酪蛋白空肠灌注对急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺外分泌的影响

目的 观察空肠内灌注酪蛋白对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺外分泌的影响,并初步探讨其神经机制.方法 30只SD大鼠按随机数字法分为对照组、ANP组和肠内营养组.后2组以胰管内逆行注射牛磺胆酸钠法制作ANP模型.造模后24 h空肠插管分别灌注酪蛋白溶液(肠内营养组)和牛理盐水(埘照组和ANP组).每15 min收集胰液1次,共6次,记录胰液分泌量和检测胰液蛋白含量.取大鼠延髓孤束核,采用免疫组化法检测c-Fos蛋白表达.结果 ANP组和肠内营养组组内各时间段之间胰液分泌最无显著差别,两组相应时间段之间胰液分泌最也无显著差别,但均显著低于对照组对应时间段的胰液分泌量(P<0.05).对照组、ANP组和肠内营养组空肠灌注过程中胰液蛋白含量水平稳定,不同时间段间无明显差异,但ANP组和肠内营养组空肠灌注后0～15 min、15～30 min、30～45 min、75～90 min时间段内胰液蛋白含量均低于对照组(P<0.05).肠内营养组灌注后延髓孤束核c-Fos蛋白表达阳性,而埘照组和ANP组延髓孤束核c-Fos表达阴性.结论 空肠内酪蛋白灌注可促进延髓孤束核c-Fos表达,但不增加胰液分泌量和胰液蛋白含量.     

Hedgehog通路中Ptchl基因在人胃癌中高甲基化状态分析

目的 研究Hedgehog通路中Ptchl基因表达及其甲基化状态在胃癌发生中的变化.方法 分别抽提10例胃癌组织及其癌旁＞3 cm组织和胃癌细胞株AGS的总RNA和基因组DNA.实时定量逆转录多聚酶链反应(QRT-PCR)检测Ptch基因的mRNA表达.应用软件分析Ptchl基因5'调控序列的CpG岛状态,亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)分析甲基化水平.结果 对Ptchl mRNAla转录体转录起始位点(计为0点)上游-3950 bp和下游+2050 bp进行CpG岛分析,发现存在两个CpG岛,第1个为-1139 bp～+860 bp,第2个为+875 bp～+1692 bp.以第1个CpG岛的-870 bp～+229 bp区段内的19个CpG位点的BSP测序结果显示,胃癌细胞株AGS全部发生甲基化,胃癌组织中甲基化程度为16%～100%,平均64%±32%,癌旁组织甲基化程度为0%～42%,平均13%±14%,两组问差异有统计学意义(P＜0.05).Spearman秩相关分析发现,Ptchl基因甲基化同其表达呈负相关(r=-0.558,P=0.011).结论 Ptchl基因高甲基化参与胃癌的发生,可能为胃癌新的肿瘤标志物.     

人NPTX2基因原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化

目的 在大肠埃希菌中表达人神经元正五聚蛋白2(NPTX2),并对该重组蛋白进行纯化、鉴定.方法 双酶切 pReceiv-er-M15 NPTX2质粒获得人NPTX2全长cDNA,经Not I 和EcoR I 双酶切后,连接至谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-4T-1中,经限制性酶切、PCR和测序验证正确后,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导重组蛋白表达,采用Western blotting鉴定表达产物,亲和层析法纯化GST-NPTX2蛋白.结果 经酶切与测序鉴定证实原核重组载体pGEX4T-1-NPTX2构建成功,表达产物相对分子量为70kD左右,与预期值相符,Western blotting证实该蛋白具有免疫反应特异性,亲和层析法获得了纯化的GST-NPTX2蛋白.结论 构建了pGEX-4T-NPTX2原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达了GST-NPTX2融合蛋白.亲和纯化获得较高纯度的GST融合蛋白,为下一步继续研究NPTX2的生物学功能奠定了基础.     

十二指肠NaCl刺激对大鼠孤束核c-fos表达的影响

目的：探讨生理状态下,大鼠十二指肠受到不同浓度氯化钠刺激后,孤束核（NTS）中神经元的活动性。方法：在大鼠十二指肠内恒流灌注0.86mol／L NaCl、0.15mol/L NaCl、去离子水以及10^-4mol／L 5-HT,然后对各处理组中不同的NTS部位进行c-fos免疫组化,并作定量分析。结果：0.86mol／L NaCl以及5-HT组可以引起NTS各平面c-fos阳性神经元数量的增加,而且明显高于0.15mol／L NaCl组、去离子水组以及假手术组。结论：在大鼠十二指肠给予0.86mol／L NaCl,可以经迷走神经通路上传到NTS,由NTS整合内脏信息上传至更高一级中枢;而给予0.15mol／L NaCl和去离子水,则不能激活NTS内的内脏感觉神经元。     

13C-尿素呼气试验及其临床应用

幽门螺杆菌(Hp)是慢性胃炎、消化性溃疡的主要致病菌,并与胃癌、MALT淋巴瘤的发生发展密切相关.Hp感染的诊断方法中血清学检查和尿素呼气试验具有非侵入性、无痛苦和检查相对简单等优点 [1].为评价13C呼气试验(13CUBT)对Hp感染的诊断价值,我们引入深圳市微侵袭医疗技术有限公司提供的HeliView气相层析/核素比率质谱仪(韩国产),对2 010例在我科门诊或住院的患者进行检测分析,现将结果报告如下.     

cagⅡ在胃十二指肠疾病患者幽门螺杆菌中的检出率及其与幽门螺杆菌相关性疾病的关系

目的:探讨cagⅡ在胃十二指肠疾病患者幽门螺杆菌(H.pylori)中的检出率及其与H.pylori相关性疾病的关系.方法:H.pylori菌株分离自107例胃十二指肠疾病患者,其中慢性胃炎67例,消化性溃疡34例,胃癌6例.采用聚合酶链反应(PCR)技术,对107株H.pylori菌株cagⅡ中的597 bp片段进行扩增.结果:107株H.pylori菌株的cagⅡ阳性检出率为69.2%(74/107),慢性胃炎(64.2%)、消化性溃疡(79.4%)和胃癌(4/6)组的检出率无显著差异(P＞0.05).结论:cagⅡ在不同胃十二指肠疾病患者感染的H.pylori中均有检出,其分布与不同H.pylori相关性疾病的关系并不十分密切,cag Ⅱ在H.pylori致病中的意义还有待进一步研究.     

过氧化物酶增殖物激活受体激动剂(罗格列酮)在大鼠急性坏死性胰腺炎中的防治作用

目的:研究PPAR-γ增殖物激动剂(罗格Yqm)对ANP及合并肺损伤大鼠是否有保护作用.方法:50只健康雄性SD大鼠随机分为5组,正常对照组、假手术组、ANP组、罗格列酮预防组,罗格列酮治疗组.正常对照组,未做任何处理;假手术组,腹腔内注射同等剂量生理盐水;采用大剂量精氨酸腹腔注射诱导ANP模型,预防组于造模前60 min给予罗格列酮10ms/kg,2次,每次间隔30 min,治疗组于造模后60 min给予罗格列酮10 ms/kg,2次,每次间隔30 min.各组于造模后24 h处死大鼠,观察大鼠血清AMY、TNF-α和IL-1β水平变化,同时检测胰腺和肺的组织病理变化和肺组织髓过氧化物酶(MPO)的变化.结果:ANP组AMY、TNF-α、IL-1β和MPO均较对照组和假手术组明显升高(P<0.001);罗格列酮预防和治疗组血清AMY、TNF-α、IL-1β、肺组织中MPO水平较ANP组明显下降,且胰腺和肺的病理损伤也明显减轻(P<0.001)结论:罗格列酮能明显降低ANP的炎症,能明显减少TNF-α、IL-1β的产生,能降低肺组织中MPO含量,对ANP及合并的肺损伤具有保护和治疗作用.     

Wnt5a在胰腺癌及癌前病变中的表达差异分析

目的 检测Wnt5a基因在不同胰腺组织中的蛋白表达水平,探讨其在胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)发生中的作用,为胰腺癌的早期诊疗提供新线索。方法 免疫组化SP法检测Wnt5a在21灶正常胰腺导管(normal pancreatic duct,NP)、73灶胰腺上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia,PanIN)-1、29灶PanIN-2、16灶PanIN-3、20例胰腺导管内乳头状黏液性肿瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm,IPMN)腺瘤(IPMN-adenoma,IPMA)、13例IPMN交界瘤(IPMN-borderline,IPMB)、19例IPMN黏液癌(IPMN-carcinoma,IPMC)及50例PDAC组织中的蛋白表达。分析Wnt5a的表达与PDAC患者临床病理特征及患者术后生存期的关系。结果 随着组织病变级别升高,Wnt5a表达逐渐增强,各组Wnt5a的免疫组化评分分别为NP (0)、PanIN-1 (1.90±1.192)、PanIN-2 (3.03±1.322)、PanIN-3 (4.88±1.455)、IPMA (1.40±0.940)、IPMB (2.62±1.502)、IPMC (3.00±1.374)、PDAC (3.11±2.635)。Wnt5a的表达与肿瘤的增殖活度、远处转移、TNM分期及患者术后生存期相关(P<0.05),Wnt5a高表达组、低表达组的中位生存期分别为15个月和21个月(P=0.015)。结论 Wnt5a参与了PDAC的发生、发展;Wnt5a表达增强是PDAC的早期事件;Wnt5a的持续表达和过度表达影响了胰腺癌的增殖、侵袭和转移过程,并预示患者预后不良。     

三种DNA抽提方法对新鲜血细胞及冻血细胞DNA抽提效能的比较

目的 比较3种血细胞DNA提取方法（进口试剂盒、国产试剂盒和改良苯酚抽提方法）对新鲜血细胞及冻血细胞DNA的提取效率及差异。 方法 收集20例胰腺癌患者5 mL外周血标本,经低速离心获得血细胞沉淀后分装,根据保存方式分为新鲜血细胞和冻血细胞。新鲜血细胞不经冻存,在12 h内迅速抽提DNA;冻血细胞在-40℃保存72 h后,室温解冻后抽提DNA。抽提方法分别采用进口试剂盒（Qiagen公司）、国产试剂盒（天根生化科技有限公司）和改良苯酚方法。琼脂糖电泳检测DNA片段的完整性,核酸蛋白检测仪测定DNA纯度和浓度,计算不同抽提方法的DNA得率。 结果 在获得的DNA完整性方面,改良苯酚方法抽提的基因组DNA断裂和降解较少,而进口和国产试剂盒抽提的DNA均有一定程度的降解小片段。在获得DNA的纯度方面,部分冻存血细胞无论应用进口试剂盒、国产试剂盒和改良苯酚方法,均表现出一定的污染杂峰。在DNA得率方面,无论新鲜血细胞和冻存血细胞,均是进口试剂盒得率最高,其次为国产试剂盒;冻血细胞的改良苯酚法DNA得率与国产试剂盒相当,新鲜血细胞的改良苯酚法DNA得率最低。在耗时和成本分析中,试剂盒较快但成本较高。 结论 改良苯酚抽提法可获得较进口和国产试剂盒片段更长、更完整的基因组DNA,虽然在得率和耗时方面稍逊色,但其成本较低,可推荐用于大规模、分批次、低成本冻存血细胞的基因组DNA抽提。     

幽门螺杆菌UreB-NAP-HpaA三价DNA疫苗的构建及免疫原性初步研究

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)尿素酶亚单位B(UreB)、中性粒细胞激活蛋白(NAP)及黏附素A(HpaA)三价重组DNA疫苗并研究其抗原性,为Hp疫苗的开发奠定基础.方法:PCR扩增UreB、NAP、HpaA全长序列,分别克隆入pMD 18-T载体,测序并鉴定方向后依次连接,构建融合基因UNH,然后将其亚克隆入真核表达载体pIRES,以此转染COS-7细胞,Western印迹检测表达蛋白的抗原性.结果:PCR分别获得约1 707、432和750 bp产物,与GenBank中相关序列具有高度同源性,三者融合后获得一约2 901 bp目的基因.重组质粒pIRES-UNH转染COS-7细胞后表达相对分子质量约107 000的蛋白质,Western印迹显示该重组蛋白可为UreB、NAP、HpaA抗血清特异识别,具有良好的抗原性.结论:成功构建了具有良好免疫原性的UreB-NAP-HpaA三价重组DNA疫苗,为进一步探讨其免疫保护性及Hp疫苗的研制奠定了基础.