人λ-干扰素在BHK-21中的表达及生物学活性的研究

目的:研究HuIFN-λ1和HuIFN-λ2真核细胞重组表达及其生物学活性.方法:用水疱性口炎病毒(VSV)刺激人宫颈癌HeLa细胞, 用RT-PCR克隆HuIFN-λ1和HuIFN-λ2基因, 与PCAGG-EGFP真核表达载体连接, 构建重组体PCAGG-HuIFN-λ1和PCAGG-HuIFN-λ2并进行鉴定, 后在BHK-21细胞进行表达, 采用VSV*GFP于人肺腺癌A549上进行表达产物抗病毒活性测定;并通过已构建的MDBK-Mxp-Luc细胞系对HuIFN-λ1和HuIFN-λ2诱导MxA抗病毒蛋白产生的特性进行研究.结果:HuIFN-λ1-PMD18-T Vector和HuIFN-λ2-PMD18-T Vector的SacⅠ、XhoⅠ和SacⅠ和SalⅠ双酶切鉴定, 均出现610 bp大小的带, 测序示与GenBank上报道的序列完全一致.PCAGG-HuIFN-λ1活性104 IU/mL, PCAGG-HuIFN-λ2活性为102 IU/mL, 且PCAGG-HuIFN-λ1诱导Mx抗病毒蛋白的表达一定时间内随时间延长表达不断增强, 9～12 h达高峰, 24 h后消失(P＜0.05).结论:成功构建了PCAGG-HuIFN-λ1PCAGG-HuIFN-λ2 的真核表达载体并在BHK-21细胞中得到表达, 其抗病毒活性与诱导Mx抗病毒蛋白密切相关.     

rhTGF-β1及转染TGF-β1基因对兔角膜内皮细胞增殖的影响

目的： 探讨不同浓度的重组人转化生长因子-β₁(rhTGF-β₁)及TGF-β₁基因转染对体外培养兔角膜内皮细胞增殖的影响。方法: 用MTT法检测不同浓度rhTGF-β₁作用下角膜内皮细胞的增殖。用脂质体介导转染方法，将TGF-β₁基因转移入培养的兔角膜内皮细胞，HE染色法观察细胞组织形态学变化；ELISA法检测转染细胞培养上清中TGF-β₁表达量；流式细胞仪检测细胞生长周期变化；DNA电泳法检测转染细胞凋亡情况。结果: MTT检测示5-20 μg/L rhTGF-β1抑制角膜内皮细胞增殖；0.5-1 μg/L组对增殖无影响；0.05~0.1 μg/L组促进细胞增殖。TGF-β₁基因转染细胞形态无明显异常，细胞培养上清中TGF-β₁的浓度约为(98±3)ng/L。流式细胞仪检测示，基因转染组S期和G₂/M期细胞比例减少、PI值降低，但加入EGF后细胞生长基本正常。DNA电泳检测示基因转染组未见凋亡带。结论: rhTGF-β₁对角膜内皮细胞增殖的影响具有剂量依赖性；TGF-β₁基因转染影响角膜内皮细胞增殖、但不诱发凋亡，其抑制作用可被外源性EGF拮抗。     

TCRVβ7.1基因修饰T细胞对乳腺癌细胞杀伤作用的研究

目的：观察TCPVβ7．1基因转染前后正常人外周血淋巴细胞对乳腺癌细胞株杀伤活性的影响。方法：脂质体包裹PdWA3.1vβ7.1后转染健康人PBMC，流式细胞仪检测PdWA3.1Vβ7.1基因表达，改良MIT法检测TCRVβ7．1基因转染前后正常人外周血淋巴细胞对乳腺癌细胞株杀伤活性。结果：TCRVβ7．1基因转染可显著增加正常人PBMC该基因表达，转染前后正常人外周血淋巴细胞对乳腺癌细胞株杀伤活性有显著性差异。结论：用TCR基因修饰可明显提高正常人PBMC对乳腺癌细胞杀伤作用。     

增强型绿色荧光蛋白基因在鸡胚盘细胞中的表达

从鸡胚发育为X期的鸡蛋中取胚盘细胞,经原代培养后用带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为标记基因的真核表达质粒pLEGFP-C1转染鸡胚细胞观察GEFP基因的表达情况,结果在不同条件下的活细胞均见有EGFP基因的稳定表达,这提示通过EGFP基因转染鸡胚盘细胞可连续且直接观察活细胞中的表达,为转基因鸡的研究提供一实用的标记基因。     

pCD-rbFGF重组质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

为了构建碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)真核表达质粒,并探讨应用bFGF基因治疗骨科各种疾患的可能性,将鼠碱性成纤维细胞生长因子cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3中,构建了重组质粒pCD-rbFGF.通过Liofectin介导将pCD-rbFGF转染兔成骨细胞,经免疫组化检测证实兔成骨细胞获得了bFGF的瞬时表达.提示该bFGF真核表达质粒有效,可用于进一步基因治疗研究.     

HBV 基因T1862突变真核表达载体的构建及在Cos7细胞中的表达

目的研究HBV T1862变异的生物学意义。方法采用分子生物学方法,构建HBV前C/C基因EB病毒真核表达载体,利用体外定点突变技术诱导前C/C基因T1862变异,经PCR-RFLP初筛并经测序终鉴定出阳性克隆后,以脂质体介导方法将突变前后的重组质粒转染Cos7细胞, 以ELISA 检测HBeAg的表达量。结果未突变的重组质粒可稳定表达HBeAg,突变后的重组质粒未能检测到HBeAg表达。结论 HBV前C/C基因1862点突变的真核表达载体的构建,为体外研究该点突变引起HBV的一系列生物学改变奠定基础。     

TWEAK蛋白对肝癌细胞增殖的影响

目的 观察TWEAK蛋白对肝癌细胞系增殖的影响,探讨TWEAK对肝癌细胞增殖的作用.方法构建PAVU6-TWEAK siRNA干涉质粒,转染HepG2和QGY7703肝癌细胞株,MTT法检测抑制TWEAK蛋白表达对肝癌细胞增殖的影响,并于培养体系中加入TWEAK蛋白,检测肝癌细胞增殖活性.结果成功构建PAVU6-TWEAK siRNA干涉质粒,转化肝癌细胞后肝癌细胞增殖受抑.肝癌培养体系中加入TWEAK蛋白后,肝癌细胞增殖活性有所增强.结论 TWEAK蛋白可促进肝癌细胞的增殖活性,抑制TWEAK表达,一定程度上可抑制肝癌细胞增殖.     

钙调蛋白基因缺陷HIS3酵母菌株的构建和鉴定

目的：构建白念珠菌钙调蛋白基因（CMD1）缺陷HS3酵母菌体,为进一步探讨钙调蛋白基因突变对真菌生长周期及致病性的影响奠定基础。方法：首先将含cmd1::TRP1置换序列的质粒I转化二倍体酵母菌株YPH501(his3trplural）,经Soutthern印迹法筛选出含TRP1序列的菌株。其次,将含CMD1序列的质粒Ⅱ转化以上TRP1阳性菌株,进行减数分裂后选择得到TRP1阳性酵母菌株单倍体。最后,将含trp1:HIS3置换序列质粒Ⅲ转化上述TRP1阳性单倍体菌株,用不含His培养基培养得到钙调蛋白基因缺陷HIS3酵母菌株。结果：经Southern印迹法证实cmd1：TRP1基因置换克隆;减数分裂后选择得到了TRP1阳性酵母菌株单倍体;质粒Ⅲ转化单倍体后经不含His培养基培养得到CMD1缺陷HIS3菌株,接种于不含Trp倍养基上未见有菌落生长,说明质粒Ⅲ转化单倍体后已将his3TRP1转换成HIS3trp1。结论：成功构建了钙调蛋白基因缺陷HIS3酵母菌株,基因型为cmd1trp1HIS3。     

正、反义组织金属蛋白酶抑制剂1基因转染对肾小球系膜细胞凋亡及相关基因表达的影响

目的 探讨正、反义组织金属蛋白酶抑制剂1（TIMP－1）对肾小球系膜细胞凋亡的影响。方法 利用前期工作中克隆出的人TIMP－1全长cDNA,分别构建出表达正义及反义TIMP－1的重组真核表达载体pcDNA3-TIMP-1(PTs),pcDNA3-ATIMP-1(PTas),并将上述重组质粒转染至大鼠的肾小球系膜细胞中,Northern杂交检测正、反义TIMP－1的表达。无血清诱导大鼠系膜细胞凋亡,利用DNA缺口末端标记（TUNEL）分析、DNA电泳技术在无血清后的不同时间点检测细胞凋亡,RT－PCR的方法检测凋亡相关基因的表达。结果 转染PTas的大鼠系膜细胞可以高效表达反义TIMP－1,无于血清诱导12h开始发生凋亡;无外源基因转染及空载体转染的大鼠系膜细胞在无血清48h发生凋亡;而转染正义TIMP－1的大鼠系膜细胞可高效表达正义TIMP－1,在无血清4d时才发生凋亡。TIMP－1的高表达或低表达可引起大鼠系膜细胞bax的下调或上调,但并不影响bcl-2的表达。结论 TIMP－1可以抑制无血清诱导的大鼠系膜细胞的凋亡,反义TIMP－1对之则有促进作用。这提示TIMP－1在肾脏除了抑制细胞外基质的作用外还具有新的功能。     

pcDNA3—EGFP基因转染骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 探讨外源性pcDNA3-EGFP基因转染修饰兔骨髓间充质干细胞的可行性。方法 用增荧光绿色蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP)cDNA作为报告基因,采用重组真核表达载体系统（pcDNA3-EGFP)以脂质体法转染原代骨髓间充质干细胞,观察转染结果、表达情况及对靶细胞活力的影响。结果 经荧光显微镜下观察证实：成功地对骨髓间充质干细胞实现了基因转染,持续表达时间超过8周;没有发现明显的细胞毒作用及对细胞活力的显著影响。结论 采用真核转染技术可以介导外源基因转染骨髓间充质干细胞,为今后采用基因增强组织工程方法治疗肌肉、骨骼系统疾病提供了实验基础。