RNA干扰降低环氧化酶2基因表达对人胆管癌QBC939细胞的体外作用

目的研究小干扰RNA（siRNA）降低环氧化酶2（COX-2）基因对胆管癌QBC939细胞凋亡及凋亡蛋白caspase-3蛋白表达的影响。方法采用RNA干扰的方法,将胆管癌细胞株QBC939细胞分为4组：COX-2 siRNA干预组、阴性对照siRNA组、空脂质体、空白对照组。将COX-2 siRNA转染入QBC939细胞;流式细胞仪检测siRNA降低COX-2基因表达对凋亡的作用,WesternBlot法检测siRNA降低COX-2基因表达对caspase-3表达变化的影响。结果 RNA干扰后QBC939细胞COX-2表达下降至空白对照组的42%,流式细胞仪检测结果显示COX-2 siRNA干预组细胞的凋亡率以及凋亡蛋白caspase-3的表达明显高于其他3个对照组。结论 RNA干扰可抑制细胞COX-2蛋白的表达,促使胆管癌QBC939细胞的凋亡,caspase-3途径可能是其调控通路之     

CXCR4 RNA干扰序列筛选及对结肠癌细胞SW480生长的影响

目的筛选细胞表面趋化因子受体（CXCR4） RNA干扰高效序列,探讨其对SW480细胞生长的影响。方法采用RT-PCR和Western blot方法选择最有效的CXCR4 RNA干扰序列,流式细胞术分析转染该序列后SW480细胞生长情况。结果 sihCXCR4-3序列可使CXCR4 RNA相对含量仅为SW480组的5.4%,CXCR4蛋白相对表达量为18.95%。sihCXCR4-3组细胞数[（0.92±0.06）×105]低于SW480细胞组[（1.38±0.04）×105,P=0.0050]及NCsihCXCR4组[（1.28±0.05）×105,P=0.0256];相对SW480组和NCsihCXCR4组,sihCXCR4-3组的抑制率分别为33.03%及28.00%。sihCXCR4-3组G1期百分率明显低于SW480细胞组[（59.5±0.57）%vs.（74.11±0.54）%,P=0.0167];S期百分率高于SW480组[（23.85±0.24）%vs.（14.62±0.46）%,P=0.0305]和NCsihRNA组[（17.63±0.48）%,P=0.0013]。结论 sihCXCR4-3序列可高效沉默CXCR4基因表达,抑制SW480细胞生长。     

靶向Plk1基因的shRNA对肝癌BEL-7402细胞株生物学行为及化疗增敏的影响

目的 利用RNA干扰技术(RNAi),研究表达Polo-like kinase 1 (Plk1)的短发夹RNA (shRNA)载体对肝癌细胞株BEL-7402生物学行为及对化疗药物长春新碱敏感性的影响. 方法 根据靶基因的不同区域构建针对Plk1mRNA的两组干扰质粒shRNA-Plk1:Plk1siRNA-251,Plk1siRNA-1396以及阴性对照质粒Plk1siRNA-hk,利用电穿孔法转染入肝癌细胞株BEL-7402,用长春新碱处理细胞后,用MTT法检测四组细胞的生长抑制率,计算IC50值,流式细胞仪检测各组细胞凋亡. 结果 半定量RT-PCR检测Plk1siRNA-251,Plk1siRNA-1396组Plk1mRNA、Cdc25CmRNA表达较Plk1siRNA-hk转染组与空白对照组明显下降(P＜0.01),p53mRNA表达增加.长春新碱处理后,Plk1siRNA-251组和Plk1siRNA-1396组与BEL7402组之间的生长抑制率有显著性差异(P＜0.01).5 μg/ml浓度长春新碱作用24h后,Plk1siRNA-251组和Plk1siRNA-1396组凋亡指数分别为19.09％ ±3.97％、19.80％ ±5.47％明显高于Plk1siRNA-hk组和BEL7402组(P＜0.01).结论 成功筛选出两条能特异而高效抑制Plk1基因表达的shRNA,可以显著抑制Plk1 mRNA、Cdc25CmRNA及Plkl蛋白的表达,并使p53mRNA表达增高,并明显抑制细胞增殖,能增加长春新碱的化疗敏感性,从而为进一步研究该基因的功能和作用机制提供了新的手段.     

RNA干扰RelB基因对小鼠RM-1前列腺癌细胞株放射敏感性的影响及其机制

目的:探讨RNA干扰RelB基因对鼠RM-1前列腺癌细胞株放射敏感性的影响及其机制。方法:利用靶向RelB基因的慢病毒载体(pLentilox-sh-RelB),脂质体介导转染RM-1细胞后进行放射(2,4,6,和8Gy剂量)处理培养,分别采用RT-PCR、Western印迹法及流式细胞术等方法检测RelB的mRNA和蛋白表达,锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活力及细胞放射敏感性的变化。结果:转染后放射处理培养,siRelB-RM-1组RelB的mRNA和蛋白表达水平明显低于siVector-RM-1组和nontrans-RM-1组(P<0.05);放射处理培养后siRelB-RM-1组细胞凋亡百分率明显高于siVector-RM-1组和nontrans-RM-1组(P<0.05);培养后siRelB-RM-1组细胞Mn-SOD活力下降,放射增敏比为5.13。结论:RNA干扰RelB基因可增强鼠RM-1前列腺癌细胞株放射后的放射敏感性,其机制可能与RNA干扰RelB基因,抑制细胞增殖,降低Mn-SOD活力和诱导凋亡有关。     

靶向Wnt10b的小干扰RNA抑制胚胎皮肤毛囊发育的初步研究

目的 利用小干扰RNA(siRNA)抑制皮肤Wnt10b基因的表达,观察Wnt10b基因沉默能否抑制毛囊的发育并探讨其潜在机制.方法 化学合成siRNA-Wnt10b,将siRNA转染体外培养的胎鼠背部皮肤,荧光定量PCR检测转染后不同时间段皮肤组织Wnt10b和p-连环蛋白(β-catenin) mRNA的表达,Western blot检测转染后72 h皮肤组织的Wnt10b和β-catenin蛋白含量.将转染后72 h的皮肤组织石蜡包埋、切片,HE染色,镜下观察各组毛囊发育情况并做统计学处理.结果 siRNA-Wnt10b转染后的24、48 h,胎鼠背部皮肤Wnt10b mRNA的表达呈不同程度下降;但β-catenin mRNA表达未随Wnt10b mRNA水平的起伏而明显波动;转染后72 h,Wnt10b蛋白和β-catenin的蛋白表达同时减少,新形成毛囊数量也随之减少(t=3.254,P=0.002).结论 在体外器官培养的环境中,siRNA-Wnt10b能够抑制胎鼠背部皮肤组织Wnt10b蛋白的表达,减少新形成毛囊的数量;Wnt10b可能只在蛋白水平上调控细胞β-catenin的表达.     

肾癌ACHN细胞HIF-1α基因siRNA真核表达质粒的构建与筛选

目的采用RNA干扰方法,构建及筛选对肾透明细胞癌ACHN细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因有干扰沉默作用的真核表达质粒。方法 CoCl2缺氧诱导培养ACHN细胞高表达HIF-1α,设计并化学合成4条针对HIF-1α基因的小干扰RNA（siRNA）序列,构建相应真核表达质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2/3/4,经测序分析,质粒构建成功后,分别转染ACHN细胞后培养24h,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计算转染效率,采用荧光实时定量PCR（real time-PCR）和免疫印记杂交法（Western blot）分别检测HIF-1α的mRNA与蛋白表达水平。结果质粒构建后经测序显示与设计完全一致;荧光显微镜下观察到ACHN细胞表达绿色荧光蛋白,证实重组质粒已转入细胞,转染效率约为78%;实时定量PCR与Western blot结果显示,siRNA-1/2组HIF-1α的mRNA与蛋白表达较对照组均明显下降（P〈0.05）,质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2明显干扰抑制ACHN细胞HIF-1α基因表达,其中以质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1效果最佳。结论本实验成功构建靶向HIF-1α基因的真核表达质粒,并筛选出能有效抑制ACHN细胞HIF-1α基因表达的质粒pU6H1-GFP-HIF1α-siRNA-1/2,这为肾癌的基因治疗提供了新的方法和手段。     

1504-siRNA对EphA3表达肿瘤细胞HCT116的抑制作用研究

目的研究原癌基因EphA3的小干扰RNA(small interfering RNA)1504-siRNA对高表达结肠癌细胞HCT116的增殖抑制作用。方法将1504-siRNA质粒用Vigofect转染试剂瞬时转染HCT116细胞,36～48 h后,收集蛋白,用Western印迹检测EphA3及AKT信号通路中的蛋白分子表达,收集细胞,进行噻唑蓝(MTT)实验、平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。结果 1504-siRNA能抑制HCT116细胞的EphA3蛋白水平,抑制其增殖、平板克隆和软琼脂克隆的形成,抑制pmTOR、p-c-Raf、pAKT、p-4ebp1等信号分子的表达。结论 1504-siRNA抑制HCT116细胞的增殖、存活能力和恶性程度,这可能是通过抑制AKT信号通路来实现,它有望作为肿瘤治疗的候选药物。     

单核细胞趋化因子1发卡环RNA真核表达载体的构建

目的：构建单核细胞趋化因子1发卡环RNA真核表达载体。 方法：实验于2002—10／2003-05在解放军第二军医大学中心实验室完成。①单核细胞趋化因子1发卡小分子干扰RNA片段合成。（2）将发卡小分子干扰RNA克隆人质粒pSilencer产生重组质粒SiRNA—pSilencer-单核细胞趋化因子1。③分别用BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定，随机分为1，2样本，每份样本进行10次电泳，并且采用460bpi标准参照样。④将经酶切鉴定后的重组质粒作测序分析。 结果：①单核细胞趋化因子1发卡小分子干扰RNA片段被成功克隆进pSilencer-U6质粒中。②BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定可切出450bpi大小的片段，结果表明样本1，2均与参照以及marker相一致，从片段大小的角度初步确定酶切的准确。③DNA测序分析显示，重组质粒小分子干扰RNA编码序列与设计片段的序列完全一致。 结论：针对单核细胞趋化因子1发卡小分子干扰RNA片段的真核表达载体SiRNA—pSilencer-单核细胞趋化因子1的成功构建，为进一步研究其基因功能打下了基础。     

自动生化分析仪比色杯中反应残留物对酶法测定肌酐的干扰

目的对引起肌酐（Cr）酶法测定结果假性增高的原因进行分析。方法在日立7060C生化仪上,分别使用新、旧的2套比色杯,并使用2种Cr酶法试剂测定Cr。结果日立7060C比色杯使用较长时间后,发现测定过总蛋白（TP,双缩脲法）的比色杯,经过仪器清洗后,若该比色杯紧接着用A品牌的Cr试剂进行测定,可引起测定结果的假性增高;改用B品牌的Cr试剂,则未见测定结果的假性增高。更换新的比色杯后,测定过TP的比色杯对这2种品牌的Cr试剂都不产生比色杯携带污染,测定结果都不假性增高。结论日立7060C比色杯使用较长时间后,有些项目的反应产物可一定程度的吸附在比色杯上,引起比色杯携带污染,从而对一些抗干扰能力较差的试剂和项目产生干扰。     

22种金属离子对原子荧光光谱法测定锑的干扰研究

目的:研究金属及类金属元素对原子荧光光谱法测定锑的干扰。方法:用22种金属及类金属元素对原子荧光光谱法测定锑进行干扰试验,根据测定结果分析干扰金属的种类,比较不同浓度的金属离子对测定结果造成干扰。结果:铅、铁、锰、汞、硒、铬对锑测定产生正干扰,硒、汞较明显;铜、镍、锡、银、鉈、钴、铋对锑的测定产生负干扰,镍的干扰最大,其他金属离子不产生干扰或者干扰可以忽略。结论:存在严重干扰的金属离子有:镍、铜、银、硒,在选择掩蔽剂时要侧重考虑。