豚鼠膀胱Cajal样间质细胞类型及其与钙离子振荡特性的关系

目的 探讨豚鼠膀胱组织中Cajal样间质细胞(ICC)形态学类型特点及其与钙离子振荡特征的关系.方法 取豚鼠膀胱制作冰冻切片,体外培养膀胱ICC.免疫荧光染色激光共聚焦显微镜下观察ICC形态学特点,根据细胞不同形态类型及添加2-氨基乙氧基双苯萘酯(2-APB)干预剂将体外培养膀胱ICC分4组:二聚体ICC组(n=10)、单体ICC组(n=20)、2-APB抑制二聚体ICC组(n=10)、2-APB抑制单体ICC组(n=20).应用Fluo-4AM标记细胞内钙离子浓度含量及在2-APB抑制二聚体ICC组、2-APB抑制单体ICC组加入2-APB,共聚焦显微镜下观察记录钙离子振荡功能.结果 二聚体ICC组钙振荡频率(13.4±0.8)次/min及振幅38.5±8.7明显高于单体ICC组钙振荡频率(7.5±0.6)次/min及振幅10.5±3.9(P＜0.05),加入高浓度2-APB后,2-APB抑制二聚体ICC组钙振荡频率(8.7±1.5)次/min及幅度15.5±8.2明显低于二聚体ICC组(P＜0.05),而2-APB抑制单体ICC组钙振荡频率(8.5±0.5)次/min及幅度9.2±4.6与单体ICC组差异无统计学意义(P＞0.05).结果 豚鼠膀胱中存在单体和二聚体2种不同形态类型的ICC,单体ICC自发性钙振荡波较低,二聚体ICC自发性钙振荡波具有高兴奋性,二聚体ICC的特有结构可能是ICC高兴奋性钙波形成的结构基础.     

钩藤碱治疗骶上脊髓损伤致逼尿肌反射亢进大鼠的实验研究

目的 探讨钩藤碱对骶上脊髓损伤（SSCI）致神经源性膀胱大鼠逼尿肌反射亢进的治疗作用及其机制。方法 将10周龄健康雌性SD大鼠30只（SPF级）按照随机数字表法分为对照组、模型组、治疗组,每组10只。对照组不做任何手术处理,模型组和治疗组采用脊髓横断法制备神经源性膀胱模型。对照组和模型组腹腔注射0.9%氯化钠溶液,治疗组注射钩藤碱（5 mg/kg）。对照组10只大鼠全部存活,模型组8只造模成功,治疗组8只造模成功。4周后,大鼠膀胱行尿动力学检测,离体逼尿肌条电生理学指标检测,膀胱病理切片HE染色观察,蛋白质印迹法检测c-kit蛋白的表达,激光共聚焦显微镜下观察Cajal间质细胞（ICC）数量变化,实时荧光PCR检测ICC中T型钙通道蛋白亚型α1G基因表达水平。结果 与模型组相比,治疗组膀胱最大容量增大（q=8.251,P＜0.05）,膀胱漏尿点压（q=3.764,P＜0.05）和膀胱充盈压均减小（q=5.687,P＜0.05）,逼尿肌收缩频率降低（q=9.661,P＜0.05）,最小张力增大（q=5.217,P＜0.05）,c-kit蛋白表达降低（q=13.688,P＜0.05）,ICC数量减少（q=7.060,P＜0.05）,α1G基因表达量降低（q=8.762,P＜0.05）,差异均有统计学意义。病理切片下观察到治疗组逼尿肌无断裂,肌间隙增宽减少。结论 钩藤碱通过减少神经源性膀胱逼尿肌ICC数量,抑制ICC T型钙通道蛋白亚型α1G基因的表达来抑制ICC起搏兴奋活性,从而减轻逼尿肌的过度亢进,使逼尿肌兴奋性趋于正常。     

含人干细胞白血病基因慢病毒载体转染Cajal样间质细胞的效果研究

目的 观察携带增强绿色荧光蛋白（GFP）的含人干细胞白血病（SCL）基因慢病毒载体转染体外培养的豚鼠膀胱Cajal样间质细胞（ICC）的效果。方法 2014年10月-2015年8月,选取普通级成年健康豚鼠16只。构建含人SCL基因的慢病毒载体,并标定病毒滴度;采用随机数字表法选取健康豚鼠4只,采用颈椎脱臼方法将其杀死,体外培养豚鼠膀胱ICC。设置不同感染复数（MOI）（0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0）,利用含人SCL基因的慢病毒载体转染ICC,在激光共聚焦显微镜下观察ICC生长状态并计算转染效率,确定最佳MOI。采用随机数字表法将ICC分为正常对照组、空白质粒对照组与慢病毒转染组,其中正常对照组加入1%磷酸盐缓冲液（PBS）,空白质粒对照组加入空慢病毒,慢病毒转染组按最佳MOI加入含人SCL基因的慢病毒载体,计算各组转染效率,确定最佳转染时间。采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测SCL mRNA表达情况。上述实验均独立重复4次。结果 经测定,病毒滴度为5×108 TU/ml。倒置显微镜下发现一些特征性梭形细胞,其两侧有显著外凸分枝,细胞核较大,其外形规则,有序地实现细胞贴壁,而其他未贴壁细胞则呈现与ICC不一样的形态,胞体多为椭圆形,细胞两极无突起,整体形状扁平。激光共聚焦显微镜下可以发现酪氨酸蛋白激酶生长因子受体（c-kit）受体成功表达,证实培养的细胞是膀胱ICC。观察各组ICC生长状态,当MOI为0.5、1.0、5.0、10.0时,细胞生长状态较好,无细胞死亡,当MOI为50.0、100.0时,可见部分细胞死亡,细胞活性降低;MOI为1.0、5.0、10.0、50.0、100.0时的转染效率高于MOI为0.5时（P＜0.05）;MOI为5.0、10.0、50.0、100.0时的转染效率高于MOI为1.0时（P＜0.05）;MOI为10.0、50.0、100.0时的转染效率高于MOI为5.0时（P＜0.05）;MOI为50.0、100.0时的转染效率高于MOI为10.0时（P＜0.05）;综合ICC生长状态及转染效率,确定含人SCL基因慢病毒载体转染ICC的最佳MOI为10.0。正常对照组、空白质粒对照组ICC中无GFP表达;慢病毒转染组转染3 d时ICC中GFP表达强度高于转染2 d、转染5 d时,确定含人SCL基因慢病毒载体转染ICC的最佳转染时间为3 d。慢病毒转染组中扩增产物大小与目的片段大小1 036 bp一致,而正常对照组及空白质粒对照组均未见特异性条带表达,表明SCL基因成功导入ICC。结论 利用含人SCL基因慢病毒载体能高效转染体外培养的ICC,并成功介导SCL基因在ICC中的表达,为下一步研究利用SCL基因进行体内转染实验奠定基础。     

雷帕霉素对大鼠主动脉瓣膜间质细胞增殖的影响

目的利用雷帕霉素靶向抑制mTOR并探讨其对大鼠心瓣膜间质细胞增殖的影响。方法体外分离大鼠瓣膜间质细胞后 培养并鉴定;细胞随机分为两组：雷帕霉素组与对照组;MTT法检测并绘制大鼠瓣膜间质细胞用药前后的生长曲线;流式细胞 仪检测雷帕霉素对细胞周期的影响;RT-PCR 检测细胞中S6、P70S6K的mRNA表达水平;Western blotting 检测细胞中S6、 P70S6K、P-S6、P-P70S6K蛋白的表达水平。结果体外分离获得的大鼠瓣膜间质细胞分离培养成功;对照组细胞活性显著高于 加药组细胞（P<0.05）,加药组细胞生长变缓。流式细胞术检测发现加药组和对照组细胞的各周期占比均没有明显差别;加药组 细胞的S6蛋白与P70S6K蛋白的磷酸化水平降低（P<0.05）。结论雷帕霉素能抑制瓣膜间质细胞的增殖其原因,可能不是通过 改变细胞周期而是通过抑制mTOR后下调其靶蛋白S6和P70S6K的磷酸化水平引起的。     

胶原酶分离及低速离心结合筛网过滤法纯化子宫内膜细胞的研究

目的:探索分离子宫内膜细胞以及纯化子宫内膜腺上皮细胞与间质细胞的最佳方法。方法:采用Ⅰ型胶原酶、胰酶、Ⅰ型胶原酶混合胰酶以及机械研磨等4种方法处理大鼠子宫,比较细胞数和活细胞率,从而获得分离子宫内膜组织的最佳方法。用获得的最佳方法分离人类子宫内膜组织,比较采用2次筛网过滤(筛网法)和低速离心结合筛网过滤(结合法)进一步纯化子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞获得的细胞数和纯化效率,从而获得较好的纯化方法。结果:Ⅰ型胶原酶、胰酶、Ⅰ型胶原酶混合胰酶和机械研磨处理大鼠子宫组织所得的细胞数分别为6.43±3.55×105/ml、4.59±2.35×105/ml、4.25±1.06×105/ml、3.57±1.15×105/ml,差异有统计学意义(P0.05);活细胞率分别为98.90±0.74%、96.63±1.84%、97.97±2.02%、97.20±4.41%,差异无统计学意义(P0.05)。筛网法和结合法纯化分离所获得的腺上皮细胞数为0.43±0.21×105/ml、8.27±2.46×105/ml;间质细胞纯度为92.94±2.89%和99.19±0.24%,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:Ⅰ型胶原酶是分离子宫内膜细胞的最佳方法,而采用低速离心结合筛网过滤法是较理想的纯化分离后的子宫内膜细胞的方法。     

人子宫内膜异位症患者在位内膜间质细胞永生化细胞系的建立及鉴定

目的建立人子宫内膜异位症（Endometriosis,EMs）患者在位内膜间质细胞永生化细胞系。方法将原代培养的EMs患者在位内膜间质细胞转染质粒PCD2SV40T,G418筛选并进行单克隆细胞挑选,采用核型分析、免疫细胞化学、RT-PCR、裸鼠成瘤实验等方法对传代培养后的抗性单克隆细胞进行鉴定。结果首次建立了EMs患者在位内膜间质细胞永生化细胞系hEM15A,该细胞系具有子宫内膜间质细胞特征,可连续传代,表现为正常二倍体核型,未观察到致瘤性。结论 hEM15A细胞系易获得、培养难度小、细胞均一性高、存活时间长,可成为EMs的研究工作中实用的体外模型。     

糖尿病大鼠肠道Cajal间质细胞的实验研究

用链尿佐菌素建立大鼠糖尿病模型,采用葡聚糖蓝-2000灌胃,作为胃肠内标志物,观察大鼠肠道传输速度,取正常对照组及模型组大鼠空肠标本,免疫组化染色观察空肠C—kit阳性CaN间质细胞的变化,并用透射电镜观察胃窦Cajal间质细胞的超微结构改变。结果与正常组相比,糖尿病组大鼠小肠动力明显减弱（P〈0．01）,空肠c—kit阳性Cajal间质细胞减少（P〈0．01）,采用透射电镜观察显示CaN间质细胞与其他细胞间的缝隙连接减少、结构破坏;细胞器数量明显减少,线粒体肿胀、空泡样变。结论Cajal间质细胞数量减少及超微结构变化与糖尿病肠道动力障碍有一定相关性。     

骨髓基质细胞结合血管内皮生长因子基因治疗猪慢性心肌缺血的疗效

目的：探讨骨髓基质细胞（BMSCs）结合血管内皮生长因子（VEGF）基因心内膜注射治疗猪慢性心肌缺血模型的疗效。方法：建立猪心肌梗塞模型．胸骨穿刺抽取骨髓,分离培养BMSCs,将VEGF165基因转染到BMSCs中．4周后进行左室心内膜电机械标测并行心内膜注射等操作,按照注射成分不同分为3组．联合组（n=8）注射转染VEGF。基因的BMSCs,细胞组（n=8）注射BMSCs,对照组（n=6）注射生理盐水。于细胞移植后4周分别进行左室心内膜电机械标测、选择性冠脉造影及超声心动图检查。结果：术后4周时联合组较细胞组及对照组的心梗面积明显缩小．侧支循环、心脏泵血功能以及心肌收缩力改善更加明显（P〈0．05～〈0．01）。结论：自体BMSCs结合VEGF165基因治疗心肌梗塞效果显著。     

IL-1β对豚鼠离体小肠平滑肌的影响

目的研究白细胞介素-1β（IL-1β）对豚鼠小肠平滑肌的影响及机制。方法在距回盲部10cm处取回肠平滑肌标本,分为4组：不同浓度IL-1β剂量对照组;ACH＋IL-1β组;TTX＋IL-1β组;ICC破坏＋IL-1β组。结果IL-1β对豚鼠离体小肠平滑肌收缩的基础张力和振幅有抑制作用,呈浓度依赖性;ACH作用后加入IL-1β（3ng／mL）对ACH收缩无明显抑制作用（P〉0．05）,预加IL-1β（3ng／mL）后加入ACH的收缩振幅与ACH直接作用相比无显著差异（P〉0．05）。TTX阻断肠神经后加入IL-1β（3ng／mL）,小肠平滑肌的收缩无明显变化（P〉0．05）。破坏小肠ICC,收缩幅度和频率与正常小肠收缩幅度和频率比较有显著性差异（P〈0．01）,加入IL-1β（3ng／mL）无显著性差异（P〉0．05）。结论IL-1β对豚鼠小肠平滑肌的收缩活动有抑制作用,对小肠平滑肌的主要神经兴奋物质ACH无明显急性抑制作用,对ACH的反应性无急性影响。IL-1β舒张小肠的作用主要是通过肠神经元介导,对兴奋神经递质释放有抑制作用。ICC是IL-1β对平滑肌抑制途径一个不可缺少的中间环节。     

间质细胞肿瘤引起性早熟发病的分子机制

相关基因突变可以影响下丘脑-垂体-性腺轴(HPGA)发育与功能,导致生长发育的异常.黄体生成素(LH)受体及受体下游的突变绝大多数是失活性的,但少数是激活性突变,尤其是发生在LH受体基因外显子11和Gs-α基因的外显子8和9位置的突变,这些基因突变与外周性性早熟有关,常见于间质细胞肿瘤或增生患儿.除已知热点突变外可能还有其他基因突变参与性早熟的发生.