7型腺病毒疫苗株DNA左侧17.5 mu片段克隆及4.8 mu片段核苷酸序列分析

目的获得７型腺病毒疫苗株ＤＮＡ左侧０～１７５ｍｕ片段克隆,分析０～４８ｍｕ片段（末端倒置重复序列、包装信号位点和Ｅｌａ区）核苷酸序列。方法从Ａｄ７疫苗株感染的Ａ５４９细胞提取Ａｄ７ＤＮＡ,将其０３～１７５ｍｕ片段克隆到质粒ｐＡｄ７Ｔ,并用自动和银染方法测序。结果获得了Ａｄ７疫苗株左侧１７５ｍｕ片段克隆,测定了左侧１７３７ｂｐ核苷酸序列,其中Ｅｌａ区所编码的６３００、２４０００、２８０００等３个蛋白的ＤＮＡ序列,与Ｇｏｍｅｎ株的同源性分别为９８９％、９７３％和９７５％,推导编码氨基酸的同源性分别为９６６％、９６５％和９６９％。这３个蛋白与Ｇｒｉｄｅｒ株的同源性分别为１００％、９９７％、和９９７％;推导编码氨基酸的同源性分别为１００％、９９１％和９９２％。结论Ａｄ７疫苗株左侧１７３８ｂｐ核苷酸与Ａｄ７Ｇｏｍｅｎ株和Ｇｒｉｄｅｒ株相应片段,具有高度的同源性。     

蓝舌病毒L3基因的克隆与表达

目的　通过高效表达,研究蓝舌病毒（ＢＴＶ） ＶＰ３ 的功能,为后续ＢＴＶ病毒样颗粒的装配作准备。方法　克隆出完整的ＢＴＶ１３ Ｌ３ 基因,将其插入杆状病毒表达载体进行表达。结果　获得了含有全长Ｌ３ 基因的克隆,ＶＰ３ 在昆虫细胞中得到了高效表达,表达蛋白占细胞总蛋白的１０％ ～１５％ ,ＶＰ３ 与ＶＰ７ 共表达可装配出ＢＴＶ 核心样颗粒。结论　在昆虫细胞中表达ＢＴＶＶＰ３ 蛋白具有生物学活性,可用于ＢＴＶ病毒样颗粒的装配研究     

江西省首例高致病性H5N1人禽流感临床特点分析

目的了解高致病性H5N1人禽流感病例的临床表现、实验室检查、影像学特征、治疗及其预后。方法对2005年12月在江西省遂川县人民医院收治的1例高致病性H5N1人禽流感的临床表现、实验室检查、心电图、影像学改变、病理变化和治疗等多方面的资料进行总结。结果患者经逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法和病毒分离确诊为高致病性H5N1人禽流感病例。患者发病前有禽流感环境暴露史，以发热、畏寒起病，伴流感样症状，继之出现咳嗽、咳脓痰和脓血痰，病情进行性加重，出现腹泻和呼吸困难，伴外周血白细胞和淋巴细胞明显降低、大量尿蛋白、肝功能和心肌酶谱明显异常及血清白蛋白明显降低。发病第6天后痰培养多次发现耐苯唑西林肺炎球菌，在病情明显加重后，痰培养出现其他细菌和真菌。发病初期（第5天）胸部影像学可见右肺中下高密度病灶，继之迅速发展至双肺，出现急性呼吸窘迫综合征（ARDS）样肺部表现。经抗病毒、抗细菌、抗真菌、糖皮质激素和对症治疗未见好转，于发病后第27天死于感染性休克和多器官功能衰竭。病理表现为双肺弥漫性肺泡损伤合并感染，继发弥漫性血管内凝血（DIC）；淋巴组织中淋巴细胞明显减少，组织细胞增生；心肌水肿、空泡变性；肾小管广泛坏死。结论高致病性H5N1人禽流感患者病变进展为ARDS合并多器官功能损害时。预后不佳。     

2001年中国新分离维多利亚系乙型流感病毒的抗原性及基因特性分析

目的：研究2001年中国新分离维多利亚（Victoria)系乙型流感病毒的抗原性及基因特性。方法：鸡胚传代流感病毒，从尿囊液中提取流感病毒的RNA，进行逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR），扩增产物用纯化试剂盒纯化后测序，然后用MegAlign软件进行基因种系发生树分析。结果：B／Sichuan/63/2001和B／Zhejiang/2/2001毒株的抗原性与B／Shandong/7/97毒株间存在有差异，编码血凝素重链区基因已发生了突变并导致了HA1蛋白抗原性表位两个位点（197和199）氨基酸不同于B／Shandong/7/97毒株，基因种系发生树分析同样也证明了它们的HA1基因不同于B／Shandong/7/97病毒。然而，B／Sichuan/63/2001与B／Zhejiang/2/2001毒株间无论抗原性还是HA1基因特性均很相似。结论：2001年我国人群中流行的乙型流感病毒维多利亚毒株系的抗原性已发生进一步的漂移。     

G1型轮状病毒中和抗原VP7基因变异特点

目的 研究我国G1型轮状病毒主要中和抗原VP7基因的变异特点。方法 对1988-1998年收集自北京、沈阳、新乡、上海、深圳、广州、重庆等7个城市的23份G1型轮状病毒毒株VP7cDNA序列进行测定,并结合核酸电泳带型和G1型单抗的ELISA检测结果分析VP7基因的变异特点。结果 我国G1型轮状病毒VP7变异有一定规律,主要集中在aa41、49、57、65、68、74、94、97、147、170、217、218、268、281、291,即VR3-5、VR7-8以及多肽C端的部分区域内,各地区之间没有明显差别,虽然随时间不同个别氨基酸可能发生替换,但仍同属Jpn-417支系;aa91位可能参与构成G1型VP7的抗原表位,某些位点的氨基酸变异可能与核酸带型改变有关。结论 在研制疫苗时,应采用基因和抗原性具有代表性的近期毒株,同时定期监测抗原性的改变。     

人轮状病毒抗原非复制型重组腺病毒黏膜免疫效果的研究

目的：对人轮状病毒抗原非复制型重组腺病毒诱导黏膜免疫的效果进行初步评价。方法：用表达轮状病毒VP7、VP6基因的3株重组腺病毒rvAdG1VP7(G)、rvAdG1VF7和rvAdVP6，分别通过灌胃和滴鼻两种途径对BALB／C小鼠进行2次免疫后，对肺灌洗液和肺、肠粘膜组织匀浆液中轮状病毒特异性的分泌型IgA(secretory IgA，SIgA)和local-IgG进行检测。结果：对肺灌洗液中特异性SIgA进行检测，发现滴鼻组的免疫学效果明显优于灌胃组。对肺、肠组织匀浆液中特异性IgA的分析表明，灌胃途径刺激异位粘膜组织产生免疫应答的能力较弱。对rvAdVP6滴鼻组小鼠肺灌洗液(1：20)特异性local-IgG和SIgA的阳转率进行比较，发现特异性local-IgG的应答水平明显高于特异性SIgA。结论：重组腺病毒可有效诱导针对轮状病毒的黏膜免疫。此研究为轮状病毒基因工程疫苗的免疫方案、免疫途径及免疫保护作用等的进一步研究莫定了基础。     

7型腺病毒疫苗株序列测定及其六邻体特性分析

目的 完成7型腺病毒疫苗株(Ad7v)的全序列测定并阐明其六邻体特征。方法 克隆Ad7v基因组17．5～68．0mu片段，应用Sanger双脱氧法进行DNA序列测定，将编码六邻体蛋白的核苷酸序列输入GenBank数据库中，获得录入号为AF515814。用CLUSTAL.V软件比较Ad7v与其他亚组及同一亚组腺病毒的六邻体蛋白的同源性，分析其抗原性的差异，同时用RasMol2．71软件预测Ad7v六邻体三维结构。结果 AdTv17．5～68．0mu由17596个碱基组成。这段基因r链主要编码晚期基因L1、L2和L3，L链编码E2的一部分。六邻体编码多肽位于L3区，由934个氨基酸残基组成，与其他9个已知的六邻体蛋白序列进行多序列同源性比较，发现Ad7／疫苗株与其他亚组腺病毒的同源性为86．8％(Ad4)～78．5％(Ad5)。在同一亚组中，Ad7疫苗株与Ad3同源性最高，高达95．1％。可变序列主要集中在7个高变区(HVRs)，根据Ad2六邻体三维结构模型预测Ad7六邻体三维结构，发现可变区大部分位于六邻体顶端的I1和I2环中。结论 完成了AdTv的全序列分析，其六邻体序列与Ad5、Ad2等其他亚组病毒有很大差异，这一结果为构建新型腺病毒载体打下了基础。     

我国分离人H5N1禽流感病毒血凝素基因特性的研究

目的 分析我国分离的人高致病性禽流感H5N1病毒的抗原性以及基因特性.方法 对所分离的H5N1病毒的血凝素基因和神经氨酸酶基因进行序列测定.结果 对血凝素基因的序列测定结果表明从我国分离的H5N1病毒具有较高的同源性,但是与越南、泰国等国家分离的H5N1病毒明显不同.序列测定的结果同时表明无论是受体特异性还是连接肽都是禽源的.结论 目前我国分离的H5N1病毒属于同一个组,与泰国、越南分离毒株不同,并且发现病毒的特性仍然是禽源的,没有发现从禽到人的重组或者重配。     

2004—2005年中国A(H1N亚型流感病毒抗原性及基因特性研究

目的阐明2004—2005年中国流行的A(H1N1)亚型流感病毒血凝素抗原性及其基因变异情况。方法对2004—2005年分离的A(H1N1)亚型毒株先进行单向血凝抑制试验;在此基础上选取不同时间、地点的A(H1N1)亚型流感毒株进行血凝素基因HA1区核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后进行基因进化特性分析。结果单向血凝抑制实验结果表明,2004年A(H1N1)亚型病毒株对鉴定血清的血凝抑制效价与A/Shanghai/1/1999(H1N1)毒株没有4倍差异;2005年分离的A(H1H1)亚型毒株中有62株(占6·2%)病毒与A/Shanghai/1/1999(H1N1)毒株本身的血凝抑制效价相比有4倍差异。HA1区核苷酸序列和氨基酸序列分析表明,我国2005年分离到的A(H1N1)亚型流感病毒株有以下位点发生变异,54K>R、90T>K、101Y>H、149R>K、169V>A、190D>N、212R>K、219K>R、245W>R、246Y>F、258T>N、318V>A,其中54、190位氨基酸位于抗原决定簇。结论我国2005年分离的A(H1N1)亚型流感毒株基因特性和抗原性已开始发生变异。     

1株表达人轮状病毒VP7的重组腺病毒的生物学特性鉴定

目的对表达轮状病毒VP7基因的1株重组腺病毒rvAdG1VP7(G)的生物学特性进行鉴定,为进一步免疫学研究打下基础.方法用rvAdG1VP7(G)感染293细胞,并分别应用电子显微镜技术以及Southern blot、PCR、RT-PCR和Western blot等分子生物学方法了解rvAdG1VP7(G)的形态、VP7基因整合、遗传稳定性、VP7基因在细胞内转录及表达等有关生物学特性.结果电子显微镜观察表明:rvAdG1VP7(G)具有典型的腺病毒形态;Southern blot、PCR、RT-PCR和Western blot等分子生物学方法分析显示:rvAdG1VP7(G)中确有特异性的VP7基因稳定整合,有较好的遗传稳定性,感染293细胞后能有效转录,可表达轮状病毒主要结构蛋白VP7.结论 rvAdG1VP7(G)具有良好的生物学性质,为进行体内实验研究提供了必要条件.