人子宫颈粘液抗菌活性多肽的分离纯化

目的　从人子宫颈粘液分离纯化新的抗菌多肽。方法　用 5 %乙酸提取人子宫颈粘液可溶物 ,经电泳凝胶琼脂糖弥散法抗菌试验发现 ,子宫颈粘液酸溶性提取物有一条主带对大肠杆菌耐氨苄株 ML - 35 P有强抗菌活性 ,命名为 HCP。应用制备性酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳技术及洗脱电泳技术得到构成该主带的混合物 ,最后应用反相高效液相色谱技术分离纯化多肽。经 Tricine- SDS- PAGE鉴定其相对分子质量 ,并运用琼脂糖弥散法鉴定其抗菌活性。结果　从子宫颈粘液酸溶性提取物中纯化出一多肽 ,相对分子质量约为 14× 10 3,命名为 HCP- 1,具有抗耐药性大肠杆菌和绿脓杆菌的活性。结论　 HCP- 1可能是宫颈粘液天然免疫机制中的新的效应分子     

卡介苗增强人β-防御素-1基因在肺腺上皮细胞表达的分子调节机制

目的 研究人β-防御素-1(hBD-1)基因启动子结构及卡介苗胞壁蛋白增强其mRNA在肺腺上皮细胞(SPC-A-1)中表达的转录调控机制。方法 hBD-1基因5′-端上游序列被连接入无启动子的pEGFP-1质粒和pCAT basic质粒，构建了系列5′-端缺失的pEGFPhBD-1及pCAT hBD-1报告质粒．pEGFP hBD-1质粒转染细胞后用荧光倒置显徽镜观察绿色荧光表达强度。pCAThBD-1报告质粒和pSV-β-Galactosidase control质粒(内对照)共转染SPC—A-1细胞后，给予卡介苗胞壁蛋白活性组分刺激，用ELISA检测CAT和β-Gal浓度．结果 hBD-1基因上游-314段有较强的启动子活性，-69段则启动活性减弱IBCG刺激后，即使上游序列缩短至-69位点时，报告基因CAT相对表达量仍明显增高。该区域有-同源性极高的C／EBPβ(CCAAT／Enhancer—binding proteinp)结合元件．结论 hBD-1基因上游-314bp段具有较完整的启动子活性，其中含有C／EBPβ结合位点的-69／ 54bp序列介导卡介苗对hBD-1基因转录的增强作用。     

抗菌肽LL-37作用研究进展

LL-37是抗茵肽Cathelicidin家族中唯一存在于人体的抗微生物肽，它结构简单，功能诸多，在皮肤粘膜及其它器官免疫中发挥重要作用。本仅就近年来LL-37作用研究方面作的综述，除了抗菌作用外，LL-37还有抗内毒素、趋化活性等作用。     

结核分枝杆菌低氧反应蛋白HRP1（Rv2626c）的分泌致病机制初探

  目的  验证结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）基因Rv2626c编码的低氧反应蛋白1（hypoxic response protein 1, HRP1）为分泌蛋白。  方法  从Mtb H37Rv标准毒力株基因组上扩增目的基因并添加His标签;运用扩增产物构建重组质粒,电转入耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis, Ms）（MC2 155）构建重组菌;热诱导重组菌表达蛋白,检测培养滤液及细菌裂解液中蛋白的表达情况,将10 kDa培养滤液抗原（CFP-10）（Ms）和CFP-10（Mtb）设为阳性对照,将胞质蛋白热休克蛋白65（GroEL2）（Mtb）作为阴性对照。  结果  PCR成功扩增 HRP1 、GroEL2（Mtb）、CFP-10（Mtb）、CFP-10（Ms）,并且重组质粒测序峰单一且信号稳定,鉴定重组质粒构建成功。成功构建重组Ms并实现蛋白GroEL2（Mtb）、CFP-10（Mtb）、CFP-10（Ms）、HRP1在Ms中的表达。在重组菌裂解液中和培养基滤液中均检测到目标蛋白HRP1;结果与阳性对照CFP-10一致;阴性对照GroEL2（Mtb）仅在细菌裂解液中检测到,在培养滤液在未检测到。  结论  Mtb基因Rv2626c编码的蛋白HRP1可以通过Ms的分泌系统分泌到细菌外,作为Mtb分泌蛋白,在Mtb致病机制中发挥作用。     

HMGN2对大肠埃希氏菌黏附Hela细胞的影响

目的探讨HMGN2对大肠埃希氏菌黏附Hela细胞的影响。方法采用Hela细胞模型,光镜以及扫描电镜观察大肠埃希氏菌ATCC25922黏附Hela细胞模型的建立。用以下三组不同方式,观察梯度抑菌浓度下（分别为5、10、15μg／ml）HMGN2对细菌黏附的影响。黏附抑制组：HMGN2、细菌、细胞共同孵育1小时;干扰模型组：细菌、细胞孵育1小时后,PBS洗去未黏附细菌,再加入HMGN2孵育2小时;细菌预处理组：HMGN2、细菌孵育2小时,离心洗去HMGN2,收集细菌,所得细菌再与细胞孵育1小时。用平板菌落计数法观测细胞内、外活茼数,并计算黏附指数以及黏附抑制率。结果光镜及扫描电镜可见细菌黏附于细胞表面,黏附模型构建成功。三组的结果均提示：在HMGN2梯度抑菌浓度下,细菌的黏附指数随着HMGN2的浓度的升高而减小;黏附抑制率则随着其浓度的升高而逐渐增大（P〈0．05）。结论抑菌浓度下的HMGN2：对大肠埃希氏菌ATCC25922黏附Hela细胞有明显的抑制作用;可减低已经黏附于细胞表面的细菌的黏附能力;可能直接作用于细菌,导致其黏附能力降低。     

角质形成细胞对胞内金黄色葡萄球菌抗菌作用研究

目的:观察金黄色葡萄球菌在人角质形成细胞株HaCaT中生存的动态变化,了解金黄色葡萄球菌与皮肤角质形成细胞之间的相互关系。方法:用金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923侵袭HaCaT细胞,分别于细菌进入细胞后的4、24、48、72h裂解细胞,释放出细胞内的活细菌,用平板菌落计数法计数胞内活菌。结果:金黄色葡萄球菌ATCC25923株在进入HaCaT细胞的24h有一定生长,但实验48h细胞内活菌数量明显减少。蛋白激酶C激活剂PMA和腺苷酸环化酶激活剂FSK可以促进HaCaT细胞清除胞内细菌。结论:皮肤角质形成细胞清除进入细胞内的金黄色葡萄球菌,可能是皮肤天然免疫的一种防御机制,而PMA和FSK增强细胞的抗菌作用,提示角质形成细胞抗菌活性与NADPH氧化酶相关。     

分泌表达人IL-12基因重组卡介苗菌株的构建和筛选

目的 筛选获得分泌表达人白介素12(IL-12)的基因重组卡介苗菌株.方法 采用PCR反应从pORF-h IL-12载体中扩增得到人IL-12基因的完整序列,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌(E.coli-BCG)穿梭载体pMV361中,构建含人IL-12基因的重组质粒rpMV-IL-12.将纯化的rpMV-IL-12电穿孔转化卡介苗(BCG),通过卡那霉素抗性筛选、基因组PCR方法进行初步鉴定,再经热休克诱导表达后,分别收集培养上清液和细菌沉淀,进行SDS-PAGE分析,筛选得到IL-12基因重组BCG(rBCG-12).结果 成功构建含人IL-12基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒rpMV-IL-12,测序结果与GenBank收录序列一致,未发生突变.rpMV-IL-12电穿孔转化BCG,经卡那霉素抗性筛选及基因组DNA的IL-12目的 片段PCR扩增筛选得到rBCG-12重组菌.rBCG-12热休克诱导表达后的SDS-PAGE电泳,从培养上清液中检测到相对分子质量为70×103的蛋白质条带,而细菌沉淀中未见到特异性条带.结论 分泌表达人IL-12蛋白的重组BCG菌株构建、筛选成功.     

赖型钩端螺旋体017株外膜蛋白LipL32基因重组质粒的构建及其细胞毒性的研究

目的构建赖型钩端螺旋体(钩体)017株外膜蛋白LipL32基因的重组质粒,并研究其细胞毒性。方法从钩体017株全基因组中用PCR方法扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒,转化大肠杆菌,诱导表达LipL32蛋白,将表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,Western Blotting鉴定其免疫原性。将目的蛋白纯化、复性后作用于ECV304细胞,通过检测细胞的乳酸脱氢酶(LDH)、NO释放量研究其细胞毒性。结果扩增出816bp的LipL32基因,重组质粒经双酶切、PCR鉴定、测序均表明重组载体构建成功。经IPTG诱导表达的融合蛋白相对分子质量约52×103,主要以包涵体的形式表达,经免疫动物制备得到多克隆抗体,ELISA检测效价达1:32000,Western Blotting显示在目的蛋白位置处有特异性阳性条带。经过LipL32蛋白作用的ECV304细胞LDH、NO释放量和对照组比较有明显升高。结论成功构建LipL32基因重组质粒,该质粒能在大肠杆菌中表达,表达的目的蛋白对细胞有一定的毒性效应。     

赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究

目的:构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并在COS-7细胞中表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础.方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中PCR扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒pcDNA3.1-LipL32.脂质体转染法将重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Western blot检测目的基因的表达.结果:成功构建了LipL32基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中获得瞬时和稳定表达.结论:赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的应用提供了实验依据.     

用CM Sepharose FF柱分离人血红蛋白α、β链

目的:建立分离纯化血红蛋白α、β链方法。方法:对二氯汞苯甲酸(CPMB)处理的血红蛋白经CM Sepharose FF柱分离出结合有CPMB的α、β链,然后分别过Bio-gel p6柱除去α、β链上结合的CPMB。Tricine SDS-PAGE检测蛋白分子量、纯度,采用琼脂糖弥散法监测抑菌效应。结果:该法成功分离出具较高纯度的血红蛋白α、β链,二者均具有杀大肠杆菌活性。结论:本分离程序简单、经济,可得到高纯度的天然α、β链,有助于对其后续的进一步研究。