双位点核酶对2.2.15细胞中HBV基因表达抑制作用

目的:观察针对HBVC区双位点核酶在细胞内阻断C区基因表达的作用。方法:采用亚克隆技术,从pGEM-Rz123(含针对HBVC区双位点核酶)上切下双位点核酶的片段,定向克隆于真核表达载体pBBS212中。利用lipofectamine介导,将重组质粒pBBS212-Rz及pBBS212转染2.2.15细胞中,采用打点杂交技术观察核酶的表达,采用ELISA、免疫荧光、免疫组化、图象分析法、Westernblot分析HBe/HBcAg及HBsAg的表达。结果:转染的2.2.15细胞经潮霉素B和G418筛选2周后,打点杂交证实可表达针对HBVC区双位点核酶。ELISA方法检测发现核酶抑制HBeAg表达48.6%,用免疫荧光、免疫组化、图象分析法、Westernblot分析证实核酶可抑制HBV细胞内表达。结论:该双位点核酶通过针对HBVC区基因的剪切作用,阻断C区基因表达,抑制了HBe/HBcAg的表达。     

抗丙型肝炎病毒锤头结构核酶的计算机设计和载体的构建

目的选择针对丙型肝炎病毒（HCV）5'非编码区（NCR）和核心区（C）的核酶（ribozyme,Rz）切割位点,构建带自剪切的Rz真核表达载体。方法应用计算机辅助设计,根据能量最低化原理,以HCV－H（1a）株SNCR和C靶序列,预测其二级结构,选择理想的Rz切割位点,设计锤头结构核酶;体外合成针对HCV5'NCR的Rz213和Rz260的cDNA,通过亚克隆技术连接于真核表达载体（pcDNA3）。结果在124个自然切割位点（CUX和GUX）中选出213（CUC）、260（GUA）、407（GUC）和498（CUU）4个切点;Rz213和Rz260的DNA序列分析,结果与合成序列完全一致,酶切鉴定两Rz连接正确。结论计算机可作为抗病毒Rz设计的重要辅助工具;通过亚克隆技术可使目的Rz两端带自剪切Rz,并成功地插入真核表达载体。     

核酶对人HCC细胞内HBeAg的抑制作用

目的观察针对ＨＢＶＣ区双位点核酶对ＨＢｅＡｇ在细胞内表达的抑制作用．方法利用亚克隆技术,从质粒ｐＧＥＭＲｚ１２３切下ＥｃｏＲⅠＢａｍＨⅠ片段,双粘端克隆于真核表达质粒ｐＢＢＳ２１２中,将该质粒与ｐ１．２Ⅱ（含ＨＢＶ全序列）,共转染人ＨＣＣ细胞（人肝癌细胞株）,观察该核酶在细胞内对ＨＢｅＡｇ合成的抑制作用．结果在人ＨＣＣ细胞中ｐ１．２Ⅱ可表达出ＨＢｅＡｇ;该核酶对ＨＢｅＡｇ的合成抑制率达６５％．结论该双位点核酶可能通过针对ＨＢＶＣ区基因的剪切作用,阻断Ｃ区基因的表达,抑制了ＨＢｅＡｇ的合成     

富马酸丙酚替诺福韦治疗慢性乙型肝炎的研究现状

富马酸丙酚替诺福韦(TAF)是一种新型的核苷酸逆转录酶抑制剂,用于治疗HIV感染和慢性HBV感染。与富马酸替诺福韦二吡呋酯(TDF)相比,TAF具有更好的血浆稳定性和更强的肝脏靶向性,并且极大的降低了肾功能损伤、骨密度降低等副作用。概述了TAF的药理学特点、代谢途径、药物相互作用、耐药性、肾脏安全性及其在慢性HBV感染者中的最新临床研究进展。     

丙型肝炎病毒C和E1区的DNA改组

目的:利用DNA改组技术进行不同亚型的HCVC和E1区的人工进化.方法:首先利用PCR扩增两段具有较高序列同源性的1kb左右的基因片段,两者相比较同源性大于83%.然后将其等量混合,在Mg2 存在的条件下,用DNase Ⅰ切割成50bp左右的小片段.这些小片段在不外加引物的条件下,利用PCR反应进行重聚,再将重聚物经过一轮正常的PCR扩增.结果:获得了与原来片段大小相当的基因片段.结论:这一技术为进一步筛选高活性的HCV C和E1区打下基础,有利于从一组序列同源性程度较高的基因库构建随机嵌合基因,并为改组其他基因家族提供了借鉴.     

慢性丙型肝炎患者外周血Cbl-b、CD28和CTLA-4的表达及其临床意义

目的探讨慢性丙型肝炎患者外周血E3泛素连接酶Cbl—b及其相关信号分子CD28和CTLA一4的变化规律及其临床意义。方法选择25例慢性丙型肝炎患者和19例健康对照者,分离外周血单个核细胞,应用tit—PCR法检测Cbl—b、CD28和CTLA-4mRNA相对表达水平;采用荧光定量RT—PCR检测HCVRNA;采用IN—NO—LiPA线性探针杂交法检测HCV基因分型。结果Cbl—b、CD28和CTLA-4mRNA在慢性丙型肝炎患者中表达升高,较健康对照分别升高1．38倍、1．90倍和2．68倍,其中CTLA4—4的升高表达具有统计学意义（P〈0．05）;在HCV1b基因型（n=11）中,Cbl—b和CTLA-4mRNA水平较HCV2a基因型（n=14）显著升高,分别升高1．74倍和2．81倍,差异具有统计学意义（P〈0．05）,而Cbl—b、CD28和CTLA-4水平与HCVRNA和AIJT水平均无显著相关性。结论Cbl—b和CTLA-4可能参与了HCV感染所致的机体免疫耐受,在HCV感染慢性化中发挥重要作用。     

埃博拉病毒感染的治疗策略

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提高肝脏免疫功能认知,加强肝病细胞治疗研究

肝脏是一个重要的免疫器官,具有独特的免疫微环境,参与全身固有免疫应答和适应性免疫反应。肝脏通过肝-肠轴与系统免疫密切相连,又是免疫损伤的靶器官;肝脏在抗嗜肝病毒免疫中发挥着重要作用,但导致病毒感染慢性化机制尚不完全清楚。肝病细胞治疗包括以细胞功能替代为主的肝(干)细胞输入治疗;以抗病毒抗肿瘤为主的免疫细胞治疗和对遗传性肝病进行的以细胞为载体的基因治疗。间充质干细胞的多向分化潜能和免疫调节特性成为肝病细胞治疗的热点,体外高效扩增技术使自然杀伤细胞治疗肝癌成为可能。