呈点状分布。HQ染毒组Jurkat细胞出现较多的双层膜自噬体结构,伴有线粒体明显肿胀,内质网扩张等超微结构的改变。与对照组比较,各剂量HQ染毒组Jurkat细胞内LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ蛋白的表达水平及6.25、12.5μmol/L HQ染毒组Jurkat细胞内P62蛋白的表达水平均较高,差异均有统计学意义(P0.05);且随着HQ染毒浓度的升高,Jurkat细胞内LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ蛋白的表达水平均呈上升趋势,而P62蛋白的表达水平呈先上升后下降的趋势。与对照组比较,12.5、25、50μmol/L HQ染毒组Jurkat细胞内PTEN蛋白的表达水平均较高,而各剂量HQ染毒组Jurkat细胞内p-Akt蛋白的表达水平均较低,差异均有统计学意义(P0.05);但各剂量HQ染毒组Jurkat细胞内Akt蛋白的表达水平均无明显改变(P0.05)。且随着HQ染毒浓度的升高,Jurkat细胞内PTEN蛋白的表达水平呈上升趋势,p-Akt蛋白的表达水平呈下降趋势。结论 HQ可促进Jurkat细胞内自噬水平的增加,其作用机制可能与PI3K/Akt信号通路被抑制有关。     

宫颈癌组织Beclin-1、LC3-B的表达及与临床病理因素的关系

目的研究宫颈癌及相关组织中自噬基因Beclin-1、LC3-B的表达情况,并分析其与患者年龄、组织分化、临床期别、淋巴结转移状况等临床病理因素的关系。方法选取2014年3月-2016年3月西安交通大学第二附属医院124例石蜡包埋宫颈(癌)组织,包括80例宫颈鳞状细胞癌、24例宫颈腺癌、20例因子宫肌瘤或子宫腺肌病等原因切除的正常宫颈组织或炎性宫颈组织。制作宫颈(癌)组织芯片,量子点免疫荧光组织化学技术检测Beclin-1、LC3-B蛋白的表达,结合临床病理参数进行统计学分析。结果本研究观察到Beclin-1、LC3-B阳性信号在胞浆着色,相对于宫颈正常的上皮组织,Beclin-1、LC3-B阳性信号在宫颈癌中表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。宫颈鳞状细胞癌中,Beclin-1、LC3-B蛋白表达与宫颈癌患者年龄、组织学级别、肿瘤分期及淋巴结转移等临床病理参数均无明显相关性(均P>0.05)。35例Beclin-1阳性表达的宫颈鳞状细胞癌组织中,检测出20例LC3-B阳性表达;45例Beclin-1阴性表达的宫颈鳞状细胞癌组织中,检测出33例LC3-B阴性表达。提示Beclin-1蛋白表达与LC3-B蛋白表达呈正相关(r=0.309,P=0.005)。结论宫颈癌细胞中Beclin-1、LC3-B的表达下降与宫颈癌的发生发展有关。     

骨科术后切口感染LC-3和Beclin-1与P62表达水平及临床意义

目的探讨骨科术后切口感染患者微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬特异性基因Beclin-1、P62表达水平及临床意义。方法选取2017年1月-2019年12月海南医学院第二附属医院收治的行骨科外科术后切口感染患者102例(研究组),选取同期行骨科外科术后未出现切口感染患者96例(对照组),免疫组化法检测创面组织LC3、Beclin-1、P62表达水平并分析其临床价值,分析骨科切口感染危险因素。结果与对照组相比,研究组年龄≥60岁、体质量指数(BMI)≥28 kg/m~2、手术时间≥2 h、术中出血量≥1000 ml、住院时间≥2周构成比、降钙素原(PCT)、白细胞计数(WBC)、C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-ɑ)水平和P62免疫组化评分均升高(P<0.05),LC3、Beclin-1免疫组化评分降低(P<0.05)。LC3、Beclin-1免疫组化评分与感染严重程度呈负相关(P<0.05),P62免疫组化评分与感染严重程度呈正相关(P<0.05);LC3免疫组化评分与CRP水平呈负相关(P<0.001),Beclin-1免疫组化评分与PCT、WBC、CRP水平均呈负相关(P<0.05),P62免疫组化评分与CRP水平均呈正相关(P<0.05)。年龄≥60岁、BMI≥28 kg/m~2、手术时间≥2 h、术中出血量≥1000 ml、住院时间≥2周是骨科患者切口感染的危险因素(P<0.05)。结论LC3、Beclin-1、P62表达水平与切口感染严重程度存在相关性,年龄、肥胖、手术时间、术中出血量及住院时间延长会增加切口感染风险。     

缺血性脑血管病细胞自噬相关因子与斑块炎性反应的相关性

目的 探讨缺血性脑血管患者细胞自噬相关因子与炎性因子的相关性,为完善其病理机制,寻找新的治疗靶点提供依据.方法 选取缺血性脑血管病患者85例,按照颈动脉斑块分级分为三组:Ⅰ级21例、Ⅱ级35例、Ⅲ级29例,并以33例健康志愿者为对照组.抽取空腹肘静脉血,采用WB法测定自噬相关因子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ与Beclin-1的蛋白表达量,采用ELISA法测定炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平.结果 对照组、Ⅰ级斑块、Ⅱ级斑块、Ⅲ级斑块的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1表达和血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平依次升高(P<0.05);经Pearson分析,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达与IL-1β、IL-6和TNF-α水平之间,Beclin1表达与IL-1β、IL-6和TNF-α水平之间均呈线性正相关(P<0.05);经秩相关分析,颈动脉斑块分级与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、IL-1β、IL-6、TNF-α之间均呈正相关性(P<0.05).结论 缺血性脑血管病患者细胞自噬能够通过与炎性反应的相互作用影响斑块稳定性,可能为其病理机制的重要组成部分.     

UVB诱导A375细胞自噬与凋亡调控机制探讨

目的探究中波紫外线(UVB)对人表皮黑色素瘤细胞株A375细胞自噬与凋亡的诱导效应。方法 (1)取对数生长期A375细胞,分别予剂量为10.0、15.0 m J/cm~2的UVB照射,于照射后3、6、9、12 h收集细胞,用单丹磺酰戊二胺染色法观察细胞自噬,用吖啶橙/溴乙锭染色法观察细胞凋亡。(2)予相应剂量的UVB照射10.0、15.0 m J/cm~2组A375细胞,于照射后18、24、36、48 h收集细胞,以CCK-8法检测细胞存活率。(3)予剂量为10.0、15.0 m J/cm~2的UVB照射A375细胞,于照射后3、6、9、12 h收集细胞;予剂量为2.5、5.0、7.5、10.0、15.0 m J/cm~2的UVB照射A375细胞,于照射后9 h收集细胞;用免疫印迹法检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Bcl-2相互作用蛋白(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ的表达。上述3个实验均另设不予UVB照射(予假照射)的对照组。结果 (1)剂量为10.0、15.0 m J/cm~2的UVB照射诱导的A375细胞自噬和细胞凋亡均表现为随着照射后时间的延长而增强,但在15.0 m J/cm~2UVB照射后12 h,细胞自噬已观察到降低。(2)10.0、15.0 m J/cm~2组细胞活力均随照射后时间的推移而增加(P0.05);在照射后18~48 h,10.0和15.0 m J/cm~2组细胞活力均低于对照组(P0.05);在照射后24~48 h,15.0 m J/cm~2组细胞活力均低于10.0 m J/cm~2组(P0.05)。(3)10.0 m J/cm~2组细胞Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白相对表达水平在照射后0~12 h内均随照射时间的增加而增加(P0.05),而15.0 m J/cm~2组细胞仅在照射后0~9 h内观察到上述改变,在12 h时间点上述2个自噬相关蛋白明显下降(P0.05);10.0和15.0 m J/cm~2组细胞Bcl-2蛋白相对表达水平在照射后3~12 h内均随照射时间的增加而下降(P0.05),Bax蛋白相对表达水平均在照射后0~12 h内随照射时间的增加而增加(P0.05)。0.0~10.0 m J/cm~2组细胞Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白相对表达水平,0.0~15.0 m J/cm~2组细胞Bax蛋白相对表达水平,均随照射剂量的增加而增加(P0.05);5.0~15.0 m J/cm~2组Bcl-2蛋白相对表达水平随照射剂量的增加而下降(P0.05)。结论剂量为10.0和15.0 m J/cm~2UVB照射均可诱导A375细胞发生自噬和凋亡;10.0 m J/cm~2UVB照射诱导的细胞自噬可部分抵抗UVB对凋亡的诱导而使细胞活力增强,15.0 m J/cm~2UVB诱导的自噬不足以发挥上述作用,且以诱导凋亡为主导效应。     

N-乙酰半胱氨酸抑制亚砷酸钠诱导心肌细胞凋亡和自噬作用的研究

目的:探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)抑制亚砷酸钠诱导H9C2细胞凋亡和自噬作用及机制。方法:用亚砷酸钠诱导H9C2细胞构建凋亡和自噬模型。采用CCK-8比色法检测细胞的存活率,Hoechst 33258核染色法观察凋亡细胞的形态和数量改变.双氯荧光素染色法检测细胞内活性氧(ROS)水平,Western Blot法测定蛋白P53、Bcl-2、Bax及LC3的表达水平,以及磷酸化ERK1/2蛋白及ERK1/2蛋白总量的表达水平。结果:与对照组相比,15μM亚砷酸钠处理的H9C2细胞存活率显著降低.细胞内ROS水平明显增加.凋亡细胞数量明显增多,自噬标志蛋白LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值明显增大(P0.01)。1 mM NAC预处理后显著减少H9C2细胞内ROS的生成和促凋亡蛋白P53和Bax的表达,诱导抗凋亡蛋白Bcl-2表达升高,同时降低自噬相关蛋白LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值。亚砷酸钠处理诱导ERK1/2蛋白磷酸化(P0.01),而NAC和亚砷酸钠共处理抑制了ERK1/2蛋白的磷酸化。结论:亚砷酸钠降低H9C2细胞的存活率,增加细胞内ROS的生成,诱导细胞凋亡和自噬。NAC通过降低H9C2细胞内的ROS水平和抑制ERK1/2蛋白的磷酸化拮抗亚砷酸钠诱导的细胞凋亡和自噬。     

2,2’,4,4’-四溴联苯醚对人神经母细胞瘤细胞自噬水平的影响

目的探讨2,2’,4,4’-四溴联苯醚(2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ethers,PBDE-47)对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞自噬水平的影响。方法取对数生长期的SH-SY5Y细胞,分别以终浓度为0(溶剂对照)、1、5、10μmol/L的PBDE-47染毒处理24 h后,采用透射电子显微镜观察细胞内双层膜自噬体结构;以自噬囊泡示踪剂单丹黄酰尸胺(MDC)染色检测自噬囊泡生成情况;采用Western blotting技术检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1、P62的表达水平。结果电镜超微结构观察结果显示,对照组细胞内未见异常变化,1μmol/L染毒组细胞内可见轻微的线粒体扩张但未见明显的双层膜自噬体结构,5μmol/L染毒组细胞内可见明显的线粒体空泡及双层膜自噬体结构,10μmol/L染毒组细胞内观察到的双层膜自噬体结构最多;与对照组相比,5、10μmol/L PBDE-47染毒组MDC荧光强度升高,MDC阳性细胞比例增加;此外,5、10μmol/L PBDE-47染毒组自噬相关蛋白LC3、Beclin1、P62的表达水平与对照组相比均明显升高,且差异具有统计学意义(P0.05)。结论 PBDE-47可诱导SH-SY5Y细胞自噬水平的增加。     

AMPK-mTOK信号通路参与百草枯致PC12细胞的自噬抑制作用

目的探讨AMPK-mTOR信号转导通路在百草枯(paraquat,PQ)诱导大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞(PC12)自噬异常中的调控作用。方法用终浓度0、25、50、100、200、300、400 μmol/L PQ处理PC12细胞24 h,300 μmol/L PQ处理细胞不同时间(6、12、24、48 h),四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞相对存活率,确定剂量/时间-效应关系;终浓度0、100、200、300 μmol/L PQ处理细胞24 h,分光光度法检测培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)活力;二氯荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)法检测细胞内活性氧(ROS)水平;单丹磺酰尸胺(MDC)染色法观察自噬溶酶体的表达及分布变化;免疫荧光(IF)检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达水平;免疫印迹法(Western blot)检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ、p62、Beclin1及AMPK-mTOR信号通路蛋白p-AMPK、p-mTOR表达水平。结果与对照组比较,100、200、300、400 μmol/L PQ染毒组的细胞存活率明显降低,且呈剂量依赖关系,差异有统计学意义(P<0.05)。300 μmol/L PQ处理细胞不同时间(6、12、24、48 h),细胞存活率随染毒时间的延长而下降,其中12、24、48 h染毒组的差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,100、200、300 μmol/L PQ染毒组细胞上清液中LDH活力明显升高,细胞内ROS荧光强度明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);MDC染色结果显示,PQ染毒组的自噬溶酶体在核周分布密度降低、荧光强度减弱、自噬水平降低;免疫荧光结果显示,PQ染毒组的LC3荧光强度减弱,细胞自噬水平下降,与MDC染色结果一致。Western blot结果显示,与对照组比较,PQ染毒组的自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1表达水平均明显降低,而p62蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。200、300 μmol/L PQ染毒组的p-AMPK蛋白表达水平降低,p-mTOR蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PQ致PC12细胞损伤过程中,细胞自噬水平降低,AMPK-mTOR信号通路发挥调节作用。